滅活HIV-1顆粒引發(fā)小膠質(zhì)細胞鈣離子內(nèi)流和NF-κB核轉(zhuǎn)位的研究*

黃秀艷， 曾耀英

(暨南大學免疫生物學系，廣東 廣州 510632)

在未使用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus， HIV)疾病之前(從HIV感染到獲得性免疫缺陷綜合征發(fā)病的整個進程)，大約有20%～30%的患者出現(xiàn)一系列的認知和運動障礙癥狀，其中包括短期記憶受損、注意力降低和腿軟等，統(tǒng)稱為HIV相關性失智癥(HIV-associated dementia, HAD)。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapies, HARRT)可使HAD的發(fā)病率降低到10%，這可能與HARRT使患者血液病毒復制得到控制從而降低了血漿病毒載量有關。但是，輕型認知障礙(mild neurocognitive disorder, MND)和無癥狀認知損害(asymptomatic neurocognitive impairment, ANI)則成為HIV-1(下文省略為HIV)感染時的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)主要并發(fā)癥[1-3]。對于HIV感染所致的神經(jīng)退行性病變的發(fā)生機制，人們首先想到的是神經(jīng)細胞可能因為HIV感染而出現(xiàn)結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙，然而神經(jīng)細胞不表達HIV感染所必需的CD4分子，到目前為止沒有證據(jù)表明其能被HIV感染。因此，排除神經(jīng)細胞丟失是由于HIV直接感染而導致的。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，能夠被HIV感染細胞只有腦內(nèi)血管旁巨噬細胞(perivascular macrophage)和小膠質(zhì)細胞(microglia)，因為它們才表達HIV-1入胞所必需的受體和共受體[2-3]。目前普遍認為，HIV感染小膠質(zhì)細胞引起神經(jīng)細胞損害的可能機制包括：HIV編碼的蛋白直接誘導神經(jīng)細胞凋亡；HIV引發(fā)的炎癥介質(zhì)而導致神經(jīng)細胞死亡。以下事實使我們推測HIV顆粒(HIV particles，HIVp)可能參與了HAD的發(fā)?。篐AD常見于治療不成功或沒有接受HARRT的晚期HIV感染者，說明HAD的發(fā)作與血漿高病毒載量密切相關；HIV 糖蛋白gp120能活化人小膠質(zhì)細胞[4-5]。最值得思考的是，HIVp除了包含病毒自身編碼的蛋白外，還包含大量的宿主蛋白，而且這些宿主蛋白是有某些生物學功能的，是由于進化壓力而整合到病毒顆粒中的(為了成功地復制，HIV必須逃脫宿主的免疫系統(tǒng)并借用宿主的代謝系統(tǒng)，而宿主則進化了一整套清除HIV的機制，這些宿主蛋白就是病毒和宿主相互作用留下的痕跡)[6]。對于病毒表面的宿主蛋白是否具有致病性目前尚所知甚少。為此，我們將HIVp和gp120所引發(fā)的小膠質(zhì)細胞鈣內(nèi)流效應進行對比研究，以闡明HIVp在HAD發(fā)病中的作用機制。

NF-κB是細胞內(nèi)最為重要的核轉(zhuǎn)錄因子，它參與調(diào)控細胞對應激的反應，尤其在調(diào)制感染免疫應答中起著中心作用。其活性的重要評價指標是發(fā)生核轉(zhuǎn)位(nuclear translocation)，而小膠質(zhì)細胞中NF-κB由胞漿轉(zhuǎn)到胞核是細胞活化的重要標志[7]。為此，本研究將NF-κB作為評價HIVp引起小膠質(zhì)細胞活化的參數(shù)之一。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細胞 原代人小膠質(zhì)細胞由本實驗室培養(yǎng)純化后冷凍保存[8]。H9/HIV-1IIIB細胞系由南方醫(yī)科大學免疫教研室惠贈；滅活HIV-1SF162由香港大學微生物系惠贈；C8166細胞系由中國科學院昆明動物研究所分子免疫室惠贈。

1.2試劑和儀器 離心管、培養(yǎng)瓶、吸管和培養(yǎng)板均為Corning產(chǎn)品；青霉素和鏈霉素、無Ca2+和Mg2+的HBSS液、Trypsin-EDTA、DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)購自HyClone；離子霉素(ionomycin，Ion)和2,2’-二硫二吡啶(2,2’-dithiodipyridine;商品名AldrithiolTM-2，AT-2)購自Sigma-Aldrich；HIV-1MNgp120重組蛋白(gp120-X4)購自ABI；HIV-1SF162gp120重組蛋白(gp120-R5)購自北京博菲康生物技術(shù)有限公司。25 mm直徑圓形蓋玻片為ESM產(chǎn)品；NF-κB p65購自Santa Cruz，Alexa Fluor-546 標記的Rabbit Anti-Mouse IgG、ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI、Fluo-4 AM、 F-127和Attofluor Cell Chamber購自Invitrogen；激光共聚焦系統(tǒng)為PerkinElmer產(chǎn)品。

2 方法

2.1AT-2滅活HIV-1IIIB和HIV-1SF162的制備 按照文獻[9-10]所述的制備方法用AT-2滅活HIV-1IIIB和HIV-1SF162，用p24抗原檢測試劑盒檢測其p24抗原量。

2.2共聚焦顯微鏡術(shù)檢測小膠質(zhì)細胞鈣離子濃度 將調(diào)整好濃度的小膠質(zhì)細胞懸液接種于鋪有圓形蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，每孔定容為3 mL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜。次日，取出蓋玻片，置于Chamber上，加入5 μmol/L Fluo-4溶液[5 μL 1 mmol/L儲存液加入到5 μL F-127促滲透劑中，混勻，加入990 μL Locke’s溶液(154 mmol/L NaCl, 5.6 mmol/L KCl, 3.6 mmol/L NaHCO3, 1.3 mmol/L CaCl2, 1 mmol/L MgCl2, 5 mmol/L葡萄糖和10 mmol/L HEPES, pH 7.4)] 250 μL，37 ℃、5% CO2條件下孵育30 min。然后，用Locke’s溶液洗滌2次。最后，加入250 μL Locke’s溶液，上機檢測。所有數(shù)據(jù)通過PerkinElmer公司Ultraview System軟件中的Temporal程序獲取和分析。試劑加入順序及劑量見圖1～4。

2.3NF-κB核轉(zhuǎn)位的檢測 小膠質(zhì)細胞黏附生長于蓋玻片上，用滅活的HIVp(病毒濃度以p24抗原含量計算為10 μg/L)刺激小膠質(zhì)細胞。2 h后，3.7% 多聚甲醛固定細胞15 min，然后用通透液(含1% Triton X-100，含5% BSA的PBS)通透細胞，NF-κB p65抗體(1∶100)于4 ℃孵育過夜，洗滌3次，加入Alexa Fluor-546標記的Rabbit Anti-Mouse IgGⅡ抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，洗滌3次，封片后，共聚焦顯微鏡拍照。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。各組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 HIVp-X4激發(fā)的小膠質(zhì)細胞鈣離子內(nèi)流效應較HIVp-R5強

如圖1、2所示，無論是R5型HIVp(HIVp-R5)還是X4型HIVp(HIVp-X4)都能有效地刺激人小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生鈣離子內(nèi)流效應。當黏附在蓋玻片的小膠質(zhì)細胞用Fluo-4染色后，即使未使用激動劑，在激光照射下也產(chǎn)生一定強度的熒光(圖1A-1和B，圖2A-1和B)，當加入滅活的HIVp(病毒濃度以p24 抗原含量計算為10 μg/L，本文使用的HIVp-R5和HIVp-X4均調(diào)整為此濃度)后，顯微鏡視野范圍內(nèi)細胞的熒光強度立即增加(圖1A-2和B，圖2A-2和B)，在其后的數(shù)百秒的時間內(nèi)維持一定水平(圖1A-3和B，圖2A-3和B)。當加入5×10-6mol/L鈣離子導入劑Ion后，視野里所有細胞的圖像“熱起來”，即胞內(nèi)鈣離子濃度大幅升高(圖1A-4和B，圖2A-4和B)。如圖1C、2C所示，gp120-R5和gp120-X4所引發(fā)的鈣離子升高絕對值的平均數(shù)分別為(20.10±2.30)和(22.10±3.10)灰度單位，HIVp-R5和HIVp-X4所引發(fā)的鈣離子升高絕對值的平均數(shù)分別為(38.50±9.02)和(70.30±8.72)灰度單位，而Ion激發(fā)鈣離子升高的絕對值的平均數(shù)分別為(96.25±12.34)和(97.81±10.87)灰度單位。在相同劑量的HIVp-R5和HIVp-X4的條件下，無論是用絕對的灰度單位或者用與Ion所引發(fā)鈣離子內(nèi)流效應相對值來計算，HIVp比gp120所引發(fā)的鈣離子內(nèi)流效應要強得多；而且HIVp-X4所引發(fā)的鈣離子內(nèi)流效應要比HIVp-R5強。

Figure 1. Stimulatory effect of gp120-R5 and HIVp-R5 on calcium ion influx in microglia compared with ionomycin (Ion).Four cells monitored in the field of view were labeled as a, b, c and d, while four time points recorded in the experiment were marked as 1, 2, 3 and 4. A: representative images at different time points; B: representative intracellular calcium changes within each cell; C: statistical data from three independent experiments. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs gp120-R5 group; ##P<0.01 vs HIVp-R5 group.

Figure 2. Stimulatory effect of gp120-X4 and HIVp-X4 on calcium ion influx in microglia compared with ionomycin (Ion). Four cells monitored in the field of view were labeled as a, b, c and d, while four time points recorded in the experiment were marked as 1, 2, 3 and 4. A: representative images at different time points; B: representative intracellular calcium changes within each cell; C: statistical data from three independent experiments. Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs gp120-X4 group; ##P<0.01 vs HIVp-X4 group.

2 gp120對HIVp引發(fā)小膠質(zhì)細胞鈣離子內(nèi)流效應的影響

如圖3所示，當加入3 mg/L HIV-1糖蛋白gp120-X4時出現(xiàn)一定強度的鈣離子內(nèi)流，細胞內(nèi)鈣離子平均升高(20.44±2.83)灰度單位。如果不通過更換溶液把所加入的gp120清除，細胞內(nèi)鈣離子可以持續(xù)此水平至少數(shù)百秒，此時加入滅活HIVp-X4，小膠質(zhì)細胞內(nèi)的鈣離子出現(xiàn)明顯升高，平均升高(53.33±8.07)灰度單位。當細胞內(nèi)鈣離子處于平臺期，再加入5×10-6mol/L Ion，此時細胞內(nèi)鈣離子大幅度升高，平均升高(98.89±17.16)灰度單位。如圖4所示，當加入3 mg/L HIV-1糖蛋白gp120-X4時出現(xiàn)一定強度的鈣離子內(nèi)流，細胞內(nèi)鈣離子平均升高(21.00±3.09)灰度單位；通過更換溶液把所加入的gp120清除，鈣離子水平隨即下降，可以降到基礎水平，此時加入滅活HIVp-X4，小膠質(zhì)細胞的細胞內(nèi)鈣離子水平出現(xiàn)明顯升高，平均升高(70.22±16.22)灰度單位。當細胞內(nèi)鈣離子處于平臺期，再加入5×10-6mol/L Ion，此時細胞內(nèi)鈣離子水平出現(xiàn)一定程度的升高，平均升高(98.33±14.07)灰度單位。對圖3、4進行比較性分析，兩者所不同的是圖3的實驗是保留先前所加入的gp120，而圖4的實驗則通過更換溶液把所加入的gp120去除，相同劑量的HIV病毒顆粒在存在gp120的情況下所引發(fā)的鈣離子內(nèi)流效應要比清除先前加入的gp120后加入HIV病毒顆粒所引發(fā)的鈣離子內(nèi)流效應強度小。

Figure 3. Stimulatory effect of HIVp-X4 on calcium ion influx in the presence of gp120-X4 in human microglia compared with ionomycin (Ion).Four cells monitored in the field of view were labeled as a, b, c and d, while five time points recorded in the experiment were marked as 1, 2, 3, 4 and 5. A: representative images at different time points; B: representative intracellular calcium changes within each cell; C: statistical data from three independent experiments. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs gp120-X4 group; ##P<0.01 vs HIVp-X4 group.

Figure 4. Stimulatory effect of HIVp-X4 on calcium ion influx after removal of gp120-X4 in human microglia compared with ionomycin (Ion). Four cells monitored in the field of view were labeled as a, b, c and d, while five time points recorded in the experiment were marked as 1, 2, 3, 4 and 5. A: representative images at different time points; B: representative intracellular calcium changes within each cell; C: statistical data from three independent experiments. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs gp120-X4 group; ##P<0.01 vs HIVp-X4 group.

3 HIVp-X4引發(fā)更為明顯的NF-κB核轉(zhuǎn)位

如圖5所示，HIVp刺激小膠質(zhì)細胞2 h后進行免疫熒光染色觀察，結(jié)果顯示對照組中，NF-κB較為均勻地分布在胞漿中，而加入HIVp-R5組，(15.30±4.10)%小膠質(zhì)細胞出現(xiàn)了明顯的NF-κB核轉(zhuǎn)位，而加入HIVp-X4組，(92.73±2.80)%小膠質(zhì)細胞出現(xiàn)了顯著的NF-κB核轉(zhuǎn)位。

Figure 5. Detection of NF-κB nuclear translocation (yellow arrow indicated) induced by HIVp-X4 and HIVp-R5 in human microglia using confocal microscopy.

討 論

HIV感染者的CNS并發(fā)癥主要表現(xiàn)為腦炎和失智。其病理變化包括：CNS白細胞浸潤、小膠質(zhì)細胞活化、趨化因子異常表達、血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)受損和神經(jīng)細胞丟失等[1-4]。正如系統(tǒng)性HIV感染是從HIV及HIV感染細胞跨越黏膜屏障開始的一樣，HAD也是從HIV及HIV感染細胞跨越BBB開始的。目前認為，HIV是通過“木馬”策略而跨越BBB進入腦內(nèi)的，也就是說，通過感染HIV的單核細胞(常常是R5型)和CD4+的T淋巴細胞(記憶T細胞為R5，na?ve T細胞為X4)跨血管內(nèi)皮遷移而把病毒帶進CNS。除了來自血液的感染了HIV的細胞與腦內(nèi)未感染的巨噬細胞或小膠質(zhì)細胞通過融合而發(fā)生感染外，從感染細胞釋放出來的游離HIV病毒子與腦內(nèi)未感染的巨噬細胞或小膠質(zhì)細胞直接接觸而發(fā)生感染是可能的[1]。根據(jù)數(shù)學模型計算HIV-1在體內(nèi)動力學的研究表明[11]，HIV-1的生活周期平均為2.2 d，世代時間平均為2.6 d，病毒子在血漿停留時間為0.3 d，體內(nèi)每天產(chǎn)生病毒子數(shù)為10.3×109。 因此，推理在HIV感染的CNS的細胞間液中，游離的病毒子也停留一定的時間，即在腦內(nèi)存在游離的HIV病毒子與小膠質(zhì)細胞相互作用是具有時間和空間基礎的。因此，無論是R5還是X4型的病毒顆粒與小膠質(zhì)細胞直接接觸是完全可能的。我們通過HIVp與小膠質(zhì)細胞直接接觸研究HIV的生物學行為是與自然發(fā)生的事件相仿，因此是合理的。

本研究在方法學上可取之處在于，把AT-2滅活的HIVp作為激動劑并以鈣離子內(nèi)流和NF-κB核轉(zhuǎn)位作為指標評價人小膠質(zhì)細胞的活化應答。AT-2是通過共價修飾NCp7中的鋅指結(jié)構(gòu)而破壞HIV-1的感染性，但仍保留了HIV-1顆粒構(gòu)象和功能的完整性，而且HIV出胞時所攜帶的宿主細胞來源的蛋白構(gòu)象和功能的完整性也沒有被破壞[10]。這種策略既可以使我們在常規(guī)的實驗條件下進行HIV的生物學活性的研究成為可能，又可以把HIV對宿主細胞作用的非感染活性和感染活性分離開來研究。最重要的是，與單個病毒蛋白相比，應用病毒顆粒進行研究似乎已經(jīng)在方法論上從還原性研究到整合性研究更加向前邁進一步。此外，我們以ION所引發(fā)的最大鈣離子內(nèi)流效應作為HIVp和gp120所引發(fā)的鈣離子內(nèi)流效應強度的內(nèi)在參照標準，排除因細胞狀態(tài)和Fluo-4染色差異造成的影響，從而增加HIVp與gp120及每次獨立實驗中所引發(fā)鈣離子內(nèi)流效應強度的可比性。

我們的研究結(jié)果表明，無論是HIVp-R5或HIVp-X4，還是gp120-R5或gp120-X4都能刺激小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生明顯的鈣離子內(nèi)流。HIV是通過gp120與靶細胞受體CD4和共受體C-C型趨化因子受體5(C-C chemokine receptor type 5，CCR5)或C-X-C型趨化因子受體4(C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4)接觸而引發(fā)入胞。Albright等[12]證實趨化因子巨噬細胞炎癥蛋白1(macrophage inflammatory protein 1，MIP-1)和基質(zhì)細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)通過激活其相應的受體CCR5和CXCR4在人小膠質(zhì)細胞引發(fā)鈣離子內(nèi)流。Melar等[13]證實HIVp和gp120能刺激T細胞鈣離子內(nèi)流并且證明是通過激活受體CCR5和CXCR4。由此推理，滅活HIVp和gp120在小膠質(zhì)細胞所引發(fā)的鈣離子內(nèi)流也是通過激活共受體CCR5和CXCR4。Hoffmann等[14]證實小膠質(zhì)細胞活化是鈣離子依賴的，也就是說無論是HIVp還是其gp120都能有效地使小膠質(zhì)細胞活化。由于小膠質(zhì)細胞活化不但上調(diào)HIV共受體增加對HIV感染的容許性，而且使細胞進入增殖周期而增加HIV復制的支持性。

基于預實驗結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)，本研究中我們所加入的病毒量以及gp120量均能保證引發(fā)最強的鈣離子內(nèi)流效應，但發(fā)現(xiàn)HIVp激發(fā)的鈣離子內(nèi)流強度高于gp120，原因分析如下：首先，我們所使用的gp120為非三聚體(單體)，而在HIVp上gp120為三聚體；此外，HIV出胞時攜帶多種宿主蛋白[6,15]，而小膠質(zhì)細胞上有這些蛋白的功能受體，可能通過配體與受體的相互作用而協(xié)同促進鈣離子內(nèi)流。為了分析HIVp引發(fā)小膠質(zhì)細胞鈣離子內(nèi)流的可能作用位點，我們在加入gp120的基礎上再加入HIVp以觀察鈣離子內(nèi)流變化。我們發(fā)現(xiàn)：在使用最大劑量的gp120引發(fā)最強的鈣離子內(nèi)流的基礎上，HIVp依然可以進一步增強鈣離子內(nèi)流。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，在不洗去先前加入的gp120的條件下HIVp所引發(fā)的鈣離子內(nèi)流反應較弱，而在洗去先前加入的gp120的條件下HIVp所引發(fā)的鈣離子內(nèi)流較強。這提示gp120與HIVp可以競爭結(jié)合相同位點，從而部分阻斷HIVp的刺激作用，因為弱的激動劑可以是強的激動劑的拮抗劑。

HIV-1早期感染是以R5型的病毒占優(yōu)勢，在HIV病的進程中出現(xiàn)從R5向X4轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象，這一轉(zhuǎn)換提示CD4+T細胞丟失加快，疾病發(fā)展加速。到了晚期至少有50%患者為X4型病毒感染。與此同時，HAD也常見于HIV感染的晚期，這就提示HAD與X4型病毒感染可能有某種聯(lián)系。我們的實驗顯示HIVp-X4在小膠質(zhì)細胞所引發(fā)的鈣離子內(nèi)流要強得多，從而我們推測，在HIV感染的晚期因BBB通透性增加從而導致跨越BBB的X4病毒量增加而加速HAD的發(fā)生發(fā)展。

[參 考 文 獻]

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