梓醇促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖過(guò)程中Wnt信號(hào)通路的變化*

傅淑平， 楊 麗， 洪 浩， 偶 晨， 張榮華△

(1南京中醫(yī)藥大學(xué)針?biāo)幗Y(jié)合省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023;2暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室, 廣東 廣州 510632)

梓醇(catalpol)是從玄參科植物地黃中分離出來(lái)的單一有效化學(xué)成份之一，也是中國(guó)藥典指定的地黃定性指標(biāo)，屬于環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物[1]。我們的前期研究顯示，0.05～10 mg/L梓醇培養(yǎng)液對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的增殖均有促進(jìn)作用，其中1.0 mg/L梓醇培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞的增殖作用最強(qiáng)，但其具體作用機(jī)制并不明確[2]。近期研究表明，Wnt信號(hào)通路在BMSCs自我更新過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[3], 但其是否與梓醇的促干細(xì)胞增殖作用有關(guān)，尚不清楚。本研究主要在前期工作基礎(chǔ)上，檢測(cè)梓醇對(duì)BMSCs細(xì)胞周期的影響，同時(shí)觀(guān)察Wnt信號(hào)通路中相關(guān)因子在此過(guò)程中的變化情況，探討梓醇促BMSCs增殖的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

清潔級(jí)(SPF)3月齡SD雌性大鼠(體重約200 g)，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)為0004482)。

2 藥物

梓醇標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買(mǎi)于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，純度經(jīng)HPLC檢測(cè)均大于98%，稱(chēng)取梓醇1 mg，溶解于10 mL低糖DMEM完全培養(yǎng)液中，0.22μm過(guò)濾分裝，配制成為100 mg/L母液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Figure 1. The chemical structure of catalpol.

3 主要試劑

低糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco)，胰酶(Amresco)，EDTA和RNase A (Sigma)，碘化丙啶和Trizol (Invitrogen)，RT-PCR Kit(TaKaRa)，β-catenin抗體(Cell Signaling Technology)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce)。

4 方法

4.1梓醇對(duì)BMSCs細(xì)胞周期的影響 取生長(zhǎng)良好的第3代BMSCs以5×107cells/L密度接種在培養(yǎng)瓶中，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組與梓醇處理組，待細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)液，換成無(wú)血清培養(yǎng)基，24 h細(xì)胞周期同步化后，各組分別加入DMEM培養(yǎng)液及1.0 mg / L梓醇培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，6 d后，待細(xì)胞匯合至90%左右，消化細(xì)胞，PBS洗2次，1 200 r/min離心4 min，制成單細(xì)胞懸液，移入離心管。加入預(yù)冷的70%無(wú)水乙醇2 mL快速混勻，固定細(xì)胞24 h，去除乙醇，用0.1 mol/L PBS洗滌2次，每次加洗液2.5 mL左右，1 200 r/min離心4 min，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109cells/L。加200 μL RNaseA (1 g/L)，37 ℃水浴30 min，立即放入冰浴中，再加PI染色液(50 mg/L)，避光反應(yīng)30 min，F(xiàn)ACScan流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞周期。以增殖指數(shù)(proliferation index，PI)表示細(xì)胞增殖活性，PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

4.2梓醇對(duì)Wnt3a、Wnt5a及Wnt11 mRNA表達(dá)的影響 取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，以1×108cells/L密度接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞周期同步化后，按2.1所述進(jìn)行分組并培養(yǎng)6 d，細(xì)胞匯合至90%以上時(shí)，消化各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，采用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11、β-catenin及GAPDH表達(dá)情況，引物序列見(jiàn)表1。參照大連寶生物有限公司的TaKaRa SYBRR ExScriptTMRT-PCR Kit說(shuō)明書(shū)合成第1鏈cDNA，反應(yīng)體系10 μL(冰上操作)，上述反應(yīng)液混勻后于PCR擴(kuò)增儀上42 ℃反應(yīng)15 min，95 ℃反應(yīng)2 min。隨后取2 μL cDNA樣本按照10倍梯度稀釋成4～6個(gè)濃度梯度的cDNA，并以此構(gòu)建目的基因及看家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。利用梯度樣本cDNA的Ct值作為橫坐標(biāo)，樣本的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)作為縱坐標(biāo)，分別建立目的基因和看家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并設(shè)置2～4個(gè)不加模板cDNA(以滅菌蒸餾水代替)的PCR管作為空白對(duì)照管。在相同條件下檢測(cè)樣本目的基因和看家基因的Ct值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算該樣本的目的基因和看家基因的起始拷貝數(shù)。反應(yīng)結(jié)束后，由電腦自動(dòng)生成熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以及熔解曲線(xiàn)。使用最大二階倒數(shù)法進(jìn)行分析。

表1 引物序列

4.3梓醇對(duì)β-catenin mRNA 及蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)分組及培養(yǎng)方法同2.1，細(xì)胞培養(yǎng)6 d后，消化各組細(xì)胞，根據(jù)Trizol試劑使用說(shuō)明同時(shí)提取細(xì)胞總RNA及總蛋白，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)情況。其中β-catenin mRNA表達(dá)情況按2.2所述方法進(jìn)行檢測(cè)，引物序列見(jiàn)表1。β-catenin蛋白表達(dá)利用Western blotting技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，GAPDH蛋白作為內(nèi)參對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化。具體操作如下：取20 μg總蛋白變性后，進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳，30 mA，2 h；隨后將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，250 mA，2 h；將膜取出放入含5%脫脂奶粉的TBS/T封閉液中封閉1 h，然后分別放入Ⅰ抗β-catenin(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)中孵育，4 ℃過(guò)夜；經(jīng)TBS/T清洗后，再加入Ⅱ抗常溫反應(yīng)2 h，隨后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，利用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)目的條帶，并用ImageJ圖像分析軟件對(duì)各組條帶進(jìn)行分析。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 18.0軟件處理，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 梓醇對(duì)BMSCs細(xì)胞周期的影響

從圖2及表2可知，空白對(duì)照組BMSCs有(8.90±0.46)%的細(xì)胞處于S和G2/M期，經(jīng)藥物干預(yù)后，梓醇處理組有(17.93±1.68)%的細(xì)胞處于S和G2/M期，梓醇處理組PI值高于空白對(duì)照組(P<0.01)。

Figure 2. The effect of catalpol on cell cycle of BMSCs. A: control group; B: catalpol group.

表2 各實(shí)驗(yàn)組BMSCs增殖指數(shù)

2 梓醇對(duì)Wnt3a、Wnt5a及Wnt11 mRNA表達(dá)的影響

如圖3所示，不同Wnt蛋白在BMSCs的mRNA表達(dá)水平不盡相同，Wnt3a表達(dá)水平較低，而Wnt5a表達(dá)水平明顯高于Wnt3a與Wnt11。與空白對(duì)照組相比較，梓醇干預(yù)后，Wnt5a mRNA表達(dá)水平提高了11.73倍,Wnt11 mRNA表達(dá)水平提高了7.18倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);但Wnt3a mRNA表達(dá)水平并無(wú)明顯改變。

3 梓醇對(duì)β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比較，梓醇干預(yù)后，β-catenin/GAPDH mRNA相對(duì)表達(dá)量由0.79增加到1.04，其表達(dá)水平提高了1.3倍, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4A。除此之外，Western blotting結(jié)果顯示，梓醇可明顯提高BMSCs內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4B。

Figure 3. The effect of catalpol on the mRNA expression of Wnt3a, Wnt5a and Wnt11 in BMSCs.Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs control group.

Figure 4. The effect of catalpol on the mRNA (A) and protein (B) expression of β-catenin.Mean±SD.n=6. **P<0.01 vs control.

討 論

細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖的關(guān)系非常密切，通常情況下大部分的BMSCs處于靜息期，但是一旦進(jìn)入了細(xì)胞周期，G1和G2期明顯縮短，細(xì)胞在體外就會(huì)出現(xiàn)高速率的擴(kuò)增；且細(xì)胞進(jìn)入不同的細(xì)胞周期階段時(shí)，細(xì)胞中DNA會(huì)隨著細(xì)胞周期的各期而發(fā)生變化，因此當(dāng)細(xì)胞受到某些因素刺激，可使DNA 含量發(fā)生變化，從而引起細(xì)胞周期發(fā)生改變[4]。細(xì)胞增殖指數(shù)則是指S期與G2/M期DNA含量之和與S期、G2/M及G0/G1期DNA含量之和的比，它是反映細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)之一。本研究在前期證實(shí)梓醇對(duì)BMSCs增殖有促進(jìn)作用后，進(jìn)一步觀(guān)察其對(duì)細(xì)胞周期的影響，結(jié)果表明BMSCs在未作處理時(shí)，大部分細(xì)胞處于相對(duì)不活躍的靜止期即G0/G1期，PI值約為8.90%，與文獻(xiàn)報(bào)道BMSCs的PI值在10%左右相一致[5]；而經(jīng)過(guò)梓醇干預(yù)后，所培養(yǎng)的BMSCs S期與G2/M期DNA含量增加到17.93%，提示梓醇可通過(guò)促進(jìn)大鼠BMSCs進(jìn)入細(xì)胞周期，增加其增殖指數(shù)，從而達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。

Wnts是一種富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，Wnt信號(hào)通路參與多種細(xì)胞過(guò)程的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、功能及死亡；Wnt信號(hào)通路可分為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路又稱(chēng)為Wnt/β-catenin信號(hào)通路，主要是激活核內(nèi)靶基因的表達(dá)；當(dāng)無(wú)Wnt信號(hào)時(shí)，胞內(nèi)游離的β-catenin與APC、Axin、GSK-3β結(jié)合，形成“降解復(fù)合物”，GSK-3β使β-catenin磷酸化，被SCF復(fù)合物識(shí)別，分解其多肽鏈，從而水解，無(wú)法進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮作用；而當(dāng)有Wnt信號(hào)如Wnt3a、Wnt1、Wnt8、Wnt10b等存在情況下，Wnt蛋白與其受體Frizzled及LRP6結(jié)合，并激活其下游瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制β-catenin降解，使β-catenin在胞內(nèi)穩(wěn)定的積累，并促使其進(jìn)入核內(nèi)激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。一些不產(chǎn)生β-catenin積累信號(hào)的Wnt，包括Wnt5a、Wnt11在內(nèi)的多種Wnt蛋白則通過(guò)其它方式轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，稱(chēng)為非經(jīng)典Wnt信號(hào)[6-8]。研究表明，Wnt信號(hào)通路可以促進(jìn)某些細(xì)胞如造血干細(xì)胞[9]、神經(jīng)干細(xì)胞[10]、腫瘤細(xì)胞等[11]的自我更新和增殖。從多孔鈣支架中釋放出來(lái)的Wnt3a可以使移植的hMSCs獲得有絲分裂原的刺激，增加β-catenin穩(wěn)定性，對(duì)MSCs增殖與存活具有促進(jìn)作用[12]。在未分化的MSCs擴(kuò)增期間，予以Wnt3a干預(yù)，可以出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目增加，細(xì)胞增殖加速及細(xì)胞凋亡下降的結(jié)果[13]。通過(guò)抑制GSK-3β活性，增加β-catenin在胞內(nèi)的積累，可有效抑制細(xì)胞凋亡[14]。另有研究表明，除了Wnt3a、Wnt1介導(dǎo)的經(jīng)典Wnt信號(hào)可能增加β-catenin在胞內(nèi)的蓄積、促進(jìn)細(xì)胞增殖與存活外，Wnt5a所介導(dǎo)的非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路亦可抑制未分化雙能C2C12細(xì)胞、成骨細(xì)胞前體細(xì)胞及骨髓來(lái)源的OB-6成骨細(xì)胞因血清饑餓所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時(shí)還可以促進(jìn)這些細(xì)胞的增殖、募集和分化，以增加細(xì)胞的存活時(shí)間[15]。由此我們也可以看出，Wnt信號(hào)的經(jīng)典與非經(jīng)典通路均參與了MSCs的增殖過(guò)程。為探討梓醇促BMSCs增殖作用與Wnt信號(hào)通路的活化是否存在相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)運(yùn)用real-time PCR和Western blotting技術(shù)分別檢測(cè)了各實(shí)驗(yàn)組中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11、β-catenin mRNA表達(dá)及β-catenin蛋白含量變化情況，結(jié)果顯示：經(jīng)梓醇干預(yù)后，BMSCs中Wnt5a、Wnt11及β-catenin mRNA表達(dá)均明顯升高，Wnt3a表達(dá)量無(wú)變化；但β-catenin蛋白合成明顯高于空白組，說(shuō)明梓醇雖然沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)Wnt3a mRNA表達(dá)的增強(qiáng)作用，但其明顯增加了β-catenin mRNA的表達(dá)量和β-catenin蛋白合成量，說(shuō)明梓醇可能通過(guò)調(diào)節(jié)其它Wnt蛋白，比如Wnt1、Wnt7a等，促進(jìn)胞內(nèi)β-catenin的累積，激活經(jīng)典Wnt信號(hào)，從而促進(jìn)BMSCs增殖；另外，細(xì)胞內(nèi)Wnt5a和Wnt11 mRNA表達(dá)在梓醇干預(yù)下亦明顯上升，而且其提高的幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于β-catenin mRNA，提示非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的活化也可能參與了梓醇促BMSCs增殖的過(guò)程。

綜上所述，我們認(rèn)為梓醇可能通過(guò)Wnt3a以外的Wnt蛋白激活的經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和由Wnt5a、Wnt11激活的非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路促使BMSCs進(jìn)入細(xì)胞周期，達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。但具體哪一種Wnt蛋白是梓醇促BMSCs增殖過(guò)程中Wnt經(jīng)典信號(hào)通路激活的啟動(dòng)點(diǎn)？Wnt5a和Wnt11激活了哪一條非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路？經(jīng)典與非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在這一過(guò)程中的具體地位孰輕孰重？尚有待于更為深入的研究。

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