exendin-4預(yù)處理對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響

魯佳佳，胡笑容，胡鋼英，江洪

論著·基礎(chǔ)

exendin-4預(yù)處理對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響

魯佳佳，胡笑容，胡鋼英，江洪

目的探討exendin-4(Ex-4)預(yù)處理對大鼠缺血/再灌注(I/ R)損傷的影響。方法雄性SD大鼠55只隨機分為4組：假手術(shù)組(SO)(n=10), 缺血/再灌注(I/R)組(n=15),Ex-4+I/R (Ex-4-I/R)組(n=15), Ex-4+ exendin (9-39)[Ex-4-Ex(9-39)-I/R]組(n=15)。除SO組外，其余3組大鼠均行冠狀動脈左前降支結(jié)扎，缺血30 min后再灌4 h，Ex-4-I/R組在I/R前給予Ex-4預(yù)處理，Ex-4-Ex(9-39)-I/R組在I/R前給予Ex-4和Ex(9-39)預(yù)處理。再灌注4h后進行心肌梗死面積評估，并取頸動脈血進行心肌酶、心肌氧化指標(biāo)、心肌高遷移率族蛋白1(HMGB1)水平檢測。結(jié)果缺血再灌注4h后，與I/R組比較，Ex-4-I/R組心肌梗死面積減少，分別為(54.1±3.0)%和(25.8±1.0)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Ex-4-I/R組比較，Ex-4-Ex(9-39)-I/R組心肌梗死面積增大，為(47.8±3.0)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與SO組比較，I/R組LDH、CK、MDA水平明顯增加，HMGB1表達明顯升高(P<0.05)，而SOD水平明顯下降(P<0.05)；與I/R組比較，Ex-4-I/R組各項指標(biāo)明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Ex-4-I/R組比較，Ex-4-Ex(9-39)-I/R組中各項指標(biāo)的改善均被抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論Ex-4預(yù)處理可能通過抑制HMGB1的表達進而減輕大鼠心肌I/R損傷。

exendin-4；心肌缺血/再灌注；高遷移率族蛋白1；大鼠

高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)是一類廣泛分布在高等真核生物細(xì)胞核內(nèi)的非染色體核蛋白，它能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄并且維持核小體的結(jié)構(gòu)。HMGB1可以由壞死細(xì)胞、凋亡細(xì)胞釋放，也可以由固有免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞)釋放[1，2]。HMGB1已經(jīng)在一些心血管疾病中被確定為一種促炎性細(xì)胞因子[3～5]。近期發(fā)現(xiàn)HMGB1如同一些經(jīng)典的早期促炎性細(xì)胞因子——腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)一樣，作為早期炎性介質(zhì)在心肌缺血/再灌注(I/R)中發(fā)揮作用，并能促進TNF-α和IL-6的釋放。然而HMGB1的A盒(一種HMGB1的特異性拮抗劑)能抑制TNF-α和IL-6的釋放，減輕心肌的I/R損傷[6]。炎性反應(yīng)被認(rèn)為是心肌I/R損傷的一個關(guān)鍵性因素[7，8]。這些結(jié)果表明，HMGB1在心肌I/R損傷中發(fā)揮重要作用。

胰升糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)，是一種在進食后受到營養(yǎng)素刺激而由小腸內(nèi)L細(xì)胞分泌的腸道促胰島激素，已經(jīng)被證實可以在2型糖尿病(DM)血糖調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[9]。exendin-4 (Ex-4)是1種針對GLP-1受體的激動劑，由39個氨基酸組成，已經(jīng)證實它能激活GLP-1受體，增加胰腺腺泡細(xì)胞胞內(nèi)cAMP濃度，同時對(VIP)受體沒有影響，它有著和GLP-1類似的功能。越來越多的證據(jù)表明，不管是在動物模型還是患者的心血管疾病中，包括心肌I/R，GLP-1和Ex-4都具有顯著的有益作用[10～13]。最近，Cai等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Ex-4能抑制心肌細(xì)胞在高糖條件下誘導(dǎo)的HMGB1表達。因此，我們推測，Ex-4通過抑制HMGB1表達可以預(yù)防心肌I/R損傷。本研究主要是通過大鼠心肌I/R模型，探討Ex-4預(yù)處理是否能抑制心肌I/R損傷。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物： SPF級雄性SD大鼠55只(武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供)，體質(zhì)量250～300 g，實驗過程中動物飼養(yǎng)及取材均按照實驗動物管理和保護的有關(guān)規(guī)定進行。術(shù)前12 h禁食、不禁飲。大鼠55只隨機分為4組：假手術(shù)組(SO，n=10), 缺血/再灌注(I/R)組(n=15),Ex-4+I/R(Ex-4-I/R)組(n=15),Ex-4+exendin(9-39)[Ex-4-Ex(9-39)-I/R]組(n=15)。(2)藥物及試劑：3%戊巴比妥鈉，Ex-4、Ex(9-39) (GLP-1受體拮抗劑，購自美國Sigma公司)。儀器：Biopac多導(dǎo)生理記錄儀、計算機圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro Plus3.0，Media Cyerneties公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型建立： 用3%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔麻醉大鼠。麻醉成功后，取仰位固定，氣管插管連接動物呼吸機，頻率70次/min，潮氣量3～4 ml/100 g。用不銹鋼電極插入大鼠四肢皮下，連接，持續(xù)記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖。沿胸骨左緣第3～4肋間打開胸腔，暴露心室前壁，剪開心包膜，在左心耳與肺動脈圓錐之間穿入5-0絲線，結(jié)扎左冠狀動脈前降支(LAD)，結(jié)扎時先打一松結(jié)，松結(jié)內(nèi)墊一帶凹槽的空心乳膠管，待心電圖恢復(fù)穩(wěn)定后，在凹槽處拉緊圍繞在乳膠管上的結(jié)扎線以壓迫LAD，結(jié)扎后心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST段明顯上抬及心臟表面相應(yīng)區(qū)域由紅潤變?yōu)樽辖C和蒼白表明缺血成功；結(jié)扎30 min后沿凹槽剪斷結(jié)扎線，取出乳膠管，再灌注4 h。以ST段回落1/2以上、心臟表面缺血區(qū)發(fā)紺變紅表明心肌組織再灌注成功。SO組：LAD下穿線，不結(jié)扎血管。I/R組：LAD結(jié)扎30 min后再灌注4 h。Ex-4-I/R組：LAD結(jié)扎前1 h，大鼠經(jīng)Ex-4(5 μg/kg, 溶于無菌生理鹽水靜脈注射)，處理[15，16]，再結(jié)扎LAD 30 min后再灌注4 h。Ex-4-Ex(9-39)-I/R組：LAD結(jié)扎前1 h，經(jīng)Ex-4 (5 μg/kg, 溶于無菌生理鹽水靜脈注射)和Ex(9-39)(5 μg/kg, 溶于無菌生理鹽水靜脈注射)預(yù)處理[17]，再結(jié)扎LAD 30 min后再灌注4 h。

1.2.2 心肌梗死面積評估： 再灌注4 h后，將LAD原位重新結(jié)扎，經(jīng)股靜脈注射1.5%伊文思藍(lán)染料2 ml，待缺血區(qū)顯示清晰后立即摘取心臟，冰PBS液沖洗后，立即置于-20℃冰箱中冷凍15 min，繼之沿垂直心臟左室長軸切成厚為1～2 mm的心肌切片，置入1% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液(TTC溶液，TTC溶于濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液PBS，pH 7.4)中，37℃避光恒溫孵育20 min[18]。存活心肌被TTC染成紅色 ，而梗死心肌為白色。孵育結(jié)束后，取出心肌組織在透明紙上描出輪廓，掃描后輸入計算機圖像分析系統(tǒng)，測定梗死區(qū)與缺血區(qū)(左心室的區(qū)域)面積。計算梗死區(qū)和缺血區(qū)面積百分比來評估心肌梗死面積。

1.3 觀測項目

1.3.1 心肌酶檢測： 再灌注4 h后，經(jīng)頸動脈取血2 ml，以3 000 r/min離心15 min，提取上清，保持在-20℃直至分析。根據(jù)試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書，測定血清乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的表達水平。

1.3.2 心肌氧化指標(biāo)檢測： 取缺血區(qū)心肌組織，按試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書測定心肌組織中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，分別作為心肌組織中氧自由基和脂質(zhì)過氧化物水平指標(biāo)。

1.3.3 心肌HMGB1的測定： 參照文獻[19]，取缺血區(qū)心肌組織，使用HMGB1抗體(Santa Cruz，USA)檢測HMGB1含量，用定量免疫印跡法進行分析。以GAPDH表達作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，計算HMGB1表達的相對量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件包進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間比較采用t檢驗；單因素方差分析或Welch檢驗用于多組間比較；LSD檢驗或 Dunnett-t檢驗用于多組間兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌梗死面積 再灌注4 h后心肌梗死面積，與I/R組(54.1±3.0)%比較，Ex-4-I/R組(25.8±1.0)%可降低大鼠心肌I/R所誘發(fā)的心肌梗死面積(P<0.05)；Ex-4-Ex(9-39)-I/R組為(47.8±3.0)%，與Ex-4-I/R組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明Ex(9-39)抑制了Ex-4在心肌梗死面積上的保護作用。

2.2 LDH和CK水平 再灌注4 h后，與SO組比較，I/R組LDH和CK水平明顯增加(P<0.05)，與I/R組比較，Ex-4-I/R組LDH和CK水平下降(P<0.05)；與Ex-4-I/R組比較，Ex-4-Ex(9-39)-I/R組水平又上升(P<0.05)，Ex(9-39)抑制了Ex-4在心肌酶上的保護作用。見表1。

表1 各組大鼠LDH和CK表達水平的比較

注：與SO組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05；與Ex-4-I/R組比較，cP<0.05

2.3 MDA和SOD水平 再灌注4 h后，與SO組相比，I/R組MDA的水平明顯增加，而SOD水平明顯下降(均P<0.05)；與I/R組比較，Ex-4-I/R組MDA含量的下降、SOD含量增加(P<0.05)；與Ex-4-I/R組比較，Ex-4-Ex(9-39)-I/R組MDA含量增加，SOD含量下降，表明Ex(9-39)抑制了Ex-4在氧化應(yīng)激方面的作用。見表2。

表2 Ex-4預(yù)處理對MDA和SOD表達水平的影響

注：與SO組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05；與Ex-4-I/R組比較，cP<0.05

2.4 HMGB1的表達 再灌注4 h后，與SO組(0.098±0.018)相比，I/R組HMGB1(0.327±0.026)表達明顯升高(P<0.05)；與I/R組比較，Ex-4-I/R組表達明顯下降(0.149±0.013)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Ex-4-I/R組比較，Ex-4-Ex(9-39)-I/R組(0.279±0.023)顯著升高，說明Ex(9-39)抑制了Ex-4在HMGB1表達上的保護作用。見圖1。

注：1.SO組；2.I/R組；3.Ex-4-I/R組；4.Ex-4-Ex(9-39)-I/R組

3 討 論

研究表明，GLP-1和GLP-1受體激動劑能減輕心肌I/R損傷，改善心功能[10～12,20]。炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡在心肌I/R損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Bose等[21]研究首次闡明了GLP-1在完整大鼠離體心臟中對抗心肌梗死的作用，提出GLP-1可能通過激活多種激酶如蛋白激酶A、磷酸肌醇3激酶(PI3K)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等抑制心肌細(xì)胞的凋亡，從而保護心肌。Hu等[22]研究表明，HMGB1可以促進心肌細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性。Zhu等[23]等發(fā)現(xiàn)，HMGB1經(jīng)HMGB1-TLR4-IL-23-IL-17A軸，通過巨噬細(xì)胞-γδT細(xì)胞—中性粒細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng)，加劇炎性反應(yīng)，同時促進細(xì)胞凋亡，從而影響再灌注損傷。HMGB1拮抗劑能減輕心肌I/R損傷，抑制早期促炎細(xì)胞因子，如TNF-α和IL-6的釋放，表明抑制HMGB1的表達能抑制炎性反應(yīng)，減輕心肌I/R損傷。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ex-4-I/R組較I/R組大鼠的心肌梗死面積明顯縮小，LDH、CK水平明顯降低，減輕心肌I/R損傷。同時，發(fā)現(xiàn)Ex-4-I/R組較I/R組HMGB1的表達量也明顯降低。同時，使用GLP-1受體拮抗劑會抑制Ex-4對心肌I/R損傷的保護作用和減弱對HMGB1表達的抑制作用。因此，我們推測Ex-4可能通過抑制HMGB1表達抑制炎性反應(yīng)，減輕心肌I/R損傷。

此外，氧化應(yīng)激是造成心肌缺血再灌注損傷的另一個重要機制，它能導(dǎo)致心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)損傷和功能代謝障礙。Tang等[24]報道，過氧化氫能夠刺激巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放HMGB1，加重微血管損傷。又有研究表明，抗氧化劑可以抑制HMGB1表達，通過抗炎、抗氧化應(yīng)激減輕肝臟再灌注損傷[25]，進一步表明抑制活性氧可抑制HMGB1表達。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ex-4-I/R組較I/R組的MDA水平明顯降低、SOD水平顯著升高。提示Ex-4可能通過抑制I/R引起的氧化應(yīng)激，進而抑制HMGB1的表達，最終減輕心肌I/R損傷。

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Effectsofpreconditioningwithexendin-4onmyocardialischemia/reperfusioninjuryinrats

LUJiajia,HUXiaorong,HUGangying,JIANGHong.

DepartmentofCardiology,RenminHospital,WuhanUniversity,Wuhan430060,China

JIANGHong，E-mail:jianghwurm@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of exendin 4 (Ex-4) preconditioning on rat ischemia/reperfusion (I/ R) damage.MethodsFifty-five male SD rats were randomly divided into 4 groups: sham operation group (SO) (n=10), ischemia / reperfusion (I/R) group (n=15),EX4+I/R (Ex-4-I/R) group (n=15), Ex-4+exendin (9-39)[Ex-4-Ex(9-39)-I/R] group (n=15). Except SO group, the other 3 group rats underwent left anterior descending coronary artery ligation, after 30 min ischemia, reperfusion of 4 h, Ex-4-I/R group was given Ex-4 before I/R pretreatment, Ex-4-Ex(9-39)-I/R group was given Ex-4 and Ex-(9-39) preconditioning before I/R group. After reperfusion for 4h, then assessed of the myocardial infarction area, and get the carotid artery blood sample to test the myocardial enzyme, myocardial oxidative index, myocardial high mobility group protein 1 (HMGB1) levels.Results4h after reperfusion, compared with group I/R, Ex-4-I/R group reduced myocardial infarct size more obviously, (54.1±3)% and (25.8±1)% respectively, the difference was statistically significant (P<0.05) compared with Ex-4-I/R group, Ex-4-Ex(9-39)-I/R group myocardial infarction area increases, as of (47.8±3.0)%,the difference was statistically significant (P<0.05).Compared with SO group, I/R group's LDH, CK, MDA levels were significantly increased, HMGB1 expression was significantly increased (P<0.05), and SOD level decreased significantly (P<0.05); compared with I/R group, Ex-4-I/R group's indicators improved significantly, the difference was statistically significant (P<0.05); compared with the Ex-4-I/R group, Ex-4-Ex(9-39)-I/R group's indicators improvement were suppressed, the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionIt demonstrated that the Ex-4 preconditioning may inhibit the expression of HMGB1 and reduce the myocardial I/R injury in rats.

exendin-4;Myocardial ischemia/reperfusion injury;High mobility group protein 1;Rats

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81100146，No.81370308)

430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科

江洪，E-mail:jianghwurm@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.07.018

2014-04-13)