• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    ORP調(diào)控對葡萄糖和果糖混合底物丁醇發(fā)酵的影響

    2014-08-08 09:52:54齊高相吳又多陳麗杰萬慧慧白鳳武
    化工進展 2014年1期
    關鍵詞:丁醇輔酶有機酸

    齊高相,吳又多,陳麗杰,萬慧慧,白鳳武,3

    (1大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧 大連116023;2大連理工大學化學分析測試中心,遼寧 大連116023;3上海交通大學生命科學技術學院,上海200240)

    與好氧發(fā)酵過程相比,厭氧發(fā)酵過程由于缺少合適的控制參數(shù)而難以進行過程優(yōu)化。氧化還原電位(oxidoreduction potential,ORP)調(diào)控作為一種新的過程調(diào)控手段已經(jīng)應用于很多厭氧發(fā)酵過程,比如1,3-丙二醇發(fā)酵[1]、木糖醇發(fā)酵[2]、丙酸發(fā)酵[3]、乳 酸 發(fā) 酵[4]和 丁 醇 發(fā) 酵[5]等 生 物 過 程工藝。

    ORP是綜合反映發(fā)酵培養(yǎng)基pH值、溶解氧濃度、電解質(zhì)電勢和平衡常數(shù)的參數(shù)[6],在所有生物的生命過程中起到很重要的作用[7],每一菌種甚至是每一菌株都有最利于其生長的ORP范圍。ORP不僅與培養(yǎng)基理化性質(zhì)有關,而且能夠反應菌體內(nèi)部氧化還原狀態(tài)[8]。通過蛋白膜電勢(protein film voltammery,PFV)技術將酶分子固定到ORP電極上,測定許多與氧化還原反應有關的酶的活性隨ORP變化,結(jié)果表明酶分子有其最佳的ORP水平[9]。因此,可以通過調(diào)節(jié)ORP影響酶的活性進而影響胞內(nèi)代謝流分布,最終可有效提高目標產(chǎn)物發(fā)酵終點產(chǎn)量。

    菊芋具有生長適應性強,產(chǎn)量高等天然作物優(yōu)勢,且菊芋塊莖相對木質(zhì)纖維素原料更易水解而獲得可發(fā)酵糖,可作為生物丁醇發(fā)酵生產(chǎn)的理想底物[10-11]。然而,由于菊芋塊莖酸解液中的發(fā)酵糖主要為葡萄糖和果糖的混合糖體系,菌體在以混合糖為底物進行的丁醇發(fā)酵過程中存在顯著的碳源阻遏效應(carbon catabolite repression,CCR),即菌體細胞優(yōu)先利用葡萄糖,果糖利用極其緩慢,直至葡萄糖消耗殆盡后果糖代謝才開始緩慢進行。丁醇發(fā)酵過程是典型的雙相發(fā)酵體系,即菌體首先主要代謝生成乙酸和丁酸,稱為產(chǎn)酸期;隨后再將二者吸收轉(zhuǎn)化生成丙酮、丁醇和乙醇等主要溶劑稱為產(chǎn)溶劑期[12]。產(chǎn)酸階段優(yōu)先利用葡萄糖產(chǎn)生的大量有機酸尤其是丁酸對細胞有毒性[13-14]。因此CCR效應和丁酸毒性使菌體細胞無法從產(chǎn)酸期順利轉(zhuǎn)變到產(chǎn)溶劑期而導致有機酸過度積累,最終使得發(fā)酵提前終止[15],即典型的“酸崩潰”現(xiàn)象[16]。

    通過前期研究表明,控制以葡萄糖和果糖混合糖為底物的丁醇發(fā)酵過程的ORP不低于-460mV能夠有效防止“酸崩潰”現(xiàn)象的發(fā)生。本文通過對比最佳ORP調(diào)控下的發(fā)酵過程與無控ORP發(fā)酵過程的底物消耗,菌體生長,產(chǎn)物生成以及胞內(nèi)關鍵代謝物含量(輔酶A酯類化合物,能量狀態(tài),還原力水平和糖酵解途徑中間化合物),旨在探究ORP調(diào)控對以葡萄糖和果糖混合糖為底物的丁醇發(fā)酵過程的影響。

    1 實驗材料和方法

    1.1 菌種

    作者實驗室馴化保存的丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌ClostridiumacetobutylicumL7。

    1.2 培養(yǎng)基

    發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖11,果糖44,乙酸銨2.76,K2HPO40.5,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O 0.2,MnSO4·H2O 0.01,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01,對氨基苯甲酸0.01,生物素0.01,酵母粉2,初始pH值5.5。

    滅菌前向裝有活化培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的點滴瓶充氮氣5min,壓蓋。

    培養(yǎng)基滅菌條件均為121℃,15min。

    1.3 培養(yǎng)條件

    菌種活化培養(yǎng):將5mL冷凍保藏的菌種接種于裝有100mL活化培養(yǎng)基點滴瓶中,37.5℃培養(yǎng)20h。

    種子培養(yǎng):將充分活化的菌種以10%的接種量接種于100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,37.5℃培養(yǎng)24h。

    發(fā)酵罐培養(yǎng):預先向裝有滅菌后培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中通無菌氮氣30min,以排除發(fā)酵培養(yǎng)基中溶解的氧氣,然后將經(jīng)過搖瓶擴大培養(yǎng)后的種子接入發(fā)酵罐中,接種量10%,設定攪拌轉(zhuǎn)速150r/min,溫度37.5℃。

    例如,教師可以將學生分成不同小組,合作探究教材中的案例,自主搜集資料,從不同角度進行思考,無形中鍛煉學生解決問題和分析整理的能力。此外,學生在小組學習中更容易積極表達自身的不同看法,在提高自主學習積極性和會計專業(yè)核心素養(yǎng)的同時,啟迪智慧,將學生快速培養(yǎng)成社會所需人才。

    1.4 ORP調(diào)控策略

    控制發(fā)酵全程ORP不低于-460mV將ORP電極顯示系統(tǒng)連接繼電器和控制器(蠕動泵),當ORP顯示數(shù)值低于-460mV時,繼電器吸合,自動開啟控制器,系統(tǒng)通過控制器向發(fā)酵培養(yǎng)基泵入無菌空氣直至ORP顯示數(shù)值高于-457mV停止。隨著發(fā)酵進行,ORP發(fā)生變化,當ORP顯示數(shù)值再次到達-460mV時,系統(tǒng)按上述方式開啟新的調(diào)控。通過調(diào)控裝置可以控制發(fā)酵全過程ORP下限不低于-460mV。

    1.5 分析方法

    1.5.1 菌體濃度測定方法

    在620nm處測定菌體的吸光度作為菌體濃度(OD620),細胞干重(dry cell weight,DCW,g/L)由以下公式計算得到。

    DCW=0.8009×OD620

    1.5.2 糖濃度測定

    葡萄糖濃度使用SBA-40C生物傳感分析儀(山東省科學院生物研究所)測定,總還原糖濃度采用DNS法測定,果糖濃度為總還原糖濃度與葡萄糖濃度之差。

    1.5.3 丙酮、丁醇及乙醇濃度的測定

    發(fā)酵液中丙酮、丁醇和乙醇濃度采用氣相色譜法測定。色譜分離條件:毛細管色譜柱Agilent HP-INNOWAX(30cm×0.25mm×0.50μm),柱溫:100℃,進樣口溫度250℃,F(xiàn)ID檢測器溫度300℃,H2流速40mL/min,空氣流速400mL/min,載氣N2流速30mL/min,進樣量0.2μL,分流比50∶1,內(nèi)標物為異丁醇。

    1.5.4 乙酸和丁酸濃度的測定

    乙酸和丁酸濃度使用Waters 1525高效液相色譜測定,色譜分離條件:Aminex HPX-87H有機酸分析柱(30cm×7.8mm;Bio-Rad,Hercules),流動相為5mmol/L H2SO4,流速0.5mL/min,進樣量20μL,柱溫50℃,PDA檢測器檢測波長210nm。

    1.5.5 胞內(nèi)關鍵代謝物提取和測定

    (1)淬滅方法

    用注射器快速抽取10mL發(fā)酵液,加入到裝有30mL,預冷至-40℃、60%甲醇(體積比,下同)的50mL離心管中,搖勻,瞬間淬滅。

    (2)提取方法

    發(fā)酵液和甲醇淬滅液混合均勻后在-10℃10000r/min離心5min。離心完畢去上清,沉淀加5mL預冷至-40℃、60%的甲醇洗滌,再次離心,條件同上。沉淀加入1mL、75%的乙醇,混勻后放入90℃水浴中加熱10min,加熱完畢后放入液氮中迅速冷卻。將樣品取出解凍后在-10℃10000r/min離心8min,上清液用于LC-ESI/MS法對代謝物進行定量分析。

    (3)LC-ESI/MS分析條件

    色譜條件:色譜柱為X Bridge BEH Amide Column XP(2.5μm,2.1×100mm,Waters);柱溫25℃;流動相A為10mmol/L醋酸氨溶液,流動相B為乙腈;梯度洗脫,洗脫條件見表1,流速200μL/min;進樣量10μL。

    表1 液質(zhì)聯(lián)用梯度洗脫條件

    質(zhì)譜條件:TSQ Quantum Ultra液質(zhì)聯(lián)用儀(Thermo Scientific);電噴霧離子源(Electrospray ionization,ESI);離子化模式為正模式和負模式;噴霧電壓3.0kV(正離子掃描模式),2.5kV(負離子掃描模式);鞘氣設定為35units,輔助氣設定為10units;離子源氣化溫度250℃;毛細管溫度340℃;掃描采用選擇反應監(jiān)測(selected reaction monitoring,SRM)模式;采集時間均為0.2s,碰撞氣采用氬氣,碰撞氣壓力1.5mTorr。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 發(fā)酵過程中的菌體生長、底物消耗和產(chǎn)物生成

    以混合糖為底物,ORP調(diào)控下的丁醇發(fā)酵和無控ORP條件下的丁醇發(fā)酵結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明ORP調(diào)控能夠顯著提高發(fā)酵過程混合糖尤其是果糖的利用率,有效降低發(fā)酵終點殘?zhí)菨舛炔⑻岣甙l(fā)酵過程中的菌體濃度和溶劑產(chǎn)量。發(fā)酵終點時,空白對照組和ORP調(diào)控組葡萄糖均被完全消耗,空白對照組果糖剩余30.82g/L,而ORP調(diào)控組果糖剩余僅為1.38g/L。ORP調(diào)控組,發(fā)酵時間為96h,但是空白對照組在發(fā)酵72h以后,發(fā)酵液中溶劑、有機酸及殘?zhí)菨舛茸兓瘶O其微弱,發(fā)酵出現(xiàn)提前終止的特征。丁醇發(fā)酵過程是典型的雙相發(fā)酵,即菌體首先主要代謝生成乙酸和丁酸,隨后再將二者吸收轉(zhuǎn)化生成丙酮、丁醇和乙醇等主要溶劑。表2結(jié)果表明發(fā)酵終點的有機酸濃度差別不大,但從圖1的pH值變化曲線可以看出,有機酸的積累過程不同。在ORP調(diào)控下的丁醇發(fā)酵過程存在著兩個明顯的有機酸重吸收階段,分別出現(xiàn)在葡萄糖代謝階段(12h到24h)和果糖代謝階段(60h到72h),發(fā)酵后期培養(yǎng)基中的有機酸積累是第二階段重吸收后產(chǎn)生的。而空白對照組發(fā)酵過程中僅存在一個明顯的有機酸重吸收過程,即出現(xiàn)在葡萄糖代謝階段(12h到24h),果糖緩慢代謝所產(chǎn)生的有機酸由于缺乏足夠的還原力而無法被重吸收。

    表2 ORP調(diào)控組與及空白對照組的丁醇發(fā)酵結(jié)果

    2.2 發(fā)酵過程中的pH值和ORP變化

    如圖1所示,在整個發(fā)酵過程中,ORP調(diào)控組的pH值高于空白對照組pH值,說明在不進行ORP調(diào)控的發(fā)酵過程中有更多的有機酸積累,因此菌體受到有機酸尤其是丁酸的毒害作用更強,導致“酸崩潰”現(xiàn)象的發(fā)生。對比發(fā)酵全程ORP變化可以發(fā)現(xiàn),ORP調(diào)控的發(fā)酵過程ORP變化曲線在24h到60h之間有一個明顯的波形突起(-423mV到-460mV),在這個波形突起的期間,發(fā)生從產(chǎn)酸期到產(chǎn)溶劑期的轉(zhuǎn)變[17]??瞻讓φ战M的ORP在達到最低點(-516mV)后開始緩慢上升,相應的,在果糖緩慢代謝利用的發(fā)酵過程中未出現(xiàn)明顯的有機酸重吸收過程,實驗結(jié)果表明ORP的變化與從產(chǎn)酸期到產(chǎn)溶劑期的轉(zhuǎn)變之間存在一定關聯(lián)性。

    2.3 發(fā)酵過程中胞內(nèi)關鍵代謝物含量變化

    為探究以葡萄糖和果糖混合糖為底物的丁醇發(fā)酵過程中發(fā)生“酸崩潰”的原因和ORP調(diào)控機理,對代謝過程中的胞內(nèi)關鍵代謝物進行了提取和定量分析,結(jié)果為兩組批次重復實驗結(jié)果的平均值。主要對關鍵的輔酶A酯類化合物,能量狀態(tài),還原力水平和糖酵解途徑中間化合物進行了分析,待測化合物的質(zhì)譜測定條件優(yōu)化結(jié)果見表3。

    圖1 空白對照組和ORP調(diào)控組發(fā)酵過程中pH值和ORP變化曲線

    表3 SRM模式下使用的代謝物質(zhì)譜碰撞參數(shù)

    輔酶A酯類化合物在丁醇代謝合成過程中非常重要,從糖酵解過程產(chǎn)生的丙酮酸生成乙酰輔酶A過程開始,輔酶A酯類化合物經(jīng)過逐步還原,生成丁醇。對比圖2(a)和圖2(b)不難看出,在24h到72h之間,空白對照組和ORP調(diào)控組的輔酶A酯類化合物含量變化趨勢明顯不同。空白對照組,在24h到48h之間,菌體產(chǎn)酸較快,生成輔酶A酯類化合物,所以輔酶A酯類化合物含量呈上升趨勢,在48h到72h之間,由于有機酸對細胞的毒害導致細胞裂解,從而導致輔酶A酯類化合物含量下降。ORP調(diào)控組,在24h到36h之間,有機酸還在進行微弱的重吸收過程,所以輔酶A酯類化合物含量稍有下降,在36h到60h之間,由于菌體利用果糖產(chǎn)酸,輔酶A酯類化合物濃度升高,在60h到72h之間,有機酸快速被重吸收,輔酶A酯類化合物含量也出現(xiàn)明顯下降。

    圖2 空白對照組和ORP調(diào)控組發(fā)酵過程中輔酶A酯類化合物含量變化曲線

    對于丙酮丁醇梭菌,其細胞內(nèi)部pH值比外界環(huán)境要高,以維持其生長和代謝活動正常進行[18]。在丁醇發(fā)酵過程中菌體自身產(chǎn)生的乙酸和丁酸會對細胞產(chǎn)生毒性,尤其是丁酸的解偶聯(lián)作用能夠降低菌體維持細胞內(nèi)外ΔpH的能力。當菌體內(nèi)pH值降低時,菌體就會采用消耗ATP的方式將細胞內(nèi)的H+外排。因此,通過細胞內(nèi)ATP含量可以推測菌體對外部有機酸毒性的抵抗能力。對比圖3(a)和圖3(b)可以看出,菌體在快速利用葡萄糖時大量生成ATP,在24h到60h之間ATP含量非常低,大量ATP被用于抵抗外部有機酸的毒性。對于空白對照組,整個發(fā)酵過程ATP含量呈單調(diào)下降趨勢,直至發(fā)酵結(jié)束。而ORP調(diào)控下,菌體在經(jīng)歷了36h的極低ATP水平后,由于有機酸重吸收開啟,菌體開始快速生成ATP。從發(fā)酵36h至發(fā)酵結(jié)束,ORP調(diào)控組菌體內(nèi)的能荷(energy charge,EC)高于空白對照組,表明ORP調(diào)控對細胞內(nèi)的能量狀態(tài)有調(diào)節(jié)作用。

    圖3 空白對照組和ORP調(diào)控組發(fā)酵過程中能量狀態(tài)變化曲線

    細胞內(nèi)眾多的反應都受到NADH和NAD+比例的調(diào)節(jié),對于丁醇發(fā)酵而言,每生成1mol丁醇需要消耗4mol NADH。因此NADH和NAD+的水平對于丁醇發(fā)酵而言至關重要。嚴格厭氧的丙酮丁醇梭菌解除氧毒害作用機理方面直接與NADH和NAD+水平有關[19],因此通過向培養(yǎng)基中通入無菌空氣調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的培養(yǎng)基ORP對于菌體內(nèi)的NADH和NAD+水平也有著重要的調(diào)節(jié)作用。對比圖4(a)和圖4(b)發(fā)現(xiàn),發(fā)酵初期菌體利用葡萄糖迅速產(chǎn)酸,NADH大量生成,NADH/NAD+也較高,空白對照組和ORP調(diào)控組NADH/NAD+均為0.27。隨后隨著有機酸重吸收過程進行,NADH逐漸被消耗。在24h到60h之間,空白對照組NADH/NAD+呈下降趨勢,而ORP調(diào)控下NADH/NAD+上先升后下降,表明ORP調(diào)控能夠調(diào)整細胞內(nèi)還原力水平。在24h到60h期間,NADH/NAD+一直處于0.03到0.09的較低水平,使得從產(chǎn)酸期到產(chǎn)溶劑期過渡緩慢,延長了發(fā)酵時間。

    圖4 空白對照組和ORP調(diào)控組發(fā)酵過程中還原力水平變化曲線

    磷酸化是葡萄糖和果糖進入細胞的第一步反應,細胞內(nèi)磷酸化糖類的水平在一定程度上能夠反映糖類進入細胞情況以及糖酵解過程的強弱。為了考察ORP調(diào)控組和空白對照組發(fā)酵過程中菌體對糖的利用,對胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量進行了比較。對比圖5(a)和圖5(b)可以看出,在發(fā)酵前48h空白對照組和ORP調(diào)控組己糖單磷酸和己糖二磷酸含量變化趨勢相同,都呈單調(diào)下降趨勢,因為菌體在發(fā)酵前24h快速利用葡萄糖,糖酵解作用強,在24h到48h之間,糖酵解作用減弱,胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量下降。在48h以后,在ORP調(diào)控組和空白對照組胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量出現(xiàn)相反趨勢,空白對照組中有機酸的毒害作用導致菌體逐漸裂解死亡,胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量也出現(xiàn)下降,而ORP調(diào)控組菌體葡萄糖利用完畢并經(jīng)過一段延遲時間后,開始快速利用果糖進行糖酵解,胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量快速升高。ORP調(diào)控組發(fā)酵72h以后胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量開始下降,這是因為隨著發(fā)酵液中丁醇濃度的提高,細胞活性降低,對糖的利用減慢,糖酵解作用開始減弱。丙酮酸是糖酵解代謝途徑的終產(chǎn)物,丙酮酸到乙酰輔酶A代謝流決定了底物碳流流向溶劑的多少。對比圖5(a)和圖5(b)可以看出,在12h和24h之間,ORP調(diào)控組的丙酮酸含量要高于空白對照組,這可能是由于通氣改變了丙酮酸到乙酰輔酶A的代謝流向。因為丙酮酸經(jīng)酶催化裂解形成乙酰輔酶A的代謝途徑有兩條,一條代謝途徑是丙酮酸經(jīng)丙酮酸脫氫酶復合體催化裂解生成乙酰輔酶A和CO2,另一條代謝途徑是丙酮酸經(jīng)嚴格厭氧的丙酮酸甲酸裂解酶催化生成甲酸和乙酰輔酶A[20],通空氣能夠抑制丙酮酸甲酸裂解酶活性從而使丙酮酸含量上升。另外,ORP調(diào)控條件下的發(fā)酵過程中,由于氧氣的脅迫導致胞內(nèi)海藻糖含量的提高。這一現(xiàn)象已在對釀酒酵母進行的乙醇發(fā)酵研究中得到驗證,在高乙醇濃度、高滲透壓、溶解氧和熱等外界脅迫條件下,釀酒酵母胞內(nèi)海藻糖含量也有提高[21-24]。

    圖5 空白對照組和ORP調(diào)控組發(fā)酵過程中糖酵解途徑中間化合物和海藻糖含量變化曲線

    3 結(jié) 論

    葡萄糖和果糖混合糖模擬菊芋塊為底物的丁醇發(fā)酵過程中存在的果糖利用率和丁醇產(chǎn)量低,有機酸積累過多等問題,其原因主要是菌體細胞內(nèi)還原力不足,發(fā)酵后期難以實現(xiàn)產(chǎn)酸期向產(chǎn)溶劑期的轉(zhuǎn)變,致使發(fā)酵體系有機酸尤其是丁酸過量積累,最終導致發(fā)酵提前終止。本工作采取ORP調(diào)控的方式調(diào)節(jié)以葡萄糖和果糖混合糖為底物的丁醇發(fā)酵過程,通過改變發(fā)酵過程中細胞內(nèi)還原力水平,能量狀態(tài)和碳源代謝流向,實現(xiàn)對發(fā)酵過程調(diào)控,使發(fā)酵終點丁醇濃度由ORP調(diào)控前的3.39g/L提高到11.65g/L。研究結(jié)果證明ORP調(diào)控是一種簡單而有效的丁醇發(fā)酵工藝優(yōu)化策略,能夠有效緩解以葡萄糖和果糖混合糖為底物的丁醇發(fā)酵過程中出現(xiàn)的“酸崩潰”現(xiàn)象。

    [1] Du C,Yan H,Zhang Y,et al.Use of oxidoreduction potential as an indicator to regulate 1,3-propanediol fermentation byKlebsiellapneumoniae[J].Applied MicrobiologyandBiotechnology,2006,69(5):554-563.

    [2] Sheu D C,Duan K J,Jou S R,et al.Production of xylitol fromCandidatropicalisby using an oxidation-reduction potential-stat controlled fermentation[J].Biotechnology Letters,2003,25(24):2065-2069.

    [3] Chen F,F(xiàn)eng X H,Liang J F,et al.An oxidoreduction potential shift control strategy for high purity propionic acid production byPropionibacteriumfreudenreichiiCCTCC M207015with glycerol as sole carbon source[J].BioprocessandBiosystemsEngineering,2013,36(9):1165-1176.

    [4] 鄭繼岱,徐國謙,儲炬,等.利用氧化還原電位調(diào)控乳酸發(fā)酵[J].生物加工過程,2008,5(6):73-77.

    [5] Wang S,Zhu Y,Zhang Y,et al.Controlling the oxidoreduction potential of the culture ofClostridium acetobutylicumleads to an earlier initiation of solventogenesis,thus increasing solvent productivity[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2012,93(3):1021-1030.

    [6] Ishizaki A,Shibai H,Hirose Y.Basic aspects of electrode potential change in submerged fermentation[J].AgriculturalandBiologicalChemistry,1974,38:2399-2405.

    [7] Li J,Jiang M,Chen K Q,et al.Effect of redox potential regulation on succinic acid production byActinobacillus succinogenes[J].BioprocessandBiosystemsEngineering,2010,33(8):911-920.

    [8] De Graef M R,Alexeeva S,Snoep J L,et al.The steadystate internal redox state(NADH/NAD)reflects the external redox state and is correlated with catabolic adaptation inEscherichiacoli[J].Journalof Bacteriology,1999,181(8):2351-2357.

    [9] Elliott S J,Léger C,Pershad H R,et al.Detection and interpretation of redox potential optima in the catalytic activity of enzymes[J].BiochimicaetBiophysicaActa(BBA):Bioenergetics,2002,1555(1):54-59.

    [10] Margaritis A,Bajpai P,Cannell E.Optimization studies for the bioconversion of Jerusalem artichoke tubers to ethanol and microbial biomass[J].BiotechnologyLetters,1981,3(10):595-599.

    [11] 陳曉明,金征宇.菊粉降解生產(chǎn)低聚果糖[J].飼料工業(yè),2000,21(11):29-31.

    [12] Fond O,Matta-Ammouri G,Petitdemange H,et al.The role of acids on the production of acetone and butanol byClostridiumacetobutylicum[J].AppliedMicrobiology andBiotechnology,1985,22(3):195-200.

    [13] Herrero A A,Gomez R F,Snedecor B,et al.Growth inhibition ofClostridiumthermocellumby carboxylic acids:a mechanism based on uncoupling by weak acids[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology,1985,22(1):53-62.

    [14] Huesemann M,Papoutsakis E T.Effect of acetoacetate,butyrate,and uncoupling ionophores on growth and product formation ofClostridiumacetobutylicum[J].Biotechnology Letters,1986,8(1):37-42.

    [15] 鄧攀,陳麗杰,辛程勛,等.果糖及葡萄糖混合物為底物的丙酮 丁 醇 發(fā) 酵[J].生 物 工 程 學 報,2011,27(10):1448-1456.

    [16] Maddox I S,Steiner E,Hirsch S,et al.The cause of“acid crash”and“acidogenic fermentations”during the batch acetone-butanol-ethanol(ABE-)fermentation process[J].JournalofMolecularMicrobiologyandBiotechnology,2000,2(1):95-100.

    [17] Peguin S,Goma G,Delorme P,et al.Metabolic flexibility ofClostridiumacetobutylicumin response to methyl viologen addition[J].AppliedMicrobiologyand Biotechnology,1994,42(4):611-616.

    [18] Huang L,Gibbins L N,F(xiàn)orsberg C W.Transmembrane pH gradient and membrane potential inClostridium acetobutylicumduring growth under acetogenic and solventogenic conditions[J].AppliedandEnvironmental Microbiology,1985,50(4):1043-1047.

    [19] Kawasaki S,Sakai Y,Takahashi T,et al.O2and reactive oxygen species detoxification complex,composed of O2-responsive NADH:Rubredoxin oxidoreductase-flavoprotein A2-desulfoferrodoxin operon enzymes,rubperoxin,and rubredoxin,inClostridiumacetobutylicum[J].Appliedand EnvironmentalMicrobiology,2009,75(4):1021-1029.

    [20] N?lling J,Breton G,Omelchenko M V,et al.Genome sequence and comparative analysis of the solvent-producing bacteriumClostridiumacetobutylicum[J].Journalof Bacteriology,2001,183(16):4823-4838.

    [21] 申渝,葛旭萌,李寧,等.高濃度乙醇連續(xù)發(fā)酵振蕩過程中代謝通量分析及誘發(fā)機理[J].化工學報,2009(6):1519-1528.

    [22] Sharma S C.A possible role of trehalose in osmotolerance and ethanol tolerance inSaccharomycescerevisiae[J].FEMSMicrobiologyLetters,1997,152(1):11-15.

    [23] Benaroudj N,Lee D H,Goldberg A L.Trehalose accumulation during cellular stress protects cells and cellular proteins from damage by oxygen radicals[J].Journalof BiologicalChemistry,2001,276(26):24261-24267.

    [24] Hottiger T,Virgilio C,Hall M N,et al.The role of trehalose synthesis for the acquisition of thermotolerance in yeast[J].EuropeanJournalofBiochemistry,1994,219(1-2):187-193.

    猜你喜歡
    丁醇輔酶有機酸
    國家藥監(jiān)局關于修訂輔酶Q10注射劑說明書的公告(2022年第11號)
    中老年保健(2022年4期)2022-08-22 02:58:30
    關注新生兒有機酸血癥
    金銀花總有機酸純化工藝的優(yōu)化
    中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:12:15
    前列地爾聯(lián)合復合輔酶治療急性腎損傷的療效探討
    結(jié)核分枝桿菌耐乙胺丁醇分子機制的研究進展
    白茶中的有機酸高效液相色譜分析方法的建立
    益腎活血湯聯(lián)合輔酶Q10膠囊治療弱精子癥50例
    低溫濃醪發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇新工藝研究
    河南科技(2014年12期)2014-02-27 14:10:24
    添加有機酸加速2,4,6-三氯酚的生物降解
    輔酶Q10,還原型的更好
    健康之家(2013年6期)2013-04-29 00:44:03
    亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 日韩中字成人| 一个人免费在线观看的高清视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产精品伦人一区二区| 亚洲成av人片在线播放无| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 18+在线观看网站| 人人妻人人看人人澡| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产高清三级在线| 观看免费一级毛片| 又爽又黄a免费视频| 国产毛片a区久久久久| 成人国产一区最新在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| av女优亚洲男人天堂| 国产综合懂色| 亚洲专区国产一区二区| 香蕉av资源在线| 欧美zozozo另类| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 看黄色毛片网站| 国产免费一级a男人的天堂| 高清日韩中文字幕在线| 给我免费播放毛片高清在线观看| 久久性视频一级片| aaaaa片日本免费| 久久伊人香网站| 亚洲欧美日韩东京热| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 90打野战视频偷拍视频| 色视频www国产| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 国产精品久久电影中文字幕| 一级黄色大片毛片| 99热只有精品国产| 麻豆国产av国片精品| 久久国产精品人妻蜜桃| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久人人爽人人爽人人片va | 99久久九九国产精品国产免费| 欧美日本亚洲视频在线播放| av视频在线观看入口| 男人狂女人下面高潮的视频| 日韩精品中文字幕看吧| 国产免费av片在线观看野外av| 久久久久久久精品吃奶| 精品久久久久久久久久久久久| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 免费av毛片视频| 亚洲精华国产精华精| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 黄色一级大片看看| 免费av毛片视频| 欧美成人性av电影在线观看| 一本一本综合久久| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲人与动物交配视频| 在线看三级毛片| 亚洲,欧美,日韩| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲国产精品sss在线观看| 99国产综合亚洲精品| 久久99热6这里只有精品| 麻豆一二三区av精品| 国产精品不卡视频一区二区 | 中出人妻视频一区二区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 色视频www国产| 午夜福利成人在线免费观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲av五月六月丁香网| 在线免费观看的www视频| 午夜老司机福利剧场| 亚洲第一电影网av| 三级国产精品欧美在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| .国产精品久久| 99久久精品热视频| 午夜免费激情av| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久香蕉精品热| 美女黄网站色视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 麻豆一二三区av精品| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲激情在线av| 日韩欧美精品免费久久 | 午夜福利免费观看在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产毛片a区久久久久| 欧美bdsm另类| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲电影在线观看av| 欧美黑人欧美精品刺激| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产男靠女视频免费网站| 18禁在线播放成人免费| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 99久久九九国产精品国产免费| 草草在线视频免费看| 18美女黄网站色大片免费观看| 级片在线观看| 国内精品美女久久久久久| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品亚洲美女久久久| eeuss影院久久| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美最黄视频在线播放免费| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 搡老妇女老女人老熟妇| 高清在线国产一区| 国产免费一级a男人的天堂| 九九热线精品视视频播放| 99久久精品国产亚洲精品| 国产免费男女视频| 精品乱码久久久久久99久播| 热99re8久久精品国产| 色5月婷婷丁香| 亚洲成人中文字幕在线播放| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲在线自拍视频| 精品久久久久久,| 亚洲黑人精品在线| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产高清视频在线播放一区| 一个人免费在线观看电影| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产精品一区二区性色av| 久久久久久久午夜电影| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产黄片美女视频| 国产一区二区激情短视频| 麻豆av噜噜一区二区三区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产亚洲精品久久久com| av专区在线播放| 最好的美女福利视频网| 日韩欧美精品免费久久 | 69人妻影院| 亚洲国产精品久久男人天堂| 悠悠久久av| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产老妇女一区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 日韩精品中文字幕看吧| 床上黄色一级片| 桃色一区二区三区在线观看| 国产视频一区二区在线看| 九色成人免费人妻av| 日本黄色片子视频| 欧美日韩综合久久久久久 | 偷拍熟女少妇极品色| 国产精品久久电影中文字幕| 精品一区二区三区人妻视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 99热精品在线国产| 精品久久久久久,| 一边摸一边抽搐一进一小说| netflix在线观看网站| av欧美777| 久久午夜亚洲精品久久| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 丰满的人妻完整版| 最新在线观看一区二区三区| av天堂中文字幕网| 我要看日韩黄色一级片| 99热这里只有是精品50| www日本黄色视频网| 99riav亚洲国产免费| 欧美潮喷喷水| www.色视频.com| 午夜精品久久久久久毛片777| 成人永久免费在线观看视频| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲18禁久久av| 国产69精品久久久久777片| 欧美高清成人免费视频www| 黄色一级大片看看| 欧美中文日本在线观看视频| 看免费av毛片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 精品一区二区三区视频在线| 男女那种视频在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 69av精品久久久久久| 看免费av毛片| 免费av毛片视频| 日韩有码中文字幕| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲精品成人久久久久久| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲中文字幕日韩| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 有码 亚洲区| 欧美成人a在线观看| 久久草成人影院| 免费av观看视频| 91字幕亚洲| 成人特级av手机在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久国产精品影院| 男女之事视频高清在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 国产伦在线观看视频一区| 丰满的人妻完整版| 一级作爱视频免费观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品久久久久久精品电影| 国产成人av教育| 国产精品1区2区在线观看.| 久久久久久大精品| 国产高清三级在线| 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲av成人av| 国产免费av片在线观看野外av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲天堂国产精品一区在线| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲av成人av| 精品人妻熟女av久视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| av欧美777| 国产精品久久视频播放| 男人狂女人下面高潮的视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 午夜影院日韩av| 一级毛片久久久久久久久女| 男人狂女人下面高潮的视频| 757午夜福利合集在线观看| av在线观看视频网站免费| 精品久久国产蜜桃| 成人av在线播放网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久精品国产自在天天线| 久久亚洲真实| 高清在线国产一区| 久久精品91蜜桃| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 99久久成人亚洲精品观看| 欧美一区二区精品小视频在线| or卡值多少钱| 国产成人欧美在线观看| 亚洲av二区三区四区| 免费电影在线观看免费观看| 日韩亚洲欧美综合| 91九色精品人成在线观看| 亚洲美女黄片视频| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 国语自产精品视频在线第100页| 五月伊人婷婷丁香| 高清毛片免费观看视频网站| 免费人成在线观看视频色| 波多野结衣高清无吗| 亚洲av成人av| 麻豆成人午夜福利视频| 99久久精品一区二区三区| 日韩免费av在线播放| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲人成电影免费在线| 赤兔流量卡办理| 一级a爱片免费观看的视频| 十八禁人妻一区二区| 国产精品99久久久久久久久| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲人成网站高清观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久午夜福利片| 欧美日本视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 久久久精品大字幕| 精华霜和精华液先用哪个| 成人午夜高清在线视频| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品一及| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美日韩综合久久久久久 | 成年版毛片免费区| 欧美午夜高清在线| 欧美3d第一页| 日韩欧美 国产精品| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 无人区码免费观看不卡| 成人美女网站在线观看视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲自偷自拍三级| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 9191精品国产免费久久| 国产真实伦视频高清在线观看 | 麻豆成人午夜福利视频| 九九在线视频观看精品| 中亚洲国语对白在线视频| 99国产精品一区二区三区| 一个人免费在线观看的高清视频| 赤兔流量卡办理| 天堂√8在线中文| 天堂影院成人在线观看| 香蕉av资源在线| 亚洲久久久久久中文字幕| 深夜a级毛片| 在线免费观看不下载黄p国产 | 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 老女人水多毛片| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 成人鲁丝片一二三区免费| 午夜福利高清视频| 国产真实乱freesex| 99久久九九国产精品国产免费| 波多野结衣高清作品| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产精品三级大全| 成人无遮挡网站| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产久久久一区二区三区| 国产乱人伦免费视频| 嫩草影院新地址| 午夜日韩欧美国产| 九九热线精品视视频播放| 99精品在免费线老司机午夜| 国产成人福利小说| 色综合站精品国产| 中出人妻视频一区二区| www日本黄色视频网| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 成人国产综合亚洲| 老鸭窝网址在线观看| 黄色一级大片看看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲av二区三区四区| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产成人av教育| 十八禁人妻一区二区| av在线老鸭窝| 国产精品影院久久| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲自拍偷在线| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲精品一区av在线观看| 日本 欧美在线| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 欧美在线黄色| 美女高潮的动态| 神马国产精品三级电影在线观看| 一级黄片播放器| 波多野结衣高清无吗| 三级毛片av免费| 好男人电影高清在线观看| 久久久国产成人免费| 人妻夜夜爽99麻豆av| 男人的好看免费观看在线视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 老司机深夜福利视频在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 黄色一级大片看看| 97热精品久久久久久| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲五月婷婷丁香| 色哟哟哟哟哟哟| 麻豆国产av国片精品| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 免费在线观看影片大全网站| 热99re8久久精品国产| 男人舔奶头视频| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 舔av片在线| 高清在线国产一区| 国产精品一区二区性色av| 最近视频中文字幕2019在线8| 欧美高清性xxxxhd video| 国产三级中文精品| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久久久久久久中文| 免费av毛片视频| 国产单亲对白刺激| 亚洲专区中文字幕在线| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲 国产 在线| 免费在线观看亚洲国产| 久久国产乱子伦精品免费另类| 99热这里只有是精品在线观看 | 女人十人毛片免费观看3o分钟| 内射极品少妇av片p| 两个人视频免费观看高清| 成年版毛片免费区| 中国美女看黄片| 欧美区成人在线视频| 99riav亚洲国产免费| 国产午夜福利久久久久久| 久久午夜亚洲精品久久| 97碰自拍视频| 免费看日本二区| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲av美国av| 亚洲欧美精品综合久久99| 人人妻人人澡欧美一区二区| 三级毛片av免费| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 性插视频无遮挡在线免费观看| 中文资源天堂在线| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美中文日本在线观看视频| 日韩免费av在线播放| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美在线黄色| 亚洲av免费高清在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 精品一区二区三区av网在线观看| 全区人妻精品视频| 久久久久久久精品吃奶| 丁香六月欧美| www.色视频.com| 亚洲欧美精品综合久久99| 男人舔奶头视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 激情在线观看视频在线高清| 国产一区二区激情短视频| 久久久久久国产a免费观看| 久久人妻av系列| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲无线观看免费| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 欧美日韩综合久久久久久 | 欧美成人一区二区免费高清观看| 999久久久精品免费观看国产| 精品人妻熟女av久视频| 成人三级黄色视频| av黄色大香蕉| 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美乱色亚洲激情| 成人无遮挡网站| 麻豆久久精品国产亚洲av| 美女 人体艺术 gogo| 色在线成人网| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲精品色激情综合| 免费在线观看日本一区| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区久久| 久久精品影院6| 精品久久久久久成人av| 久久人人精品亚洲av| 国产成人av教育| 精品一区二区三区人妻视频| 久久午夜福利片| 天天一区二区日本电影三级| 欧美一区二区亚洲| 日韩欧美在线乱码| 成人特级av手机在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲精品色激情综合| 国产综合懂色| 亚洲av.av天堂| 国产大屁股一区二区在线视频| 免费看a级黄色片| 午夜a级毛片| 男人和女人高潮做爰伦理| 成人特级黄色片久久久久久久| 最后的刺客免费高清国语| 看十八女毛片水多多多| 日本免费a在线| 精品久久久久久久久久免费视频| 中文字幕av在线有码专区| 久久久成人免费电影| www.熟女人妻精品国产| 最新中文字幕久久久久| 成人鲁丝片一二三区免费| 男人舔奶头视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 久久久久久九九精品二区国产| 久久久色成人| 麻豆久久精品国产亚洲av| 俺也久久电影网| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 在线观看午夜福利视频| .国产精品久久| 午夜老司机福利剧场| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲专区中文字幕在线| 久9热在线精品视频| 一区二区三区激情视频| a在线观看视频网站| av天堂中文字幕网| 国产精品久久视频播放| 又紧又爽又黄一区二区| 成人无遮挡网站| 欧美区成人在线视频| a在线观看视频网站| 久久香蕉精品热| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产精品永久免费网站| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产黄片美女视频| 无人区码免费观看不卡| 久久99热这里只有精品18| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 1000部很黄的大片| 色av中文字幕| 国产三级黄色录像| 国产乱人伦免费视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 精品国产三级普通话版| 国产精品野战在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久精品国产亚洲av天美| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美xxxx性猛交bbbb| 婷婷六月久久综合丁香| 18+在线观看网站| 最后的刺客免费高清国语| 国产av在哪里看| 欧美国产日韩亚洲一区| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲经典国产精华液单 | 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产老妇女一区| 国产亚洲欧美98| 亚洲av免费在线观看| 日韩国内少妇激情av| 亚洲成av人片免费观看| 精品久久久久久久久亚洲 | ponron亚洲| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 一个人免费在线观看的高清视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲专区国产一区二区| 午夜免费激情av| 1000部很黄的大片| 最新在线观看一区二区三区| 97超视频在线观看视频| 国产免费男女视频| 亚洲欧美日韩高清专用| av欧美777| 午夜日韩欧美国产| 亚洲五月婷婷丁香| 婷婷色综合大香蕉| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲精品影视一区二区三区av| 欧美又色又爽又黄视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| 日日干狠狠操夜夜爽| 日韩人妻高清精品专区| 国产在视频线在精品| 观看美女的网站| 日韩欧美 国产精品| 久久伊人香网站| av在线天堂中文字幕| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲专区国产一区二区| 成年免费大片在线观看| 免费高清视频大片| 国产精品1区2区在线观看.| 久久99热6这里只有精品| 亚洲18禁久久av| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲人与动物交配视频| 免费电影在线观看免费观看| 日本熟妇午夜| 国产成人av教育| 亚洲,欧美精品.| 757午夜福利合集在线观看| 日本一二三区视频观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| а√天堂www在线а√下载| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲第一区二区三区不卡| 精品久久久久久成人av| 听说在线观看完整版免费高清| 精品一区二区三区人妻视频| 国产久久久一区二区三区| 免费观看人在逋| 在线观看av片永久免费下载| 老女人水多毛片| 日韩av在线大香蕉| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲人成网站高清观看|