金屬基質(zhì)蛋白酶在月經(jīng)發(fā)生中的作用

徐祥波 ，劉書言，王乾興 ，陳西華 ，張樹成 ，賀 斌，王介東

(1.國家人口計生委科學技術(shù)研究所，北京 100081；2.廣西醫(yī)科大學，廣西 南寧 530021； 3.遵義醫(yī)學院，貴州 遵義 563099)

月經(jīng)是靈長類月經(jīng)動物所特有的生理現(xiàn)象。金屬基質(zhì)蛋白酶是月經(jīng)發(fā)生中子宮內(nèi)膜崩解的最終作用因子，因其在月經(jīng)發(fā)生中的重要作用，本綜述對金屬基質(zhì)蛋白酶基礎結(jié)構(gòu)、生化特征、調(diào)節(jié)機制以及在月經(jīng)發(fā)生中相關(guān)的研究進展進行闡述。

1 金屬基質(zhì)蛋白酶結(jié)構(gòu)與種類

金屬蛋白酶其金屬活性中心是Zn2+。1962年被首次發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)今有200多個金屬蛋白酶，根據(jù)其三維結(jié)構(gòu)與進化包括40多個家族成員。MMP基因家族一般包括：前結(jié)構(gòu)域，催化結(jié)構(gòu)域，鉸鏈區(qū)和血紅素蛋白結(jié)構(gòu)域。區(qū)別于其他的蛋白酶家族成員，MMP家族有三個分子特征：①與MMP1序列具有同源性；②在前結(jié)構(gòu)域中具有半胱氨酸基序，PRCGXPD，此基序通過保守的半胱氨酸敖合鋅離子活性位點使MMP以酶原的形式存在[1]。但是MMP23基因序列中并不存在此基序。③鋅離子結(jié)合基序位于催化結(jié)構(gòu)域的保守序列HEXGHXXGXXH中的3個組氨酸所結(jié)合，見圖1[2]。

圖1 MMP結(jié)構(gòu)示意圖

目前至少存在26個水解酶，包括四類：①膠原酶包括MMP1，MMP8和 MMP13，MMP18(非洲蟾蜍)，它們能夠在膠原I，膠原II，膠原III距離N末端的3/4處特異的位點來剪切，釋放出1/4和3/4長度的片段，也能夠剪切其他的胞外基質(zhì)和非胞外基質(zhì)分子。②明膠酶包括MMP2(明膠酶A)和 MMP9(明膠酶B)，它們能夠降解變性的膠原即明膠和基底膜膠原IV，V。在催化結(jié)構(gòu)域存在3個纖維結(jié)合素的重復序列，此重復序列能夠結(jié)合明膠，膠原和核纖層蛋白[3]。③間充質(zhì)溶解素包括MMP3(間充質(zhì)溶解素-1)和 MMP10 (間充質(zhì)溶解素-2)，MMP3與MMP10有相似的底物，能夠降解多糖，糖蛋白，纖維結(jié)合蛋白，核纖層蛋白，并且能夠剪切基底膜膠原IV和膠原V，但是前者比后者有較高的蛋白水解效率[4]。 ④ 基質(zhì)溶解因子為MMP7(基質(zhì)溶解因子-1)和MMP26(基質(zhì)溶解因子跨膜型酶(MT-MMP)。基質(zhì)溶解因子缺少血紅素蛋白結(jié)構(gòu)域。⑤膜型MMP(MT-MMP)包括MT1-，MT2-，MT3-和MT4-MMP。MMP14、15、16和24 糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨定的MT5-和MT6-MMP (MMP17 和 25) MMP14能夠消化膠原I，膠原II，膠原III和其他的胞外基質(zhì)成分，并且能夠?qū)⒚冈问睫D(zhuǎn)化為有活性酶的形式。⑥其它的MMP家族成員包括MMP11、12、 19、20、 22、23 和 28。MMP11 (間充質(zhì)溶解素-3) 與 MMP3 (間充質(zhì)溶解素-1)序列和作用的底物均不相同。MMP12(金屬彈性蛋白酶)能夠消化彈力蛋白和其他的蛋白。MMP20能夠消化釉基質(zhì)。MMP22首先從雞成纖維細胞中克隆出來。MMP23缺少半胱氨酸基序和血紅素蛋白結(jié)構(gòu)域。MMP28是于2001年最晚發(fā)現(xiàn)的成員[5]。在子宮內(nèi)膜中存在的MMP家族成員包括MMP1-3、MMP7、MMP9、MMP11、MMP13和MMP14。

2 MMP家族成員的剪切與活化

MMP酶原的激活需要血紅素蛋白結(jié)構(gòu)域的解離并需要其他的MMP家族成員或者其他的蛋白酶的共同作用。MMP3能夠自身將酶原形式轉(zhuǎn)化為活性酶，MMP3能夠激活許多MMP家族成員的酶原，例如將MMP1和MMP9的酶原形式轉(zhuǎn)化為活性酶MMP1和MMP9[6]，但是MMP2需要由MT-MMP來激活[7]。MT1-MMP介導MMP2酶原的激活需要TIMP2的作用下完成[8]。MMP7能夠激活MMP-1的酶原變?yōu)槠浠钚誀顟B(tài)[9]。

3 MMP家族成員的調(diào)節(jié)

MMP-1在降解胞外基質(zhì)中具有關(guān)鍵性作用，因此對其蛋白的精確調(diào)控是必要的，主要通過在轉(zhuǎn)錄水平和mRNA穩(wěn)定性兩方面的調(diào)控來實現(xiàn)。MMP1的編碼區(qū)包括激活蛋白1和核因子κB (NFκB)反應元件[11]，致使孕酮和炎性因子(如IL-1和TNFα)都能影響MMP1的表達。

MMP1和MMP3具有與MMP2不同的啟動子區(qū)[12]。NFκB 對于MMP1、MMP3和MMP9具有重要的調(diào)控作用，它和其它的轉(zhuǎn)錄因子共同作用能促進多種促炎癥反應基因的表達，例如iNOS、TNFα、IL-1β、toll樣受體-4和COX-2基因等[13-14]。孕酮能通過以下方式調(diào)控NFκB的表達：促進κBα抑制劑的表達，此蛋白結(jié)合NFκB使其留在核外而不發(fā)揮作用[15]；PR可與NFκB競爭性結(jié)合在基因啟動子區(qū)[16]，促進TGFβ-1和孕酮協(xié)同抑制作用[17]。

中性粒細胞侵入到子宮內(nèi)膜中是月經(jīng)發(fā)生過程中一個重要的現(xiàn)象，其最終效應是促進子宮內(nèi)膜的崩解和重建。中性粒細胞是MMP-8 (中性粒細胞膠原酶)和MMP-9 (明膠酶B)的主要來源，它擁有較高的更新率和1011細胞/天的生產(chǎn)力，因此目前認為，遠遠超過TIMPs的MMPs活性對于月經(jīng)的發(fā)生是必需的[19]。

4 金屬基質(zhì)蛋白酶在月經(jīng)中的作用

4.1 子宮內(nèi)膜基質(zhì)組成 子宮內(nèi)膜的胞外基質(zhì)能夠行使兩種功能：①它充當了組織的結(jié)構(gòu)骨架。激素控制子宮內(nèi)膜胞外基質(zhì)的組成和生化機制的變化在成體的生理狀態(tài)下是最迅速的。②它充當了信號的傳遞者。胞外基質(zhì)通過整合素和其他受體與子宮內(nèi)膜中的細胞之間相互作用，來介導細胞的黏附、生存、生長、遷移和分化等。在月經(jīng)周期中，胞外基質(zhì)的變化即胞外基質(zhì)的崩解和重建是靈長類具有月經(jīng)周期動物子宮內(nèi)膜的一個顯著特征。是胞外基質(zhì)成分的生命周期包括基因的表達和調(diào)控，多肽的生物合成，亞基的結(jié)合，后翻譯修飾，分泌，進一步的胞外修飾(特別是原膠原轉(zhuǎn)化為成熟膠原)，組裝成胞外基質(zhì)，局部細胞功能的重建，隨之而來的是被蛋白水解酶，胞吞作用以及溶酶體的多方面作用使其最后崩解。

胞外基質(zhì)由膠原I、III、V、VI、XIII和原纖維蛋白組成。其主要成員為膠原I和膠原III。在靈長類和小鼠子宮內(nèi)膜的胞外基質(zhì)中均存在由大原纖維組成的膠原I、III、V，短鏈的膠原XIII，微原纖維組成的膠原VI和原纖維蛋白。在靈長類子宮內(nèi)膜的胞外基質(zhì)中大原纖維組成的膠原I存在于月經(jīng)周期的增生期，分泌期和蛻膜化時期；膠原III同樣存在上面所述的三個階段，但是在蛻膜化的組織中，其含量比膠原I少；膠原V的表達量在蛻膜化時期增加，并且三者在蛻膜化時期持續(xù)表達[20]。

4.2 在月經(jīng)發(fā)生過程中，早期認為降解胞外基質(zhì)的三類酶 ①溶酶體酶，其原因為：1)在組織中存在有高度特異活性的酸性水解酶；2)在分泌晚期非沉淀的溶酶體成分增加[24]；3)細胞化學顯示在月經(jīng)前，胞外酸性磷酸酶存在于子宮內(nèi)膜之中。這些結(jié)果與溶酶體的水解作用是相一致的，但是并不能證明在月經(jīng)中參與了胞外基質(zhì)的降解。②纖溶酶和纖溶酶原活化因子。人的子宮內(nèi)膜中的尿激酶和組織纖溶酶原活化因子在月經(jīng)期時增加，在體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜中，孕酮能夠抑制兩種纖溶酶原活化因子的分泌[25]，并且能夠刺激間質(zhì)細胞纖溶酶原活化因子抑制因子-1的表達[26]。表明在月經(jīng)周期中激素能夠調(diào)節(jié)纖溶酶原活化因子在月經(jīng)前釋放。纖溶酶原活化因子不但具有溶解纖維蛋白的作用，而且能夠降解胞外基質(zhì)的成分[27]和激活其他的酶，例如金屬基質(zhì)蛋白酶[28]。③金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)，能夠降解胞外基質(zhì)的大部分蛋白質(zhì)[29]。大部分MMP以酶原的形式分泌，經(jīng)過蛋白水解作用而被激活。a-巨球蛋白和組織金屬蛋白酶抑制劑能夠?qū)⑺钚缘男问睫D(zhuǎn)變?yōu)榉腔钚孕问健ourtoy PJ 研究小組于1996年，將人的子宮內(nèi)膜組織塊體外培養(yǎng)以模擬在月經(jīng)期的變化。以網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)的完整性即利用網(wǎng)狀纖維染色，相應的膠原抗體免疫組化和組織塊中羥基脯氨酸的殘余量作為衡量子宮內(nèi)膜崩解和保持完整性的指標。在給予外源性的E2和P4，子宮內(nèi)膜胞外基質(zhì)保持完整；在不給予外源性的E2和P4，子宮內(nèi)膜胞外基質(zhì)崩解；在不給予外源性的E2和P4的處理組中加入各種酶的抑制劑。在加入4種不同MMP特異的抑制劑(RP, SC, BB, 和Ro)時，子宮內(nèi)膜網(wǎng)狀纖維保持完好。因此，體外培養(yǎng)研究表明，金屬基質(zhì)蛋白酶是誘導月經(jīng)發(fā)生最重要的蛋白酶[35]。

4.3 MMP家族成員的定位，表達及酶活

4.3.1 MMP家族成員在月經(jīng)周期中的人和獼猴子宮內(nèi)膜中的定位和表達 MMP1在人和獼猴中的月經(jīng)期和增生早期在子宮內(nèi)膜功能層的間質(zhì)細胞中表達[36-37]。Zhang J研究小組將人的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞體外培養(yǎng)來模擬月經(jīng)周期的黃體晚期，加入雌二醇和孕酮，細胞培養(yǎng)6 d后，孕酮撤退以模仿體內(nèi)月經(jīng)的發(fā)生。利用酶譜學方法和EMSA方法檢測MMP的表達情況，發(fā)現(xiàn)MMP1的表達量增加，另外MMP-3和MMP-9的表達量也增加，MMP2的表達量沒有變化[38]。Brenner RM研究小組將獼猴的卵巢切除，序貫性給予雌激素和孕酮，人工誘導獼猴的月經(jīng)模型。孕酮撤退之后，MMP1 mRNA出現(xiàn)峰值，隨后迅速下降，在孕酮撤退的第5天即早修復期，已經(jīng)下降到基礎值[37]。Papp CB研究小組研究了孕酮對蛻膜化間質(zhì)細胞的影響，以及在加入雌二醇或者孕酮或者雌二醇和孕酮，利用Northern和ELISA方法研究間質(zhì)細胞MMP的表達情況。單獨加入雌二醇并沒有影響MMP1酶原的分泌，然而同時在蛻膜化的間質(zhì)細胞加入雌二醇和孕酮，利用 Northern雜交檢測，抑制了MMP1 mRNA的表達(MMP2的表達并沒有受到雌二醇和孕酮的影響)。雌二醇和孕酮的這種抑制作用在孕酮撤退即用米非司酮處理4 d后能夠解除，MMP1 mRNA的表達是孕酮維持情況下的幾倍。用ELISA方法進一步在蛋白質(zhì)水平上證實了MMP1在孕酮撤退時表達量增加，而MMP2并不受到激素的影響[12]。

MMP2和MMP11同樣在人和獼猴中的月經(jīng)期和增生早期在子宮內(nèi)膜功能層的間質(zhì)細胞中表達。在人的子宮內(nèi)膜組織塊培養(yǎng)的體外模型中，孕酮能夠抑制MMP2的表達，米非司酮能夠解除這種抑制作用[36]。在人的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，孕酮的撤退能夠誘導MMP2的上調(diào)[39]。在人工誘導獼猴月經(jīng)模型中，免疫組織化學顯示它們在脫落的間質(zhì)細胞中有強表達，但在E2處理的10 d后消失。而在卵巢切除的動物中，在沒有E2的情況下，MMP2能夠持續(xù)表達14 d之久[37]。在人工誘導獼猴月經(jīng)模型中，孕酮的撤退能夠上調(diào)MMP11的表達，且能持續(xù)表達到增生期。

MMP3在月經(jīng)期的間質(zhì)細胞中存在[30]，在增生中期和分泌中期在局部水腫的間質(zhì)細胞中弱表達。在獼猴中，在月經(jīng)期后，表達量增加。在孕酮撤退的第2天即月經(jīng)前期，在上層功能層的間質(zhì)細胞特別是在腺體和螺旋動脈周圍強表達。3 d后即早修復期，表達的部位具有局限性，主要在腔上皮下的間質(zhì)細胞表達。Lockwood CJ研究小組同樣利用了人的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞體外培養(yǎng)模擬月經(jīng)的發(fā)生。雌二醇和孕酮能夠顯著抑制蛻膜化間質(zhì)細胞中MMP3的表達。但是單獨加入雌二醇，并不能抑制其表達。孕酮的撤退能夠解除這種抑制作用，從而促進MMP3的表達。因此MMP3可能在子宮內(nèi)膜功能層脫落以前起著促進胞外基質(zhì)降解的功能[40]

MMP7 mRNA在人和獼猴的月經(jīng)期和增生期在子宮內(nèi)膜上皮細胞中表達，在分泌早期和分泌中期并沒有發(fā)現(xiàn)表達。在人工誘導的獼猴月經(jīng)模型中，孕酮撤退的2 d后，MMP7 mRNA在上皮的細胞中表達增強，在雌激素處理的8～10 d仍然保持高表達。其蛋白質(zhì)在腺上皮表達最強，在基底層和即將脫落的功能層弱表達。因此，MMP7似乎通過上皮細胞參與月經(jīng)后胞外基質(zhì)的重建[41]。

MMP9 mRNA僅僅存在于分泌晚期和月經(jīng)期的間質(zhì)細胞中[42]，另外在培養(yǎng)的間質(zhì)細胞中孕酮的撤退能夠產(chǎn)生MMP9的表達增加[36]。

MMP10在分泌晚期和月經(jīng)期存在于子宮內(nèi)膜的間質(zhì)細胞中。在人工誘導的獼猴月經(jīng)模型中，孕酮的撤退能夠?qū)е翸MP10的上調(diào)，而在孕酮撤退的5 d后，降低到基礎值。

4.3.2 在小鼠月經(jīng)模型中MMP家族成員在月經(jīng)期中的定位，表達和酶活Salamonsen LA研究小組利用小鼠生理性孕酮的撤退的月經(jīng)模型，對MMP家族成員的定位和表達進行了研究[43]。MMP9和MMP7定位于白細胞特別是中性白細胞亞群。MMP3和MMP7在新修復上皮的附近表達豐富。利用兩種抑制劑鹽酸脫氧土霉素和巴馬司他灌胃處理小鼠，通過原位酶譜學方法檢測兩種抑制劑能夠有效的減少MMP的活性，但并不沒有導致子宮內(nèi)膜的崩解和修復。因此，研究人員暗示MMP雖然在人工誘導的小鼠月經(jīng)模型中的子宮內(nèi)膜存在，但是并不是這一過程的主要介導者。本實驗室利用小鼠生理性孕酮撤退月經(jīng)模型，在孕酮撤退的12 h回植孕酮，抑制pMMP-2、pMMP-3、MMP-9、pMMP-10 和pMMP-11的表達,孕酮撤退16 h回植孕酮，抑制pMMP-13的表達[44]。原位酶譜學檢測，活性膠原酶在孕酮撤退12 h定位于蛻膜化區(qū)域的外周邊界，在16 h，定位于中間壞死蛻膜化區(qū)域，明膠酶在孕酮撤退12 h同樣定位于蛻膜化區(qū)域的外周邊界[45]。將人的子宮內(nèi)膜移植到小鼠中，續(xù)慣性給予雌激素和孕酮已模擬人的增殖期和分泌期，在孕酮撤退后，人的子宮內(nèi)膜崩解的同時，MMP-1,MMP-2和MMP-9的表達量增加[46]。

5 展望

MMPs特異抑制劑的干預證實MMP是月經(jīng)發(fā)生中子宮內(nèi)膜崩解的最終作用因子，但在小鼠月經(jīng)樣模型中卻發(fā)現(xiàn)MMP并不是其重要的介導者。MMPs在月經(jīng)發(fā)生中的具體作用是什么？不同MMPs家族成員在靈長類月經(jīng)動物以及小鼠月經(jīng)樣模型中的表達和定位，提示MMPs眾多的家族成員參與了這一過程且執(zhí)行不同的功能，但是哪一個MMP在月經(jīng)發(fā)生中占主導地位以及不同的MMPs在這一過程中分別執(zhí)行著什么功能？這些懸而未決的科學問題仍有待于進一步探索。

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