鉤端螺旋體groEL基因原核表達(dá)及其產(chǎn)物免疫保護(hù)作用

李小余，王銀環(huán)，嚴(yán) 杰，程?hào)|慶

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310053;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，浙江 杭州 310058)

由致病性鉤端螺旋體(Leptospira)(簡(jiǎn)稱(chēng)鉤體)感染引起的鉤體病是全球流行的人獸共患傳染病，我國(guó)是該病的主要疫區(qū)之一［1-2］。鉤體病通過(guò)疫水迅速傳播，極易引起暴發(fā)流行，故鉤體病是我國(guó)重點(diǎn)監(jiān)控的傳染病之一。致病性鉤體自然宿主和血清群眾多，僅我國(guó)即有18個(gè)血清群，但各血清群之間交叉保護(hù)作用弱或無(wú)［3］。目前使用的鉤體疫苗均為當(dāng)?shù)亓餍袉?wèn)號(hào)鉤體血清群、型制備的多價(jià)全菌死疫苗，但該疫苗對(duì)其未包含的鉤體血清群感染無(wú)保護(hù)作用，同時(shí)全菌疫苗副作用很大［4-6］。因此研發(fā)高效低毒的通用型鉤體基因工程疫苗具有重要意義。

研發(fā)通用型鉤體基因工程疫苗的前提是篩選出不同血清群型中普遍存在的屬特異性保護(hù)抗原。早年發(fā)現(xiàn)，鉤體外膜總蛋白具有交叉免疫保護(hù)作用［7］。近年文獻(xiàn)報(bào)道，LipL32、LigB、Loa22和OmpL1等外膜蛋白是屬特異性抗原［8-11］，但此類(lèi)蛋白分子量過(guò)大或存在不同的基因型［9，12-13］。GroEL 是細(xì)菌熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)家族成員，序列保守，有很強(qiáng)的免疫原性［14-16］。在問(wèn)號(hào)鉤體賴株染色體中也存在編碼 groEL基因［17］，且其表達(dá)產(chǎn)物GroEL是外膜蛋白［18-19］。因此，GroEL 蛋白有可能作為鉤體基因工程疫苗抗原。本研究中，我們檢測(cè)了我國(guó)優(yōu)勢(shì)流行鉤體血清群中g(shù)roEL基因，重組表達(dá)了問(wèn)號(hào)鉤體賴型賴株GroEL蛋白并進(jìn)行了動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)，以期為GroEL作為通用型鉤體基因工程疫苗抗原提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 鉤體株及培養(yǎng) 我國(guó)用于鉤體病血清學(xué)診斷的標(biāo)準(zhǔn)株問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株、流感傷寒群流感傷寒型臨6株、秋季群秋季型臨4株、波摩那群波摩那型羅株、澳洲群澳洲型65-9株、七日熱群七日熱型56069株、犬群犬型林株、塞羅群烏爾夫型L183株由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系提供，采用EMJH培養(yǎng)基在28℃條件下培養(yǎng)。

1.2 groEL基因擴(kuò)增 采用 (Generay)提取問(wèn)號(hào)鉤體賴株DNA，紫外分光光度法測(cè)定其濃度和純度［20］。根據(jù) GenBank上問(wèn)號(hào)鉤體賴株groEL 基因序列(accession No.:NC_004342)及其限制性核酸內(nèi)切酶圖譜分析結(jié)果、原核表達(dá)載體pET42a(Novagen)多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)groEL基因并攜帶合適內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物。上游引物序列:5'-CGC CAT ATG(Nde I)GCG AAA GAT ATT GAA-3'，下游引物序列:5'-CGC CTC GAG(Xho I)CAT CAT TCC GCC CAT TCC。引物由上海 Invitrogen公司合成。采用高保真PCR試劑盒(TaKaRa)擴(kuò)增groEL基因，PCR 總體積 100 μl，內(nèi)含 2.5 mol/L dNTP、200 nmol/L 各引物、20 mol/L MgCl2、2.5 U EX-Taq DNA聚合酶、100 ng DNA模板和1×PCR緩沖液(pH8.3)。PCR參數(shù):94℃ 5 min;94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 120 s，30 個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。采用溴乙錠預(yù)染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。

1.3 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序及分析 采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(BioColor)回收groEL基因擴(kuò)增片段，采用T-A克隆試劑盒(TaKaRa)將其克隆至pMD-19T質(zhì)粒中，形成 pMD-19TgroEL后電轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α(Invitrogen)并在 LB培養(yǎng)液(Oxoid)中擴(kuò)增，氨芐西林和藍(lán)白斑雙重篩選，質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen)提取重組質(zhì)粒后采用Nde I和 Xho I(TaKaRa)雙酶切初步鑒定［20］，委托上海 Invitrogen 公司測(cè)序。采用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)和 TMpredServer(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)中軟件對(duì)GroEL結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.4 groEL基因原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建及鑒定采用Nde I和Xho I分別雙酶切pMD19-TgroEL和pET42a，在T4 DNA連接酶(TaKaRa)作用下，將回收的groEL基因片段連接于線性化pET42a，形成重組表達(dá)載體 pET42agroEL。將pET42agroEL電轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌 E.coli BL21DE3(Novagen)，獲得工程菌E.coli BL21DE3pET42a-groEL，質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen)提取質(zhì)粒后再次測(cè)序［20］。

1.5 目的重組蛋白表達(dá)與純化 E.coli BL21DE3pET42a-groEL接種于含50 μg/mL卡那霉素(Sigma)的LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至A600=0.6～0.8時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L的 IPTG(Sigma)，以誘導(dǎo)目的重組蛋白GroEL(rGroEL)表達(dá)。培養(yǎng)物10000 r/min 4℃離心5 min，細(xì)菌沉淀用 0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌2次，冰浴中超聲破碎，5000 r/min 4℃離心10 min，取上清和沉淀備檢。采用10%分離膠的SDS-PAGE聯(lián)合Bio-Rad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢查rGroEL表達(dá)情況及狀態(tài)，然后用 Ni-NTA親和層析柱(BioColor)提純可溶性rGroEL［21］。提純的rGroEL采用試劑盒(Beyotime)測(cè)定其蛋白濃度。

1.6 rGroEL抗血清的制備 2 mg提純的rGroEL與弗氏完全佐劑充分混勻，間隔一周背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射新西蘭家兔4次。末次免疫兩周后采集家兔心血，分離血清。采用 1 μg rGroEL為包被抗原的ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)，其吸光度大于相同稀釋度正常兔血清OD450均值+3SD 者判為陽(yáng)性［22］。

1.7 rGroEL 免疫反應(yīng)性檢測(cè):200 μg rGroEL SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Life Sciences)上。以1∶2500 稀釋的rGroEL兔抗血清或1∶500稀釋的鉤體病病人血清為一抗、1∶10000 稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch)為二抗，采用 Western Blot法檢測(cè)rGroEL與上述血清標(biāo)本的免疫反應(yīng)性。

1.8 金地鼠保護(hù)試驗(yàn) 4周齡雄性金地鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。新鮮培養(yǎng)的問(wèn)號(hào)鉤體賴株12000 r/min離心15 min(4℃)，沉淀的鉤體用不同體積的EMJH培養(yǎng)液重懸，Petroff-Hausser counting chamber計(jì)數(shù)板(Fisher Scientific)計(jì)數(shù)［23］。先將金地鼠分為5組，每組6只，其中4組分別腹腔注射107、108、109或1010問(wèn)號(hào)鉤體賴株懸液1 mL，觀察7 d，另一組注射等體積EMJH培養(yǎng)液作為對(duì)照，以確定最低致死量(MLD)。將金地鼠分為3組，每組8只，其中兩組分別腹股溝皮下注射100 μg 或 200 μg rGroEL 與 1 mg 氫氧化鋁(Sigma)混合物，間隔一周重復(fù)免疫一次，另一組注射200 μg BSA(Sigma)與氫氧化鋁混合物作為對(duì)照［12］。末次免疫后兩周，用2倍 MLD問(wèn)號(hào)鉤體賴株腹腔注射進(jìn)行攻擊，觀察7 d。上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)溫度21±2℃，相對(duì)濕度30%～70%，光照周期14/10 h。

1.9 顯微鏡凝集試驗(yàn)(MAT) 采集上述動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)中存活的rGroEL免疫金地鼠心血，分離血清。血清用 PBS 進(jìn)行 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800 稀釋?zhuān)?0.1 ml與等量新鮮培養(yǎng)的問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株、流感傷寒群流感傷寒型臨6株、秋季群秋季型臨4株、波摩那群波摩那型羅株、澳洲群澳洲型65-9株、七日熱群七日熱型56069株、犬群犬型林株、塞羅群烏爾夫型L183株混合，37℃孵育1 h，然后在暗視野顯微鏡下觀察，以50%鉤體被凝集的血清最高稀釋度作為效價(jià)判斷終點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中用正常金地鼠血清作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 groEL基因分布 從問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株、流感傷寒群流感傷寒型臨6株、秋季群秋季型臨4株、波摩那群波摩那型羅株、澳洲群澳洲型65-9株、七日熱群七日熱型56069株、犬群犬型林株、塞羅群烏爾夫型L183株基因組DNA中均擴(kuò)增出預(yù)期大小的groEL基因片段(圖1)。

圖1 不同問(wèn)號(hào)鉤體血清群groEL基因擴(kuò)增片段Fig.1 Amplification fragments of groEL gene of different L.Interrogans serogroups

2.2 groEL基因測(cè)序與結(jié)構(gòu)分析結(jié)果 與GenBank(accession No.:NC_004342)中問(wèn)號(hào)鉤體賴株groEL基因比較，本實(shí)驗(yàn)所克隆的問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株、流感傷寒群流感傷寒型臨6株、秋季群秋季型臨4株、波摩那群波摩那型羅株、澳洲群澳洲型65-9株、七日熱群七日熱型56069株、犬群犬型林株、塞羅群烏爾夫型L183株groEL基因核苷酸和氨基酸序列相似性達(dá)99.5%以上?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，GroEL為外膜蛋白，N端位于胞外，跨膜區(qū)序列為MAKDIEYNETARRKLLE，無(wú)胞內(nèi)區(qū)(圖2)。

2.3 rGroEL表達(dá)及其抗血清效價(jià) 在IPTG誘導(dǎo)下，所構(gòu)建的原核表達(dá)系統(tǒng) E.coli BL21DE3pET42a-groEL能有效表達(dá)rGroEL，該重組蛋白主要以可溶性形式存在，提純的rGroEL經(jīng)SDS-PAGE后顯示為單一的蛋白條帶(圖3)。

圖2 鉤體GroEL蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.2 Results of structural analysis of leptospiral GroEL protein

圖3 rGroEL蛋白表達(dá)和提純效果Fig.3 Expression and purification effects of rGroEL protein

2.4 rGroEL免疫原性 兔抗 rGroEL血清ELISA效價(jià)為1∶5000 。Western Blot結(jié)果顯示，rGroEL可被兔抗rGroEL血清及鉤體病患者血清識(shí)別并產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)(圖4)。

2.5 rGroEL免疫保護(hù)效果 問(wèn)號(hào)鉤體賴株對(duì)金地鼠MLD為108。2倍MLD問(wèn)號(hào)鉤體賴株攻擊后，100與200 μg rGroEL免疫的金地鼠存活率分別為 50.0%(4/8)和75.0%(6/8)。

圖4 rGroEL與不同血清標(biāo)本W(wǎng)estern Blot結(jié)果Fig.4 Western BlotresultofrGroEL with different serum specimens

2.6 MAT效價(jià) rGroEL免疫金地鼠血清與問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株、流感傷寒群流感傷寒型臨6株、秋季群秋季型臨4株、波摩那群波摩那型羅株、澳洲群澳洲型65-9株、七日熱群七日熱型56069株、犬群犬型林株、塞羅群烏爾夫型L183株的 MAT效價(jià)為1∶50～1∶400(表2)。

3 討論

除新疆、西藏、青海、甘肅、寧夏省區(qū)至今尚未有鉤體病例報(bào)道外，其余我國(guó)省區(qū)均存在不同程度的鉤體病流行狀況，其中四川、湖北、湖南等長(zhǎng)江流域及嶺南地區(qū)鉤體病流行較為嚴(yán)重［2-3］。我國(guó)流行的主要問(wèn)號(hào)鉤體血清群為黃疸出血群、流感傷寒群、秋季群、波摩那群、澳洲群、七日熱群和犬群，其中60% ～70%的鉤體病病人為感染黃疸出血群賴型所致［2-3］。廣東、廣西、四川、江西等地區(qū)曾發(fā)生塞羅群棉蘭型鉤體感染所致的鉤體病暴發(fā)流行［3］。

表1 rGroEL對(duì)金地鼠免疫保護(hù)效果Table 1 Immunoprotective effect of rGroEL in LVG hamsters

表2 rGroEL免疫金地鼠血清MAT檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection result of sera from rGroEL-immunized LVG hamsters by MAT

接種疫苗是預(yù)防和控制傳染病流行最為有效和經(jīng)濟(jì)的措施?，F(xiàn)行使用的多價(jià)鉤體全菌死疫苗雖對(duì)其所包含的鉤體血清群感染有一定的保護(hù)作用，但接種后常有發(fā)熱、接種部位淋巴結(jié)腫大等嚴(yán)重不良反應(yīng)，一般認(rèn)為該毒副作用由鉤體細(xì)胞壁 LPS引起［3，12-13］。由于易感人群主要是農(nóng)民，上述多價(jià)鉤體全菌死疫苗接種后往往數(shù)天內(nèi)不能進(jìn)行重體力勞動(dòng)，使疫苗預(yù)防接種受到了很大限制。多價(jià)鉤體全菌死疫苗另一重大缺陷是，對(duì)疫苗中未包含的問(wèn)號(hào)鉤體血清群無(wú)交叉免疫保護(hù)作用，這也是近年來(lái)廣東、廣西、四川、江西等地區(qū)塞羅群棉蘭型暴發(fā)流行的主要原因［2-3］。

GroEL是一種熱休克蛋白，廣泛存在于多種原核細(xì)胞型微生物，在新生蛋白正確折疊和組裝、變性蛋白質(zhì)修復(fù)、蛋白跨膜轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用［14-16］。有文獻(xiàn)報(bào)道，問(wèn)號(hào)鉤體秋季型GroEL 位于鉤體外膜表面［18-19，24］，是誘導(dǎo)宿主體液免疫反應(yīng)的主要抗原，鉤體病病人血清中可檢出GroEL抗體［25］。我們的蛋白分子結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，GroEL確為外膜蛋白，其96.9%(17/546)序列位于菌體外。

我們以往研究中發(fā)現(xiàn)，問(wèn)號(hào)鉤體賴株感染巨噬細(xì)胞后，LipL32等不少外膜蛋白表達(dá)水平顯著下降，但GroEL表達(dá)水平顯著升高［26-27］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株、流感傷寒群流感傷寒型臨6株、秋季群秋季型臨4株、波摩那群波摩那型羅株、澳洲群澳洲型65-9株、七日熱群七日熱型56069株、犬群犬型林株、塞羅群烏爾夫型L183株都有g(shù)roEL基因且其序列高度保守。除幼豚鼠外，金地鼠是致病性鉤體的易感動(dòng)物［28］。本研究中，我們探討了rGroEL蛋白對(duì)金地鼠的免疫保護(hù)作用，結(jié)果顯示100與200 μg rGroEL免疫的金地鼠存活率分別為50.0%和75.0%(表1)。此外，rGroEL免疫金地鼠血清對(duì)上述8群8株問(wèn)號(hào)鉤體的MAT效價(jià)為1∶50～1∶400(表2)。綜上所述，GroEL是分布廣泛、序列保守、抗原性較強(qiáng)的問(wèn)號(hào)鉤體屬特異性保護(hù)性抗原，可用于研制通用性鉤體基因工程疫苗。

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