4-羥基他莫昔芬通過雌激素受體GPR30激活ezrin蛋白促進人乳腺癌MCF-7細胞遷移*

游昕超， 王庭槐

(中山大學中山醫(yī)學院，廣東 廣州 510080)

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。大部分乳腺癌細胞表達雌激素受體(estrogen receptor, ER)，其生長增殖呈明顯的激素依賴性。他莫昔芬(tamoxifen, TAM)是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(selective estrogen receptor molecular, SERM)，是激素依賴性乳腺癌的內(nèi)分泌治療中的一種常用藥物。TAM能通過與ER結(jié)合形成穩(wěn)定的復合物，阻斷雌激素與受體結(jié)合，從而阻斷雌激素的生物學效應，但約50%長期使用TAM的乳腺癌患者產(chǎn)生TAM耐藥性[2]。G蛋白偶聯(lián)受體30(G-protein-coupled receptor 30,GPR30)是較晚被發(fā)現(xiàn)的一種新型雌激素受體，在多種乳腺癌細胞中均有表達。值得注意的是，TAM作為一種運用廣泛的SERM能夠抑制ER的活性，阻斷傳統(tǒng)的雌二醇(estradiol,E2)-ER經(jīng)典通路，但它同時是GPR30的激動劑[3]。這提示TAM可能通過激活GPR30調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的生存和狀態(tài)。本實驗擬用TAM在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物4-羥基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen, OHT)給藥作用，觀察研究OHT對ER+乳腺癌細胞株MCF-7遷移的影響，確認其作用的時間/濃度效應，并探索GPR30、非受體型酪氨酸激酶蛋白(Src蛋白)和膜-骨架連接蛋白ezrin在其中起到的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細胞株 人乳腺癌MCF-7細胞株、SK-BR-3細胞株和MDA-MB-231細胞株均購于中國科學院上海細胞生物所。

1.2試劑 DMEM培養(yǎng)液購于HyClone；胎牛血清、0.25%胰酶購于Gibco；E2、OHT、GPR30激動劑G1、GPR30阻斷劑G15和Src阻斷劑PP2購于Sigma；SDS配膠劑購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；Western blotting發(fā)光劑購于普萊利生物技術(shù)有限公司。

1.3抗體 兔抗人ezrin、p-ezrin、Src、p-Src和ERα單抗購于Cell Signal Technology；兔抗人ERβ和GPR30單抗購于Abcam。

2 方法

2.1MCF-7細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2飽和培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MCF-7細胞；0.25%胰蛋白酶消化傳代；每次實驗取對數(shù)生長期的細胞。

2.2細胞劃痕愈合實驗 6孔板板背做好水平標記線，將MCF-7細胞種入，待細胞密度達到90%換無血清培養(yǎng)液處理24 h，用以同步細胞周期并排除細胞增殖影響。在無菌條件下用200 μL槍頭和直尺在每孔中央垂直劃線，形成單層細胞無細胞區(qū)，PBS沖洗3次。倒置顯微鏡下拍照，CellSens Entry軟件測量劃痕區(qū)寬度為初始劃痕寬度。各孔給2 mL無血清培養(yǎng)液后給予溶劑對照或藥物干預(阻斷劑提前30 min處理)。定時拍照測量，各組n小時遷移距離=n小時劃痕寬度乙醇-初始劃痕寬度，每次實驗將對照組24 h遷移距離標準化為100。

2.3Western blotting 細胞密度培養(yǎng)達到80%以上時換無血清培養(yǎng)液8～12 h。給予溶劑對照或藥物干預(阻斷劑提前30 min預處理)。30 min后加入細胞裂解液(10% Tris,pH 6.8，4% SDS，20% glycerol，10% cocktail蛋白酶抑制劑)在冰上裂解細胞。收集細胞于沸水煮18 min。之后4 ℃、13 500 r/min離心7 min，取上清液。各組樣品定量后加入10 μL loading-buffer和2 μL β-巰基乙醇在沸水中煮1 min制得蛋白樣品，進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳完后將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上(100V 60 min)，5% BSA封閉30 min，按濃度1∶1 000孵育Ⅰ抗4 ℃過夜。洗膜3次(各10 min)后室溫孵育辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗1 h。洗膜3次(各10 min)后在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用Image Lab軟件分析條帶灰度，每次實驗將對照組蛋白灰度值標準化為100。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。實驗重復3次，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。SigmaPlot軟件作圖。

結(jié) 果

1 乳腺癌細胞株受體檢測

MCF-7人乳腺癌細胞系有較高的ERα、ERβ和GPR30表達。雌激素受體陰性人乳腺癌SK-BR-3細胞系和MDA-MB-231細胞系不表達ERα，少量表達ERβ和GPR30，見圖1。

Figure 1. The expression of ERα,ERβ and GPR30 in different hunman breast cancer cell lines.

2 E2和OHT都能促進MCF-7細胞遷移

相比對照組(0.1% DMSO)，E2(10 nmol/L)能明顯增加MCF-7細胞24 h遷移距離(129.3±5.04，P<0.05)；同時給予OHT(1 μmol/L)和E2(10 nmol/L)，不能明顯改變E2的促遷移效應(123.80±6.10)。單獨給予OHT(1 μmol/L)也能顯著促進MCF-7細胞株遷移(128.90±7.53，P<0.05),見圖2。

3 OHT促進MCF-7遷移時間濃度效應

分別給予MCF-7細胞DMSO(0.1%)及0.1、1、5、10和15 μmol/L OHT，24 h后測量計算各組遷移距離。結(jié)果顯示，相比對照組，0.1 μmol/L(103.9±10.3)OHT不能明顯改變MCF-7遷移距離(P>0.05)。1 μmol/L(126.6±8.9)、5 μmol/L(132.0±8.8)和10 μmol/L(121.7±8.7)的OHT都能促進MCF-7細胞遷移(P<0.05)。15 μmol/L(103.0±8.9)的OHT對MCF-7細胞遷移作用不明顯(P>0.05)，并出現(xiàn)貼壁細胞脫落和細胞形態(tài)改變。給予MCF-7細胞1 μmol/L OHT后，結(jié)果顯示，在給藥6 h就已經(jīng)體現(xiàn)出促進MCF-7細胞遷移的作用，見圖3。

Figure 2. OHT(1 μmol/L) and E2(10 nmol/L) promoted the migration of MCF-7 cells in scratch healing model (×200). CON: control.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs CON.

Figure 3. The concentration and time effects of OHT on migration of MCF-7 cells (×200). CON: contrrol.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs CON.

4 OHT激活ezrin蛋白磷酸化

分別用DMSO(0.1%)及0.1、1、5、10和15 μmol/L OHT處理MCF-7細胞30 min，檢測其是否能快速磷酸化激活MCF-7中的膜-細胞骨架蛋白ezrin。 Westren blotting結(jié)果顯示1、5和10 μmol/L OHT能顯著增加p-ezrin蛋白的表達，其最大效應濃度約為5 μmol/L。用OHT(1 μmol/L)分別處理MCF-7細胞5、10、20、30和60 min后p-ezrin的表達在20 min時達到最大，20 min后p-ezrin表達逐漸降低,見圖4。

Figure 4. The concentration (A) and time (B) effects of OHT on ezrin phosphorylation in MCF-7 cells. CON: control.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs CON.

5 阻斷GPR30和Src后，OHT不能磷酸化激活ezrin

OHT(1 μmol/L)和G1(0.1 μmol/L)分別作用30 min后，MCF-7細胞中p-ezrin和p-Src蛋白表達較對照組明顯增加；G15(0.1 μmol/L)預處理細胞30 min后，能明顯降低OHT和G1引起的p-ezrin和p-Src表達增高。另外用Src蛋白阻斷劑PP2預處理30 min后，能明顯抑制OHT作用后p-ezrin表達增加，見圖5。

討 論

TAM是雌激素依賴性乳腺癌的一線治療藥物，也是ER陽性原發(fā)性乳腺癌術(shù)后輔助內(nèi)分泌治療首選藥物，同時還用于預防絕經(jīng)前(絕經(jīng)后)婦女乳腺癌，具有很好臨床療效[2]。TAM作為一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑可以競爭性抑制E2與ER結(jié)合，從而阻斷經(jīng)典的E2-ER通路，阻止激素依賴性乳腺癌細胞增殖。但幾乎所有長期(5年或更長時間以上)使用TAM的患者都會出現(xiàn)耐藥性，表現(xiàn)為長期用藥后原發(fā)性腫瘤不能得到有效控制，出現(xiàn)復發(fā)或者發(fā)生癌細胞遠處轉(zhuǎn)移[4]。TAM對乳腺癌細胞遷移能力的影響尚不明確。TAM通常用藥劑量為 20 mg/d，2月后的血漿穩(wěn)定濃度約為1 μmol/L[5]。本實驗旨在觀察TAM有效代謝產(chǎn)物OHT在此濃度時對乳腺癌細胞遷移能力的影響和其時間/濃度效應，并探討其作用機制。細胞劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，經(jīng)OHT(1 μmol/L)給藥處理后的MCF-7細胞較溶劑對照組(0.1% DMSO)遷移能力明顯增強(P<0.05)；在E2存在條件下，OHT也不能有效抑制MCF-7的遷移(圖2)。濃度效應實驗結(jié)果顯示，低濃度的OHT(0.1 μmol/L)對MCF-7 遷移幾乎無作用，其促遷移作用最大效應濃度約為5和10 μmol/L時促進效應反而降低，15 μmol/L時促遷移效果不明顯并出現(xiàn)少量細胞凋亡(圖3)。這表明乳腺癌患者在長時間服用TAM后，體內(nèi)正常血漿濃度(1 μmol/L)的藥物不能有效抑制MCF-7 遷移；而高濃度的藥物具有抑制細胞遷移和促進凋亡的作用，但過高劑量的TAM容易誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌[6]，因此也不主張在乳腺癌治療時盲目加大TAM劑量。時間效應結(jié)果顯示，OHT給藥后6 h時遷移距離較對照組就已有顯著差異(圖3)。

細胞遷移是一個受多因素影響，多步驟的復雜過程，細胞肌動蛋白骨架重構(gòu)是其中重要的一步。有研究表明，細胞肌動蛋白骨架重構(gòu)受ezrin蛋白調(diào)控，ezrin在處于失活狀態(tài)時羧基端和氨基端結(jié)合，首尾相連折疊，當?shù)鞍准っ讣せ钇淅野彼酺yr477[7]或蘇氨酸Thr567[8]位點，p-ezrin構(gòu)型改變暴露出肌動蛋白的結(jié)合位點，激活的p-ezrin蛋白作為橋梁分子連接膜-骨架蛋白，在細胞遷移、有絲分裂等方面發(fā)揮重要作用[9]。因此我們推測并觀察MCF-7經(jīng)OHT處理后ezrin/p-ezrin是否發(fā)生明顯變化，借此細胞骨架重構(gòu)而引起細胞遷移。Western blotting結(jié)果顯示，OHT能使MCF-7細胞中p-ezrin表達增加，其最大效應濃度(5 μmol/L)與促細胞遷移最大效應濃度一致(圖4A)，這說明OHT促進MCF-7細胞遷移可能是通過磷酸化激活ezrin蛋白并促進細胞骨架重構(gòu)這一機制實現(xiàn)；時間效應顯示，OHT給藥后10 min就能明顯引起p-ezrin表達的增加，30 min后表達則逐漸減少(圖4B)。這提示這一效應不可能是通過調(diào)節(jié)有關(guān)的表達基因(耗時數(shù)小時至數(shù)天)而發(fā)揮作用的，而是由快速的非基因效應介導。

Figure 5. OHT-induced ezrin phosphorylation was inhibited by G15 and PP2.CON: control.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs CON; #P<0.05 vs OHT or G1.

TAM及其代謝產(chǎn)物通常是作為傳統(tǒng)雌激素受體ER抑制劑發(fā)揮其藥理作用，但它對一種新型的雌激素膜受體GPR30有激動效應。E2或OHT能通過激動GPR30受體，促進乳腺癌成纖維細胞[10]，三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231[11]，子宮內(nèi)膜癌細胞[12]等遷移、侵襲、黏附。GPR30激活后可產(chǎn)生多種信號聯(lián)級反應，如非受體型酪氨酸激酶Src和第二信使cAMP可分別由GPR30激活后的G蛋白βγ和α亞基所激活[13-14]，而磷酸化的p-Src又可進一步激活ezrin酪氨酸位點Tyr477，促進細胞骨架重構(gòu)和遷移[7]。由此推測GPR30受體和Src可能介導了OHT快速磷酸化激活ezrin的效應，從而介導細胞骨架重構(gòu)和細胞遷移。本實驗Western blotting結(jié)果顯示， GPR30激動劑G1和OHT引起的p-ezrin和p-Src表達增加都可以被GPR30阻斷劑G15阻斷，單純的G15對p-ezrin表達并無明顯影響(圖5A、B)；PP2阻斷Src蛋白以后，同樣可以阻斷OHT促進p-ezrin表達增加(圖5C)。因此，可以推斷OHT可能是通過作用GPR30，釋放G蛋白βγ亞基激活c-Src，進而磷酸化激活ezrin蛋白這一信號通路影響細胞遷移。不過另有報道稱OHT(10 μmol/L)能夠通過激活GPR30受體誘導cyclin E的裂解，從而促進MCF-7遷移[15]。所以OHT促進MCF-7細胞遷移可能是由多種信號通路、多種機制共同作用結(jié)果。

TAM用于治療和預防乳腺癌有超過40年的使用歷史，但其易出現(xiàn)耐藥性且耐藥機制至今仍未闡明，有研究發(fā)現(xiàn)GPR30的表達增高或者亞細胞定位的改變與乳腺癌不良預后或TAM耐藥相關(guān)[16-18]。本實驗結(jié)果表明，TAM通過作用于GPR30對ER+乳腺癌細胞遷移有促進作用，提示在臨床上可能需要根據(jù)患者具體情況權(quán)衡其療效與不良反應而決定用藥。而GPR30有可能成為今后臨床治療乳腺癌的一個檢測指標和治療靶點。

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