人剪切修復(fù)基因XPD肝癌對人HepG2細(xì)胞中Rb和MAD2表達(dá)的影響*

張慶燕， 趙 慧， 羅 文， 張吉翔

(南昌大學(xué) 1第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 2江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，3醫(yī)學(xué)院， 4第二附屬醫(yī)院門診部,江西 南昌 330006)

原發(fā)性肝癌是一種基因病，唯有追本溯源研究清楚肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找到有效的候選治療基因，并研制出綜合有效的基因治療藥物，應(yīng)用到臨床治療中，才能從根本上治療肝癌。著色性干皮病D組蛋白(xeroderma pigmentosum group D, XPD)是轉(zhuǎn)錄因子ⅡH(transcription factor II H，TFⅡH)的一個組分，在真核生物的轉(zhuǎn)錄起始和核酸剪切修復(fù)(nucleotide excision repair，NER)中起重要作用[1]，大量研究證明，XPD能抑制肝癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，但機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

有絲分裂阻滯缺陷蛋白2(mitotic arrest deficient 2，MAD2)是紡錘體組裝檢查點(diǎn)(spindle assembly checkpoint，SAC)其中一個關(guān)鍵組分，目前研究表明MAD2的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生及預(yù)后有關(guān)，MAD2的表達(dá)受視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma, Rb)表達(dá)的調(diào)控[2]。 本實(shí)驗將探討把人pEGFP-N2-XPD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人HepG2肝癌細(xì)胞后,觀察XPD對Rb和MAD2表達(dá)的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

人肝癌HepG2細(xì)胞購自美國模式菌種收集中心。重組質(zhì)粒(帶綠色熒光蛋白的XPD重組質(zhì)粒)由本實(shí)驗室構(gòu)建并保存，已通過PCR反應(yīng)、酶切及基因測序三重鑒定[3]。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自HyClone。胰蛋白酶和MTT購自Solarbio。LipofectamineTM2000購自Invitrogen。 TRIzol、2×TaqPCR Master Mix和DMSO購自北京全式金生物技術(shù)公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa。引物由上海生工生物工程公司合成。Marker I購自北京天根生化科技有限公司?？偟鞍滋崛≡噭┖匈徸员本┢绽R基因技術(shù)有限公司。XPD單克隆抗體購自Santa Cruz，Rb多克隆兔抗購自Proteintech，MAD2多克隆兔抗購自Anbo，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗及山羊抗鼠Ⅱ抗購自北京中杉金橋公司。FACSCalibar流式細(xì)胞術(shù)為Beckton Dickinson產(chǎn)品?？偟鞍滋崛≡噭┖匈徸员本┢绽R基因技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化，2～3 d傳代1次，待細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定后進(jìn)行種皿及轉(zhuǎn)染。實(shí)驗分為4組：無轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞組(空白對照組)、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞組(脂質(zhì)體組)、空載質(zhì)粒pEGFP-N2轉(zhuǎn)染細(xì)胞組(N2 組)、重組質(zhì)粒pEGFP-N2-XPD轉(zhuǎn)染細(xì)胞組(XPD組)。以2×105cells/well的密度鋪于6 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，24 h細(xì)胞鋪滿50%～80%，用LipofectamineTM2000進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染， 質(zhì)粒4.0 μg/well， LipofectamineTM2000 10 μg/well，介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。

2.2RT-PCR 檢測XPD、Rb及MAD2 mRNA的表達(dá)量 轉(zhuǎn)染24 h后TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA，PCR擴(kuò)增XPD、Rb及MAD2。根據(jù)GenBank上公布的人類XPD、Rb及MAD2 mRNA序列，應(yīng)用Primer Primier 5軟件設(shè)計引物，由上海生工生物工程公司合成，見表1。同一標(biāo)本擴(kuò)增β-actin作內(nèi)參照。PCR條件：XPD：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 55 s，33個循環(huán)；72 ℃ 7 min。Rb：94 ℃ 2 min;94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。MAD2：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。β-actin：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，33個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳(含5 mg/L溴化乙啶)后，在紫外燈下觀察結(jié)果。通過Quantity One圖像分析軟件(Bio-Rad)讀取目的電泳條帶的斑點(diǎn)密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組的XPD、Rb及MAD2的密度掃描值，獲得其mRNA相對表達(dá)量。實(shí)驗重復(fù)3次。

表1 引物序列和產(chǎn)物大小

2.3Western blotting檢測XPD、Rb及MAD2蛋白的表達(dá)量 轉(zhuǎn)染48 h后使用蛋白抽提液分別提取4組細(xì)胞的總蛋白，全自動生化分析儀(Beckman)測定蛋白濃度。取 40 μg進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉溶液 4 ℃封閉過夜。膜分別用按相應(yīng)比例稀釋的XPD、Rb、MAD2和β-actin Ⅰ抗孵育，4 ℃過夜， Ⅱ抗孵育2 h，最后ECL顯色，經(jīng)顯影、定影后，觀察結(jié)果。通過Quantity One圖像分析軟件(Bio-Rad)讀取目的電泳條帶的斑點(diǎn)密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組的XPD、Rb及MAD2的密度掃描值，獲得其蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗重復(fù)3次。

2.4MTT法檢測細(xì)胞增殖力 上述4組細(xì)胞于對數(shù)期分別接種于96孔板中，1×103cells/well，以培養(yǎng)基為對照組，于37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24 h后每孔加入5 g/L MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入100 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀測定492 nm處各孔吸光度(A)值。實(shí)驗重復(fù)3次。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 4組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，然后收集到EP管內(nèi)，按照凱基細(xì)胞凋亡試劑盒說明書依次加入試劑，然后避光孵育，流式細(xì)胞術(shù)在1 h內(nèi)上機(jī)檢測。實(shí)驗重復(fù)3次。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 4組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，然后收集到EP管內(nèi)，用PBS洗滌細(xì)胞1次，制備單細(xì)胞懸液離心后，去除上清，加入70%冷乙醇500 μL固定過夜。染色前用PBS洗去固定液，按照凱基周期檢測試劑盒說明加入100 μL RNaseA 37 ℃水浴30 min，再加入400 μL碘化丙啶染色混勻，4 ℃避光30 min，應(yīng)用FACSCalibar流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，得出細(xì)胞各周期的百分率。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 pEGFP-N2-XPD轉(zhuǎn)染結(jié)果

通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方式將pEGFP-N2空載質(zhì)粒和pEGFP-N2-XPD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞24 h后，熒光顯微鏡下可見XPD組和N2組細(xì)胞中均有綠色熒光蛋白的表達(dá)，綠色熒光覆蓋率75%以上，未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞則未見表達(dá)，見圖1。

2 各組細(xì)胞內(nèi)XPD、Rb及MAD2 mRNA的表達(dá)

XPD組中XPD和Rb mRNA表達(dá)量明顯高于其它3組，而MAD2 mRNA表達(dá)量低于其它3組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖2。

Figure 1. The green fluorescent protein expression in HepG2 cells transfected with pEGFP-N2 or pEGFP-N2-XPD under fluorescence microscope (×100).

Figure 2. Relative expression of XPD, Rb and MAD2 mRNA in HepG2 cells detected by RT-PCR. M: marker; 1: blank control group; 2: liposome group; 3: pEGFP-N2 group; 4: pEGFP-N2-XPD group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 1.

3 各組細(xì)胞XPD 、Rb及MAD2蛋白的表達(dá)

XPD組中XPD、Rb蛋白表達(dá)量明顯高于其它3組，而MAD2蛋白表達(dá)量低于其它3組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖3。

4 pEGFP-N2-XPD重組質(zhì)粒對HepG2肝癌細(xì)胞增殖活力的影響

空白對照組、脂質(zhì)體組、N2組和XPD組的A值分別為0.624±0.114、0.631±0.144、0.635±0.164和0.300±0.083，XPD組A值明顯低于其它3組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

5 細(xì)胞凋亡情況

空白對照組、脂質(zhì)體組、N2組細(xì)胞和XPD組細(xì)胞凋亡率分別是(5.57±1.58)%、(7.71±1.50)%、(12.70±5.43)%和(33.70±1.39)%，XPD組細(xì)胞凋亡明顯高于其它3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖4。

6 細(xì)胞周期情況

XPD組的G1期細(xì)胞明顯高于空白對照組、脂質(zhì)體組及N2組細(xì)胞，S期細(xì)胞較其它3組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，空白對照組、脂質(zhì)體組及N2組細(xì)胞之間G1期和S期差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見圖5。

Figure 3. Relative expression of XPD, Rb and MAD2 proteins in HepG2 cells analysis by Western blotting. 1: blank control group; 2: liposome group; 3: pEGFP-N2 group; 4: pEGFP-N2-XPD group. Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs 1.

Figure 4. Flow cytometric analysis of cell apoptosis. A:blank control group; B:liposome group; C:pEGFP-N2 group; D:pEGFP-N2-XPD group. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs A.

Figure 5. Flow cytometric analysis of cell cycle. A:blank control group; B: liposome group; C:pEGFP-N2 group; D:pEGFP-N2-XPD group. Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs A.

討 論

XPD是哺乳動物TFⅡH的一個組分。TFⅡH分為2個基團(tuán)：核心區(qū)(XPB、p52、p62、p44和p34)和CAK(CDK-activating kinase)區(qū)(CDK7、cyclin H和MAT1)，其中XPD作為橋梁起連接這2個集團(tuán)的作用[4]，參與真核生物的轉(zhuǎn)錄起始。XPD在真核生物NER中起重要作用[1]，XPD與XPA結(jié)合是切除性修復(fù)的關(guān)鍵一步，XPD通過XPA的協(xié)助結(jié)合到DNA損傷部位，然后與XPB解螺旋酶在損傷部位負(fù)責(zé)打開DNA雙鏈[5-6]。大量研究表明XPD還參與了細(xì)胞的增殖、凋亡、腫瘤的發(fā)生甚至化療藥物抗藥性的產(chǎn)生[7-8]。本實(shí)驗將XPD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人HepG2肝癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其會抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡。

MAD2是SAC其中一個關(guān)鍵組分，SAC管理姐妹染色體的分配是否準(zhǔn)確， MAD2主要感應(yīng)微管與著絲點(diǎn)的連接[9]。缺少微管附著或附著不穩(wěn)定的著絲粒會釋放抑制后期促發(fā)信號，其中MAD2和BubR1(有絲分裂紡錘體組裝檢測點(diǎn)蛋白)起關(guān)鍵作用，MAD2與細(xì)胞分裂周期蛋白20(cell division cycle 20 protein，CDC20)結(jié)合，抑制有絲分裂后期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase-promoting complex，APC)泛素化，導(dǎo)致分離酶抑制蛋白securin降解受阻，securin會抑制分離酶separase活性使聯(lián)會蛋白不能降解，從而延遲姐妹染色單體的分離和有絲分裂后期的啟動，以爭取時間讓微管與著絲粒完全穩(wěn)定地附著，一旦全部染色體的著絲粒和微管穩(wěn)定附著，著絲粒就停止釋放抑制信號，姐妹染色單體同步分離，啟動有絲分裂后期。如果檢查點(diǎn)中任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，姐妹染色單體不能準(zhǔn)確分離，就可能導(dǎo)致非整倍體，引起腫瘤的發(fā)生。目前研究表明MAD2與腫瘤的發(fā)生及預(yù)后有關(guān)，各種腫瘤細(xì)胞中如胃癌、肝癌、淋巴瘤等細(xì)胞中MAD2表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞，MAD2表達(dá)增高會降低腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，與腫瘤的預(yù)后不良有關(guān)[5]。還有研究表明，MAD2在DNA核酸切除性修復(fù)過程中扮演著重要角色，MAD2過表達(dá)會抑制XPD在細(xì)胞核內(nèi)積累，并競爭性抑制DNA修復(fù)蛋白之間的正常結(jié)合，從而負(fù)調(diào)控DNA核酸切除性修復(fù)[5]，但目前暫沒有研究表明XPD是否會影響MAD2的表達(dá)。本實(shí)驗將重組質(zhì)粒pEGFP-N2-XPD轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)XPD過表達(dá)能明顯抑制MAD2的表達(dá)。綜合前人的研究表明，XPD 與MAD2之間是可以相互調(diào)節(jié)的，具體通過何種機(jī)制相互調(diào)節(jié)有待進(jìn)一步研究。

目前研究表明MAD2的異常表達(dá)跟Rb基因發(fā)生突變或者缺失有關(guān)。Rb基因是人類發(fā)現(xiàn)并克隆的第1個抗癌基因[10]，MAD2的表達(dá)是通過Rb途徑來調(diào)節(jié)的，正常情況下Rb會抑制E2F轉(zhuǎn)錄因子和MAD2的表達(dá)，如果Rb基因發(fā)生突變或者缺失， E2F和MAD2的表達(dá)會增高[2]。當(dāng)細(xì)胞DNA發(fā)生損傷時，將啟動DNA損傷檢查點(diǎn)(G1-S期檢查點(diǎn))，通過各種監(jiān)測信號，抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的激活，從而抑制Rb蛋白的磷酸化，低磷酸化的Rb與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合，導(dǎo)致E2F失活不能與相關(guān)的靶基因結(jié)合，抑制了相關(guān)蛋白的表達(dá)(包括MAD2)，阻滯了細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)換[11-12]。于是我們設(shè)想XPD是否也會影響Rb的表達(dá)或者功能的變化。本實(shí)驗將重組質(zhì)粒pEGFP-N2-XPD轉(zhuǎn)染人HepG2肝癌細(xì)胞后檢測Rb表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)XPD過表達(dá)能明顯促進(jìn)Rb的表達(dá)。

綜上所述，XPD過表達(dá)可以抑制MAD2的表達(dá)和肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)Rb的表達(dá)。但是XPD是否是通過Rb途徑來抑制MAD2的表達(dá)，以及XPD是否會影響Rb蛋白的磷酸化有待進(jìn)一步的研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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