慢病毒介導(dǎo)的GOLPH3基因沉默對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響*

蘇 婷， 賴銘裕， 農(nóng)云翠

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1消化內(nèi)科， 2老年消化內(nèi)科，廣西 南寧 530021)

高爾基體磷蛋白3(Golgi phosphoprotein 3，GOLPH3)，又名GMx33或GPP34，是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)癌蛋白，定位于反面高爾基體網(wǎng)管狀結(jié)構(gòu)(trans-Golgi network，TGN)，可誘導(dǎo)正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，促使細(xì)胞增殖和分化過(guò)程失去平衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化以及腫瘤的發(fā)生。2009年，Scott等[1]的研究發(fā)現(xiàn)肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌等多種實(shí)體腫瘤中均存在5p13區(qū)域拷貝頻率的異常增加，對(duì)此區(qū)域進(jìn)行系統(tǒng)性分析后發(fā)現(xiàn)GOLPH3基因的表達(dá)與5p13區(qū)域的拷貝狀態(tài)關(guān)系密切，并通過(guò)體內(nèi)、體外等實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了GOLPH3是一個(gè)新的致癌基因。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于GOLPH3與人類腫瘤發(fā)生的研究，如橫紋肌肉瘤[2]、舌癌[3]、食管癌[4]、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤[5]等，均有報(bào)道；其中，Hu 等[6]首次對(duì)GOLPH3與胃癌組織的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GOLPH3在胃癌組織中的表達(dá)高于正常組織，提示GOLPH3可能是胃癌預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因子。然而，抑制GOLPH3是否會(huì)對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響尚未清楚。本研究利用慢病毒介導(dǎo)的GOLPH3沉默載體(LV-GOLPH3-RNAi)轉(zhuǎn)染至人胃癌SGC-7901細(xì)胞，構(gòu)建GOLPH3沉默的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并觀察沉默GOLPH3基因?qū)GC-7901細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為臨床上胃癌的診治及預(yù)后奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(杭州四季青)；LV-GOLPH3-RNAi、scrambled序列及轉(zhuǎn)染試劑(上海吉?jiǎng)P基因)；Trizol(Invitrogen)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、GOLPH3、β-actin引物和PCR擴(kuò)增試劑盒(大連寶生物)；GOLPH3兔抗人多克隆抗體(Abcam)；β-actin抗體(上?？党?；山羊抗兔IgG Ⅱ抗(北京金橋)；MTT試劑(Solarbio)；Transwell小室(Corning)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇的SGC-7901細(xì)胞置于事先準(zhǔn)備好的含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)的培養(yǎng)和傳代。

2.2慢病毒LV-GOLPH3-RNAi轉(zhuǎn)染，建立穩(wěn)定感染LV-GOLPH3-RNAi的SGC-7901細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前24 h，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SGC-7901細(xì)胞按(3～5)×105cells/well接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞融合率達(dá)到70%～90%時(shí)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取含有干擾GOLPH3效果最佳的靶點(diǎn)序列(5’-TTCTTGACAAATGGGTGAA-3’)以及陰性對(duì)照組的scramble序列的病毒液按照慢病毒轉(zhuǎn)染手冊(cè)轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞中，制備成穩(wěn)定感染LV-GOLPH3-RNAi的SGC-7901細(xì)胞及陰性對(duì)照細(xì)胞；并收集同期未轉(zhuǎn)染的SGC-7901細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后12 h觀察細(xì)胞狀態(tài)，若無(wú)明顯的細(xì)胞毒性作用，可48 h后更換為常規(guī)培養(yǎng)基；若有明顯的細(xì)胞毒作用則12 h后立即更換為常規(guī)培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后72 h在倒置相差熒光顯微鏡下觀察帶有綠色熒光的SGC-7901細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率(同一個(gè)視野，熒光顯微鏡下熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)/光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞個(gè)數(shù))大于80%，則可進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3Real-time PCR檢測(cè)GOLPH3 mRNA的表達(dá) 收集各個(gè)實(shí)驗(yàn)組(LV-GOLPH3-RNAi組、scrambled組和空白對(duì)照組)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用Trizol法進(jìn)行總RNA的提取，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行cDNA的合成。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，總體系20 μL，以SYBR Green染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，β-actin為內(nèi)參照。利用Primer 5設(shè)計(jì)引物序列如下：GOLPH3 上游引物5’-ATCTGGATTACGTGGCTGTATGTTA-3’，下游引物5’-CGTTTCTGGAGGCTGAGTTTC-3’，產(chǎn)物大小為187 bp；內(nèi)參照β-actin上游引物5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游引物5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’， 產(chǎn)物大小為186 bp。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

2.4Western blotting檢測(cè)GOLPH3蛋白的表達(dá) 收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，加入RIPA及PMSF提取總蛋白液，將總蛋白液與上樣緩沖液按5∶1的比例混合，經(jīng)變性后制成蛋白質(zhì)樣品。配制5%濃縮膠和10%分離膠，將蛋白質(zhì)樣品加入孔道，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳產(chǎn)物以100 mA恒流電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%蛋白封閉液室溫于搖床上搖動(dòng)封閉1 h，用TBST漂洗后置于稀釋的Ⅰ抗(GOLPH3：1∶1 000；β-actin: 1∶10 000)中4 ℃孵育過(guò)夜，再次TBST漂洗后加入稀釋的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)，室溫置于搖床上孵育1 h，洗膜后進(jìn)行顯影、定影。以β-actin為內(nèi)參照，用圖像處理軟件ImageJ對(duì)蛋白的條帶進(jìn)行半定量分析。

2.5MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖力 收集各實(shí)驗(yàn)組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×103cells/well (100 μL)接種于96孔板中，每塊96孔板均設(shè)LV-GOLPH3-RNAi組、scrambled組和空白對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，于接種后24 h、48 h、72 h、96 h和120 h在培養(yǎng)基中加入20 μL MTT溶液，使MTT終濃度為0.5 g/L，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄液，加入等體積DMSO，搖床振蕩10 min使結(jié)晶物完全溶解后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀用492 nm波長(zhǎng)測(cè)各孔吸光度值，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GOLPH3沉默對(duì)SGC-7901細(xì)胞侵襲和遷移的影響 在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，按1∶8比例將Matrigel稀釋于無(wú)血清培養(yǎng)基中，取上述稀釋液30～50 μL加入Transwell上室使其覆蓋整個(gè)聚碳脂膜上表面，于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置30 min ，使Matrigel凝結(jié)成膠。下室加入600 μL含15%胎牛血清的培養(yǎng)基，上室則加入制備好的細(xì)胞懸液200 μL(3×108/L)。常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，用棉簽小心擦去上室聚碳脂膜表面未穿過(guò)的細(xì)胞，甲醛固定小室20 min后用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS沖洗晾干。將小室的下表面置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野(上、中、下、左、右)進(jìn)行計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)分析。遷移實(shí)驗(yàn)無(wú)需加入Matrigel包被Transwell上室聚碳脂膜，其余步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件包分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 慢病毒高效轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系

將LV-GOLPH3-RNAi和scrambled組的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染至人胃癌細(xì)胞株SGC-7901并培養(yǎng)72 h后，于倒置相差熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，可見(jiàn)表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞比例達(dá)80%以上，提示慢病毒轉(zhuǎn)染成功并穩(wěn)定表達(dá)，可繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1。

2 慢病毒轉(zhuǎn)染LV-GOLPH3-RNAi降低SGC-7901細(xì)胞GOLPH3 mRNA的表達(dá)

將LV-GOLPH3-RNAi和scrambled組的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞，以β-actin為內(nèi)參照，LV-GOLPH3-RNAi組、scrambled組和空白對(duì)照組GOLPH3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.28±0.04、1.62±0.11和1.66±0.19；LV-GOLPH3-RNAi組GOLPH3 mRNA的表達(dá)均低于scrambled組和空白對(duì)照組(P<0.05)，其表達(dá)量分別為上述2個(gè)對(duì)照組的17.28%和16.87%，干擾效率為82.72%和83.13%；而scrambled組和空白對(duì)照組的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. Relative mRNA expression of GOLPH3.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs scrambled group; #P<0.05 vs blank control group.

3 慢病毒轉(zhuǎn)染LV-GOLPH3-RNAi降低SGC-7901細(xì)胞GOLPH3蛋白的表達(dá)

與scrambled組和空白對(duì)照組對(duì)比，LV-GOLPH3-RNAi組的GOLPH3蛋白條帶減弱，GOLPH3蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.99±0.01、0.98±0.03和0.36±0.09，P<0.05)，LV-GOLPH3-RNAi組的GOLPH3蛋白表達(dá)量降低了63.63%和63.26%，scrambled組和空白對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

4 慢病毒轉(zhuǎn)染LV-GOLPH3-RNAi抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖力

根據(jù)MTT結(jié)果繪制各實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖4，可見(jiàn)LV-GOLPH3-RNAi組SGC-7901細(xì)胞的增殖較scrambled組和空白對(duì)照組緩慢，并且該作用隨著時(shí)間的增加而更為明顯，觀察至第5天，LV-GOLPH3-RNAi組的A值顯著低于scrambled組和空白對(duì)照組(P<0.05)，其它各組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Figure 3. The protein expression of GOLPH3.Mean±SD.n=3.1: scrambled group; 2: blank control group; 3: LV-GOLPH3-RNAi group.*P<0.05 vs scrambled group; #P<0.05 vs blank control group.

Figure 4. The effect of GOLPH3 silencing on the cell proliferation.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs scrambled group; #P<0.05 vs blank control group.

5 慢病毒轉(zhuǎn)染LV-GOLPH3-RNAi抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲和遷移能力

侵襲實(shí)驗(yàn)中，可見(jiàn)LV-GOLPH3-RNAi組穿過(guò)上室Matrigel和聚碳脂膜微孔的細(xì)胞數(shù)(33.5±3.0)低于scrambled組(85.0±3.9)和空白對(duì)照組(83.1±4.4;P<0.05)；遷移實(shí)驗(yàn)中，LV-GOLPH3-RNAi組穿過(guò)上室聚碳脂膜微孔的細(xì)胞數(shù)(56.7±1.5)低于scrambled組(186.0±3.4)和空白對(duì)照組(183.3±4.2；P<0.05)。侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)中，scrambled組和空白對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5。

Figure 5. Invasion assay (A) and migration assay (B).Magnification:×200.

討 論

GOLPH3是由5p13區(qū)域基因編碼的一種高度保守的蛋白，相對(duì)分子量約30 kD，由Wu等[7]于2000年首次在小鼠高爾基體中檢測(cè)到，并參與保持高爾基體正常形態(tài)、蛋白質(zhì)的加工和運(yùn)輸。Scott等[1]通過(guò)對(duì)5p13區(qū)域的研究發(fā)現(xiàn)GOLPH3有可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素，是一個(gè)新的致癌基因，能通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和腫瘤的生長(zhǎng)，并增加腫瘤細(xì)胞對(duì)雷帕霉素的敏感性[8-9]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)GOLPH3在多種腫瘤組織中高表達(dá)，已有證據(jù)[6]表明人類胃癌中也有GOLPH3的高表達(dá)，并且其高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。但GOLPH3與胃癌的遷移、侵襲能力的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，為此我們進(jìn)行了這一體外實(shí)驗(yàn)，探討下調(diào)GOLPH3表達(dá)水平對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。

我國(guó)是胃癌高發(fā)的地區(qū)之一，雖然近年來(lái)發(fā)病率有所下降[10]，但因胃癌早期診出率較低，其病死率并未下降。胃癌是多步驟、多因素共同作用所致發(fā)展，其形成與致癌基因的激活、抑癌基因的失活等密切相關(guān)。特異性地阻斷胃癌中致癌基因的表達(dá)有可能抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是利用外源性或內(nèi)源性的短雙鏈RNA抑制細(xì)胞內(nèi)特定基因的表達(dá)的一種技術(shù)，具有高效性、特異性和低毒性，目前廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤、病毒感染性疾病等的研究[11]。應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)RNAi所致的基因沉默具有持久性和穩(wěn)定性，并且無(wú)病毒蛋白的表達(dá)[12]，該技術(shù)在促進(jìn)基因組學(xué)研究的進(jìn)一步發(fā)展有重要作用。

本實(shí)驗(yàn)將載有GOLPH3干擾序列的慢病毒LV-GOLPH3-RNAi轉(zhuǎn)染至SGC7901細(xì)胞，并檢測(cè)到GOLPH3 mRNA和GOLPH3蛋白在LV-GOLPH3-RNAi組細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯下降，而在空白對(duì)照組和scrambled組中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明該載體能有效沉默GOLPH3，穩(wěn)定沉默GOLPH3的細(xì)胞株構(gòu)建成功，也證實(shí)了慢病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)具有穩(wěn)定、持久的優(yōu)勢(shì)，是基因治療的有力工具。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)GOLPH3的表達(dá)水平使得SGC7901細(xì)胞的增殖力減慢，而Zeng等[13]學(xué)者則報(bào)道了GOLPH3的過(guò)表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，并與其較低的生存率相關(guān)，這說(shuō)明了GOLPH3的水平與腫瘤細(xì)胞的增殖有極大的關(guān)系，與腫瘤早期的形成相關(guān)。在細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)LV-GOLPH3-RNAi組SGC-7901細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯低于對(duì)照組，這與GOLPH3水平和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的研究結(jié)果一致：下調(diào)GOLPH3的表達(dá)水平可明顯降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力[5]，說(shuō)明GOLPH3在惡性腫瘤晚期的侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。Scott等[1]的研究提示GOLPH3的作用與mTOR信號(hào)通路相關(guān)，而PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)控包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[14]，有研究[15]表明PI3K/mTOR雙重抑制劑PF-04691502可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡；但GOLPH3如何靶定該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的分子來(lái)介導(dǎo)胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移，目前尚未清楚，仍需更進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒載體將LV-GOLPH3-RNAi轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞，產(chǎn)生特異性的GOLPH3沉默效應(yīng)，抑制了胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力，該結(jié)果說(shuō)明GOLPH3有可能參與胃癌早期的形成以及晚期的的侵襲、轉(zhuǎn)移等行為，提示GOLPH3可作為潛在的腫瘤標(biāo)記物及獨(dú)立的預(yù)后因子。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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