熒光分子擴(kuò)散動(dòng)態(tài)測(cè)量在肥大細(xì)胞脫顆粒體外檢測(cè)中的應(yīng)用*

孫一寧， 孫婭楠， 王羽儂， 張景海， 馬淑驊， 王 毅△

(1沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110016；2中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 北京 100700； 3北京中醫(yī)藥大學(xué)， 北京100029)

肥大細(xì)胞是免疫環(huán)節(jié)中介導(dǎo)過敏反應(yīng)最重要的效應(yīng)細(xì)胞，無論是過敏反應(yīng)還是類過敏反應(yīng)，其最終結(jié)果均導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)產(chǎn)生過敏癥狀。肥大細(xì)胞的脫顆粒過程是由一系列步驟組成的,它包括囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)、定向、錨定、融合等環(huán)節(jié)，每一個(gè)環(huán)節(jié)均受到嚴(yán)格調(diào)控，該過程可以分為脫顆粒早期和晚期2個(gè)時(shí)相，早期包括細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳遞，鈣離子水平的升高等階段，晚期事件主要指囊泡與細(xì)胞膜融合后，囊泡內(nèi)的活性物質(zhì)釋放出細(xì)胞外的過程[1-2]。

目前，實(shí)驗(yàn)室判定待測(cè)物是否為過敏性物質(zhì)的方法主要以大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞(rat basophilic leukemia cells)RBL-2H3為研究對(duì)象，以檢測(cè)晚期事件為主要指標(biāo)，如檢測(cè)肥大細(xì)胞釋放的活性物質(zhì)β-己糖苷酶(β-hexosaminidase,β-HEX)、類胰蛋白酶、組胺等[1-4]，或用掃描及透射電鏡[5-6]觀察脫顆粒后細(xì)胞表面形貌變化，判定有無致敏物質(zhì)的存在。由于技術(shù)方法的限制，對(duì)于脫顆粒早期事件與過敏性關(guān)系判定上還知之甚少。

以上傳統(tǒng)檢測(cè)方法都是時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)，細(xì)胞經(jīng)過各種化學(xué)固定及顯色處理，失去了活體狀態(tài)下脫顆粒的一系列生物信息，同時(shí)，很多有顏色的物質(zhì)會(huì)對(duì)比色的方法帶來干擾(如大多數(shù)中藥注射劑)，引起檢測(cè)誤差和假陽(yáng)性結(jié)果，而且步驟繁瑣復(fù)雜，花費(fèi)較高。

在我們以前的研究工作中，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞表面特異性分子CD63與綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)結(jié)合的CD63-GFP蛋白的RBL-2H3細(xì)胞株，對(duì)細(xì)胞內(nèi)囊泡進(jìn)行了可識(shí)別的熒光標(biāo)記[6-7]，從而使直接觀察脫顆粒過程成為可能。在本研究中，我們基于激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscopy, LSCM)成像的熒光關(guān)聯(lián)譜(fluorescence correlation spectrum, FCS)技術(shù)，采用光柵圖像關(guān)聯(lián)光譜法(raster image correlation spectroscopy, RICS)，將實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)到的肥大細(xì)胞掃描圖像進(jìn)一步分析計(jì)算，使圖像信息轉(zhuǎn)化為更直觀的、可直接進(jìn)行比較的擴(kuò)散系數(shù)，觀察熒光標(biāo)記囊泡在過敏性物質(zhì)刺激下的擴(kuò)散系數(shù)變化，建立了新的肥大細(xì)胞脫顆粒體外檢測(cè)方法，為藥物的離體過敏物質(zhì)早期快速檢測(cè)提供新的有效的方法。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、compound 48/80和β-HEX均購(gòu)于Sigma；CD63-GFP轉(zhuǎn)染的RBL-2H3細(xì)胞株為本室建立并常規(guī)傳代培養(yǎng)；玻璃底黑壁96孔板(In Vitro Scientific)；玻璃底35mm培養(yǎng)皿(Shengyou Biotechnology)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus)；掃描電子顯微鏡(日立，S3400N)；熒光分子擴(kuò)散測(cè)量軟件包(Diffusion Measurement Package,DMP)2.1 (Olympus)。

2 表達(dá)CD63-GFP的 RBL-2H3細(xì)胞的建立及培養(yǎng)

CD63-GFP質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染按本室原有方法進(jìn)行[7]。熒光標(biāo)記的RBL-2H3細(xì)胞按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)于含10%熱滅活胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

3 β-己糖苷酶測(cè)定[10]

將RBL-2H3細(xì)胞以1×105cells/well接種至96孔板中培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液，37 ℃孵育30 min后，加入陽(yáng)性藥物compound 48/80或陰性刺激，繼續(xù)37 ℃孵育。待刺激10 min后冰浴終止反應(yīng)。離心取50 μL上清液與底物β-己糖苷37 ℃行水解反應(yīng)1 h，之后加入檸檬酸鈉緩沖液終止反應(yīng)。離心收集反應(yīng)上清液，酶標(biāo)儀405 nm下檢測(cè)吸光度(Absorbance,A)。

4 掃描電鏡檢測(cè)

將RBL-2H3細(xì)胞接種至蓋玻片上培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液，37 ℃孵育30 min后，加入藥物刺激，繼續(xù)37 ℃孵育。待刺激10 min后冰浴終止反應(yīng)。去掉上清液后加入4%戊二醛預(yù)固定。之后經(jīng)鋨酸固定、脫水、真空噴鍍等步驟后于掃描電子顯微鏡下觀察。

5 RICS觀察肥大細(xì)胞脫顆粒過程

5.1RICS原理 RICS是分析群體中一定區(qū)域內(nèi)的分子運(yùn)動(dòng)行為的計(jì)算方法，適用于細(xì)胞體系熒光分子團(tuán)的檢測(cè)。該方法能夠在保持細(xì)胞活性的前提下，測(cè)量細(xì)胞內(nèi)熒光粒子的濃度和擴(kuò)散系數(shù)[8]。在RICS中，激光以從左至右、由上至下逐行掃描的順序測(cè)量視野內(nèi)各個(gè)位點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，從而得到一張圖像。其中每個(gè)位點(diǎn)都包含了樣品的部分信息，且位點(diǎn)的大小與激光束的焦距無關(guān)。當(dāng)熒光粒子被固定在某一點(diǎn)時(shí)，一段時(shí)間里在圖像范圍內(nèi)發(fā)光點(diǎn)的熒光強(qiáng)度往往被淹沒在背景噪聲之中，觀測(cè)不到粒子的變化。而當(dāng)一個(gè)熒光粒子在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)散到臨近的位點(diǎn)，在獲得的圖像上表現(xiàn)為一個(gè)位點(diǎn)上的熒光強(qiáng)度轉(zhuǎn)移到了另一個(gè)位點(diǎn)，2個(gè)位點(diǎn)間的熒光強(qiáng)度變化有一定的相關(guān)性，在自相關(guān)計(jì)算中能夠顯示出來。當(dāng)體系中存在大量具有相同位置變化行為的熒光粒子的時(shí)候，這種空間相關(guān)性得到強(qiáng)化并可以進(jìn)行測(cè)量，獲得熒光粒子的濃度和擴(kuò)散系數(shù)信息，并進(jìn)一步從擴(kuò)散系數(shù)獲得粒子周邊環(huán)境和粒子體積和結(jié)構(gòu)信息[9]。

RICS圖像分析分為兩步：背景減除和影像自相關(guān)計(jì)算。背景減除主要是去掉圖像中靜止的或移動(dòng)緩慢的部分。由于細(xì)胞在拍攝中不會(huì)保持靜止?fàn)顟B(tài)，則采取特殊的平均背景消除法[8]；背景減除之后，每張圖片都由公式(1)進(jìn)行自相關(guān)計(jì)算。每張圖片自相關(guān)計(jì)算得到的數(shù)值取平均數(shù)后可套用在與擴(kuò)散系數(shù)和粒子濃度呈比例關(guān)系的公式(2)中進(jìn)行擬合分析計(jì)算。

(1)

(2)

I(x,y)代表每個(gè)位點(diǎn)上的熒光強(qiáng)度，ξ和Ψ分別代表x和y的變化量，〈…〉代表平均值。D指擴(kuò)散系數(shù)，N指體系中的熒光粒子數(shù)，τ指時(shí)間。

以圖1為例，配制濃度為0.5 mol/L的FITC溶液，取200 μL于黑壁玻璃底96孔板。采用光子計(jì)數(shù)模式，掃描速度為12.5 μs/pixel，每張圖片大小為256×256，連續(xù)拍攝100張圖片，獲得的圖像經(jīng)背景減除、自相關(guān)計(jì)算后，獲得空間自相關(guān)函數(shù)圖像。

圖1A為RICS圖像掃描的第一張,為熒光強(qiáng)度的偽彩圖。圖1B 為背景減除后經(jīng)空間自相關(guān)計(jì)算所得圖像相關(guān)圖，其中的橫軸和縱軸分別代表水平相關(guān)位移ξ和垂直相關(guān)位移ψ。圖1C整個(gè)圖像為擬合分析結(jié)果的三維圖像，高斯峰的振幅代表擬合方程結(jié)果的大小，而高斯峰的厚度越薄，說明分子運(yùn)動(dòng)的速度越快。

Figure 1. Typical results for RICS calibration measurement of 0.02 g/L FITC in solution.A: raw data, the first image in the stack of images to be analyzed as displayed in RICS. The image is shown in false color, where color corresponds to intensity. Each image is 256 pixels by 256 pixels (12.8 μm by 12.8 μm). B: image correlation, the correlation peak is extended in the horizontal direction because the image is raster scanned in the horizontal direction. The horizontal axis is the horizontal correlation shift, ξ. The vertical axis is the vertical correlation shift, ψ. The color corresponds to the magnitude of the function.C: successful data fitting will result in low values for the difference between the autocorrelation and the fit. The height of the plot corresponds to the magnitude of the function. The horizontal axis is the horizontal correlation shift,ξ. The vertical axis is the vertical correlation shift, ψ. The correlation fit is the same size as the original correlation function, 64 pixels by 64 pixels.

從擬合分析的結(jié)果中我們可以得到幾個(gè)參數(shù)的數(shù)值：G(0)=(3.71±0.22)×10-5，D=(531.18±5.27) μm2/s，N=2 700.71±16.41。G(0)為公式(2)擬合分析后所得計(jì)算值，為圖像視野中分子數(shù)N的倒數(shù)；D為熒光分子的擴(kuò)散系數(shù)，因此從該結(jié)果可以得出(2 700.71±16.41)個(gè)FITC分子以(531.18±5.27) μm2/s的擴(kuò)散速度在溶液中做布朗運(yùn)動(dòng)。通過熒光分子動(dòng)態(tài)測(cè)量得到G、D、N等參數(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)視野中熒光分子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)變化的定性監(jiān)測(cè)。

5.2RICS方法的應(yīng)用 檢測(cè)時(shí)將特異表達(dá)熒光囊泡(CD63-GFP)的RBL-2H3細(xì)胞株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待CD63-GFP穩(wěn)定表達(dá)后，在LSCM專用玻璃底小皿中培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液后換成1 mL臺(tái)氏液，在60倍水鏡下找到表達(dá)CD63-RBL的貼壁細(xì)胞，將視野放大至得到單個(gè)細(xì)胞的囊泡圖像，采用光子計(jì)數(shù)模式，掃描速度為12.5 μs/pixel，每張圖片大小為256×256。每組向小皿中加入10 μL不同濃度的compand 48/80。 加藥后每10 min自動(dòng)掃描1次，每次連續(xù)掃描100張，共掃描至第20 min。并使用DMP軟件分析每組圖像得到擴(kuò)散系數(shù)D等信息。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組比較采用單因素方差分析，使用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 比色法觀察compound 48/80刺激 RBL-2H3細(xì)胞釋放β-HEX的檢測(cè)

β-HEX存在于肥大細(xì)胞溶酶體中，是脫顆粒時(shí)所釋放的酶中最重要的酶，它通常伴隨組胺釋放，其釋放量與肥大細(xì)胞脫顆粒程度呈正相關(guān)，常作為肥大細(xì)胞脫顆粒的標(biāo)志性檢測(cè)指標(biāo)。如圖2所示，與對(duì)照組相比，compound 48/80 的3.9×10-2mg/L～2.5 mg/L劑量組均未引起β-HEX 的升高，隨著給藥濃度的升高，5 mg/L及10 mg/L劑量組可以引起β-HEX的釋放，與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.01)。因此，比色法檢測(cè)compound 48/80刺激β-HEX的釋放靈敏度為≥5 mg/L。

Figure 2. The release of β-HEX in RBL-2H3 cells stimulated with compound 48/80 at different concentrations.Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs control.

2 掃描電鏡法觀察不同濃度compound 48/80刺激下RBL-2H3細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

如圖3所示，掃描電鏡下，正常狀態(tài)下的細(xì)胞伸展?fàn)顟B(tài)良好，表面皺褶飽滿，胞體可見完整板狀、斧狀偽足，隨著刺激劑的加入，細(xì)胞的形態(tài)開始改變，偽足收縮，皺褶減少，細(xì)胞表面逐漸變得光滑，并隨濃度的增高而越來越明顯，compound 48/80最低劑量組(3.9×10-2mg/L)細(xì)胞表面即可見一些較大泡狀結(jié)構(gòu)，有致敏的傾向，但細(xì)胞總體形態(tài)變化不大，皺褶與偽足均較完整，從病理角度來講，該狀態(tài)就為過敏反應(yīng)臨界點(diǎn)，但從7.8×10-2mg/L劑量組開始，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，說明從該劑量開始細(xì)胞已經(jīng)開始出現(xiàn)過敏反應(yīng)，開始脫顆粒。因此，掃描電鏡法檢測(cè)compound 48/80致RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒靈敏度為≥3.9×10-2mg/L。

3 RICS法觀察不同濃度compound 48/80刺激下RBL-2H3細(xì)胞囊泡表面CD63-GFP擴(kuò)散系數(shù)變化

在肥大細(xì)胞脫顆粒過程中，囊泡表面CD63分子與膜內(nèi)NPC2蛋白結(jié)合[12]，傳遞脫顆粒信號(hào)，進(jìn)而囊泡不斷向細(xì)胞膜移動(dòng)，并最終與細(xì)胞膜融合，細(xì)胞脫顆粒，釋放囊泡內(nèi)活性物質(zhì)，引起過敏反應(yīng)。在此過程中，由于囊泡表面CD63分子的結(jié)合狀態(tài)發(fā)生了改變，因此，必然引起該分子擴(kuò)散系數(shù)的變化。由于在該細(xì)胞株中，CD63被GFP標(biāo)記，因此該分子具有可識(shí)別的標(biāo)識(shí)，可直接觀察。

圖4是各組細(xì)胞熒光圖像，顯得雜亂無章，不能從其中總結(jié)出脫顆粒相關(guān)規(guī)律。

Figure 3. The morphological changes of RBL-2H3 cells stimulated with compound 48/80 at different concentrations observed under scanning electron microscope (×5 000).

Figure 4. RICS measurement of degranulation of CD63-GFP-transfected RBL-2H3 cells treated with compound 48/80 at different concentrations(0～10 mg/L).Raw data of CD63-GFP-transfected RBL-2H3 cells are the first image in the stack of images to be analyzed as displayed in RICS. The image is shown in false color, where color corresponds to intensity. Each image is 256 pixels by 256 pixels (12.8 μm by 12.8 μm).

經(jīng)RICS分析后，從表1中可以看出，所有給藥組(≥3.9×10-2mg/L)的擴(kuò)散系數(shù)(D值)均在(3.1～3.5)×10-1μm2/s之間，與對(duì)照組[(4.02±0.10) μm2/s]相比均明顯降低(P<0.01)，熒光分子數(shù)N也顯著降低(P<0.01)。該結(jié)果與細(xì)胞脫顆粒的生理過程十分吻合。脫顆粒之初，CD63分子與NPC2蛋白結(jié)合，傳遞脫顆粒信號(hào)，分子被固定，因此D值減??；由于囊泡迅速向細(xì)胞膜方向移動(dòng)，與細(xì)胞膜結(jié)合，并將胞內(nèi)活性物質(zhì)胞吐出細(xì)胞外，因此N值也減小。但這種減少并不是無限減少，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的CD63分子只存在2種狀態(tài)，一種游離，一種結(jié)合，擴(kuò)散系數(shù)只與這2種狀態(tài)有關(guān)，胞內(nèi)CD63分子與其受體結(jié)合到達(dá)閾值后，就不會(huì)再繼續(xù)，故我們看到給藥濃度升高到1.6×10-1mg/L后，D值略有升高，并維持在(3.1～3.5)×10-1μm2/s。綜上所述，RICS法檢測(cè)compound 48/80致RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒的靈敏度為≥3.9×10-2mg/L，與掃描電鏡方法相當(dāng)。

討 論

FCS是一種利用熒光強(qiáng)度隨時(shí)間漲落進(jìn)行分析的熒光光譜技術(shù)，早在70年代產(chǎn)生[13]，并逐步發(fā)展成為一種離體測(cè)量熒光分子流動(dòng)性和分子間相互作用的有利工具[14-15]，其優(yōu)點(diǎn)在于在極小的體積里，利用了物理參數(shù)反映分子熒光的細(xì)微瞬時(shí)漲落[16-18]。其檢測(cè)優(yōu)勢(shì)不僅在于所需細(xì)胞數(shù)量少、允許實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并且可以獲得2個(gè)重要的生化物理參數(shù)：空間的平均粒子數(shù)和通過測(cè)量體積的分子的平移擴(kuò)散系數(shù)[19-24]。但由于該方法的信號(hào)采集必須基于雪崩光電二極管，價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，限制了該技術(shù)在復(fù)雜生命科學(xué)體系里的推廣和應(yīng)用。

表1 不同濃度compound 48/80刺激后RBL-2H3細(xì)胞熒光圖像經(jīng)RICS分析后的輸出參數(shù)

目前測(cè)量擴(kuò)散系數(shù)的方法主要以下幾種。擴(kuò)散核磁共振光譜可以測(cè)量在溶液中和活體組織中分子的擴(kuò)散系數(shù)[25]，所得結(jié)果準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，但這種方法無法應(yīng)用到細(xì)胞層面。而在細(xì)胞水平上，圖像關(guān)聯(lián)能譜法(image correlation spectroscopy, ICS)的出現(xiàn)拓展FCS所能應(yīng)用的擴(kuò)散時(shí)間到秒至分鐘級(jí)別，同時(shí)也可以提供熒光粒子運(yùn)動(dòng)的空間信息。因此，F(xiàn)CS主要應(yīng)用于高時(shí)間分辨率的分子水平上的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)分析，ICS主要應(yīng)用于低時(shí)間分辨率的膜上蛋白質(zhì)分析。而RICS的出現(xiàn)填補(bǔ)了兩者之間的時(shí)間分辨率的空白[26]。RICS可以在實(shí)時(shí)觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)的同時(shí)，通過對(duì)圖片的分析計(jì)算得到細(xì)胞上特異性熒光蛋白的擴(kuò)散系數(shù)和分子數(shù)。并且RICS在普通激光共聚焦設(shè)備上即可進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便，易于推廣。

在過敏反應(yīng)的過程中，肥大細(xì)胞脫顆粒[1]是其中重要的環(huán)節(jié)之一，它是引起Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)和類過敏反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞。因此，肥大細(xì)胞脫顆粒的檢測(cè)是離體判定致敏性物質(zhì)的主要方法。鼠嗜堿性粒細(xì)胞RBL-2H3細(xì)胞株是用于離體篩選過敏性物質(zhì)的工具細(xì)胞，在過敏原存在的條件下，細(xì)胞內(nèi)的囊泡向細(xì)胞膜運(yùn)動(dòng)，與細(xì)胞膜融合后，將囊泡內(nèi)的活性物質(zhì)，如組胺、β-已糖苷酶等分泌至細(xì)胞外，引起過敏反應(yīng)。CD63是肥大細(xì)胞、RBL細(xì)胞的分泌囊泡膜表面標(biāo)志，又被稱為溶酶體相關(guān)膜蛋白3，是包含1個(gè)溶酶體靶向域的跨膜4次的膜蛋白[10]。在受到致敏物質(zhì)刺激時(shí)，CD63分子可與囊泡上的NPC2蛋白結(jié)合[11]，并參與其糖基化的過程，引起細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)。而compound 48/80是N-甲氧苯胺和甲醛的縮合物，是肥大細(xì)胞脫顆粒劑，能刺激肥大細(xì)胞產(chǎn)生胞吐作用，釋放組胺、類胰蛋白和少量肝素蛋白多糖等多種活性物質(zhì)，常用來作為實(shí)驗(yàn)性過敏反應(yīng)的誘導(dǎo)劑[7]。本文中的陽(yáng)性刺激藥物均選用compound 48/80，文中提到的靈敏度則用compound 48/80濃度表示。

本研究可以看出，與β-己糖苷酶法(5 mg/L)相比，RICS檢測(cè)法(3.9×10-2mg/L)和掃描電鏡法(3.9×10-2mg/L)靈敏度高很多。但RICS方法較掃描電鏡法簡(jiǎn)便易行，成本低，易操作，且所觀察的指標(biāo)為掃描電鏡所不能做到的活體動(dòng)態(tài)觀測(cè)，能在細(xì)胞脫顆粒早期即可判定過敏反應(yīng)的發(fā)生，因此其具有傳統(tǒng)方法不具備的優(yōu)勢(shì)。圖4的結(jié)果表明，單純用熒光強(qiáng)度成像不能獲得肥大細(xì)胞脫顆粒的任何信息，得到的圖像模糊不清，毫無規(guī)律可言，但經(jīng)RICS方法計(jì)算后，可以動(dòng)態(tài)地觀察到活體細(xì)胞內(nèi)囊泡表面CD63分子在刺激物的作用下擴(kuò)散系數(shù)的變化。該方法從原來精密、復(fù)雜、對(duì)操作人員要求較高，經(jīng)商品化改進(jìn)后，變得簡(jiǎn)單易行，適合于推廣應(yīng)用，因此，有潛力成為制藥企業(yè)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)方法，或臨床過敏性物質(zhì)篩查的有利工具。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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