卡托普利對(duì)AGS胃癌裸鼠移植瘤模型的調(diào)控作用*

李 力， 金震東， 蔡 敏， 王 斌， 程烽濤

(1第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433； 2上海楊浦區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200090)

胃癌是常見高發(fā)惡性腫瘤之一，且死亡率居高不下[1-2]。胃癌的化療藥物研發(fā)周期長(zhǎng)、耗資大風(fēng)險(xiǎn)高，致使目前新藥的研發(fā)進(jìn)展較為緩慢，所以既能夠避免新藥研發(fā)耗時(shí)又能夠保障安全性的“老藥新用”就成為了現(xiàn)在臨床藥品研發(fā)的一大關(guān)注熱點(diǎn)。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑卡托普利(captopril)已臨床應(yīng)用多年，具有較好的安全性，長(zhǎng)期應(yīng)用對(duì)多種腫瘤的發(fā)生有抑制作用[3-4]。但是，到目前為止，關(guān)于卡托普利對(duì)胃癌的治療作用尚無(wú)報(bào)道，因此探索卡托普利在胃癌患者中的可行性具有重要的臨床價(jià)值。本研究將首次從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)角度觀察卡托普利對(duì)胃癌的治療作用，并初步探討其臨床治療的可行性及機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要實(shí)驗(yàn)材料

裸鼠(由上海斯萊克動(dòng)物中心提供)，人胃癌細(xì)胞株AGS(中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心)，卡托普利(Sigma)，實(shí)驗(yàn)所需各檢測(cè)指標(biāo)抗體均購(gòu)于Abcam，Trizol(Invitrogen),real-time檢測(cè)儀(ABI-7300)，熒光顯微鏡(CX41，Olympus)，IMS圖像分析系統(tǒng)(基爾頓生物科技上海有限公司)。

引物序列：Ki-67 上游引物5’-TGGCCTACCTGGTCTTAGTTC-3’，下游引物5’-TCCTCTTGGTTGGCGTTTC-3’；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)上游引物5’-GACTCAAAGCCACCTCATTC-3’，下游引物5’-GCCTTGCCTTCCTAAATACC-3’;Bax上游引物5’-TAGCAAACTGGTGCTCAAGG-3’,下游引物5’-AGCCACAAAGATGGTCACTG-3’；Bcl-2上游引物5’-CATGCACCAAGTCCAGTACAG-3’,下游引物5’-TACAGGCATTGCCGCATAG-3’；GAPDH上游引物5’-ATCACTGCCACCCAGAAG-3’,下游引物5’-TCCACGACGGACACATTG-3’。

2 方法

2.1模型制作及分組

2.1.1動(dòng)物 BALB/c裸鼠，5～6周齡，雄性，SPF級(jí)。

2.1.2AGS腫瘤細(xì)胞皮下注射法動(dòng)物模型制作 將足夠體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用0.25%胰酶消化后洗出，最后加入PBS或0.9%NaCl注射液制成1×1010/L，鏡下計(jì)數(shù)，并觀察活細(xì)胞數(shù)在95%以上。一次性注射器抽取混勻的細(xì)胞懸液0.2 mL，左手固定小鼠偏右側(cè)，皮膚消毒后，從小鼠側(cè)面肋骨緣處進(jìn)針至腋窩皮下，推入細(xì)胞懸液，緩緩拔出針頭，用針橫推皮下液體，使其固定在腋窩部位，可使腫瘤生長(zhǎng)較圓整。給予純凈水，標(biāo)準(zhǔn)飼料，屏障系統(tǒng)內(nèi)IVC隔離籠具飼養(yǎng)。

2.1.3分組 將裸鼠隨機(jī)分為3組，每組各15只，分組情況如下：陽(yáng)性對(duì)照(5-氟尿嘧啶，5-fluorouracil,5-Fu)組、對(duì)照(生理鹽水)組和卡托普利干預(yù)組。

2.2處理 陽(yáng)性對(duì)照組給予5-Fu腹腔注射，劑量為(0.6 mg/只),卡托普利干預(yù)組給予卡托普利灌胃，劑量為(2.8 mg/只)，實(shí)驗(yàn)開始后每天觀察裸鼠的生存質(zhì)量并注意是否出現(xiàn)死鼠[5]。干預(yù)31 d后，無(wú)死鼠，取腫瘤組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3檢測(cè)方法 將所取組織經(jīng)脫水-石蠟包埋-切片后進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)：(1)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blotting以及免疫組化檢測(cè)Ki-67、STAT3、Bax、Bcl-2和磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3,p-STAT3)表達(dá)；(2)TUNEL+DAPI染色法：對(duì)組織切片顯微鏡下觀察并拍照，檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腫瘤生長(zhǎng)情況

造模成功后，各組小鼠均出現(xiàn)差異不明顯的腫瘤結(jié)塊。隨時(shí)間推移，對(duì)照組裸鼠腫瘤塊較其它2組明顯生長(zhǎng)加快，卡托普利組居中，5-Fu組最慢。到第14天各組差異開始明顯加大(P<0.05)，變化趨勢(shì)如圖1所示。

Figure 1. Growth of the tumor.Mean±SD.n=15.*P<0.05 vs conrtol； #P<0.05 vs 5-Fu.

2 Tunel+DAPI染色結(jié)果

TUNEL+DAPI結(jié)果顯示，5-Fu組以及卡托普利組的組織癌細(xì)胞凋亡率[(21.45±0.11)%和(37.57±0.13)%]較對(duì)照組[(11.10±0.05)%]有明顯上升(P<0.05)?？ㄍ衅绽M凋亡率最高，與5-Fu組比較差異顯著(P<0.05)，見圖2。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

由Real-time結(jié)果(圖3)可以看出，各組藥物干預(yù)31 d后，各相關(guān)因子mRNA表達(dá)量均有不同程度變化，其中，卡托普利組Bax相較于對(duì)照組有明顯上升，而STAT3、Ki-67以及Bcl-2的表達(dá)則呈下調(diào)趨勢(shì)(P<0.05)。5-Fu組與卡托普利組各相關(guān)因子表達(dá)趨勢(shì)相一致，但2組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

4 免疫組化結(jié)果

相較于對(duì)照組，卡托普利組Bax表達(dá)明顯上升，而Ki-67、STAT3以及Bcl-2的表達(dá)下降(P<0.05)?？ㄍ衅绽M各因子表達(dá)趨勢(shì)與5-Fu組表達(dá)趨勢(shì)一致，但2組間差異顯著(P<0.05)。免疫組化結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果吻合，見圖4、表1。

5 Western blotting檢測(cè)結(jié)果

5-Fu組和卡托普利組p-STAT3和STAT3蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，見圖5。

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)在癌癥發(fā)生的各個(gè)階段都起著極為重要的作用，但機(jī)制未被明確闡述。目前RAS系統(tǒng)抑制劑——血管緊張素II(angiotensinⅡ，AngⅡ)抑制劑作為抗癌藥的研究受到眾多關(guān)注，但其對(duì)胃癌的應(yīng)用研究尚少。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑一直以來(lái)主要作為降壓藥品被廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，該類藥物的抗腫瘤作用日益受到眾多學(xué)者們的關(guān)注并進(jìn)行了相關(guān)的研究。本實(shí)驗(yàn)研究以AGS裸鼠胃癌模型為研究對(duì)象，通過觀察檢測(cè)使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利治療后裸鼠腫瘤相關(guān)因子的變化，來(lái)判斷并推測(cè)卡托普利在胃癌治療應(yīng)用方面的可行性并初步探索其作用機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，藥品干預(yù)31 d后，腫瘤細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組有明顯升高(P<0.05)，可見卡托普利在胃癌治療方面具有一定可行性。通過腫瘤相關(guān)因子Ki-67、STAT3、p-STAT3、Bax和Bcl-2的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這些因子在卡托普利干預(yù)的同時(shí)有著相應(yīng)的趨勢(shì)變化，推測(cè)可能在干預(yù)過程中，卡托普利直接或間接調(diào)控或者影響腫瘤相關(guān)因子，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或誘導(dǎo)其凋亡的目的。到目前為止，研究發(fā)現(xiàn)卡托普利不僅具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[6-7]，還能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[8]，曾有人推測(cè)這2種截然不同的結(jié)果可能是由細(xì)胞類型、卡托普利用藥量以及病理狀態(tài)所決定的[9]，還有研究表明，Ang Ⅱ能夠調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子促血管發(fā)生，它可能是通過血管緊張素II 1型受體(angiotensin II type 1 receptor, AT1R) 下調(diào)血管生成作用[10-12]。亦有研究表明，ACEI類藥品可能通過AngⅡ-AT1R途徑減少血管的發(fā)生及腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移[13]。STAT3作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化家族的重要成員，廣泛表達(dá)于各種類型的細(xì)胞以及組織當(dāng)中，它的持續(xù)激活可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖與惡性轉(zhuǎn)化，被認(rèn)為是癌基因的一種[14]。研究證明，它并不直接介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，而是通過對(duì)其下游靶基因(如Bcl-2、Bax等)的調(diào)控來(lái)影響腫瘤的進(jìn)程，且STAT3蛋白表達(dá)與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白之間也具有顯著相關(guān)性[15]。STAT3以及它的活化形態(tài)p-STAT3在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中也起著一定作用[16]。STAT3與 p-STAT3在腫瘤中的表達(dá)一定程度上也表明了腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移程度[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過卡托普利干預(yù)后，腫瘤組織中的STAT3以及p-STAT3表達(dá)均有降低且腫瘤細(xì)胞凋亡增加，說明卡托普利可能是通過對(duì)STAT3的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)或抑制其增殖。本實(shí)驗(yàn)研究表明，卡托普利對(duì)胃癌的治療有較為明顯的治療效果，在對(duì)胃癌的臨床治療上可能具有一定可行性，但其臨床可應(yīng)用性需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

Figure 4. Immunohistochemical results of the related factors (×200).

表1 相關(guān)因子陽(yáng)性表達(dá)面積的比較

Figure 5. Expression of p-STAT3 and STAT3 proteins in diffe-rent groups.Mean±SD.n=15.*P<0.05 vs conrtol；#P<0.05 vs 5-Fu.

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Leung WK, Wu MS, Kakugawa Y，et al. Screening for gastric cancer in Asia: current evidence and practice[J]. Lancet Oncol，2008， 9(3): 279-287.

[2] Siegel R, Naishadham D,Jemal A. Cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin，2012，62(1):10-29.

[3] Attoub S, Gaben AM, Al-Salam S, et al. Captopril as a potential inhibitor of lung tumor growth and metastasis[J].Ann N Y Acad Sci, 2008，1138: 65-72.

[4] Small W, Molteni A, Kim YT, et al .Captopril modulates hormone receptor concentration and inhibits proliferation of human mammary ductal carcinoma cells in culture[J]. Breast Cancer Res Treat，1997，44(3): 217-224.

[5] Krusche B, Arend J,Efferth T. Synergistic inhibition of angiogenesis by artesunate and captoprilinvitroandinvivo[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:454783.

[6] Buemi M, Allegra A, Marino D, et al. Does captopril have a direct pro-apoptotic effect?[J]. Nephron，1999， 81(1):99-101.

[7] Holm AM, Andersen CB, Haunsφ S, et al. ACE-inhibition promotes apoptosis after balloon injury of rat carotid arteries[J]. Cardiovasc Res,2000，45(3):777-782.

[8] 蔣賢忠，邱曉曉，李劍鳴，等.卡托普利對(duì)calpain介導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志，2012，28(11):2081-2082.

[9] 蘇 騰, 蘇 穎, 鄭 楊. 卡托普利干預(yù)細(xì)胞凋亡作用研究進(jìn)展[J].心臟雜志， 2007， 19(3): 351-353.

[10] Zhang GX ,Pu SY ,Yang YZ, et al. Effect of losartan and captopril on expression of cardiac angiotensinⅡAT1receptor mRNA in rats following myocardial in farction[J]. Zhongguo Yao Li Xue Bao,1997，18(5):431-434.

[11] Yamada T, Akishita M, Pollman MJ, et al. AngiotensinⅡ type 2 receptor mediates vascular smooth muscle cell apoptosis and angiotensin Ⅱ type1 receptor action: aninvitrogene transfer study[J]. Life Sci，1998, 63(19): PL289-PL295.

[12] Tea BS, Der PB, Sarkissian S, et al. Proapoptotic and growth-inhibitory role of angiotensin II type 2 receptor in vasucar smooth muscles cell of spontaneously hypertension ratsinvivo[J]. Hypertension， 2000， 35(5):1069-1073.

[13] Walther T, Menrad A, Orzechwski HD, et al. Differential regulation ofinvivoangiogenesis by angiotensin II receptors[J]. FASEB J， 2003，17(14):2061-2067.

[14] Bromberg JF, Wrzeszczynska MH, Devgan G, et al. STAT3 as an oncogene[J]. Cell, 1999, 98(3): 295-303.

[15] 殷 芳，吳 飛，陳 佳，等. TAMs在皮膚惡性黑素瘤組織中的浸潤(rùn)及與STAT3、VEGF蛋白表達(dá)的關(guān)系[J]. 中華全科醫(yī)學(xué)， 2013, 11(6):840-843.

[16] 牛桂軍, 黃杰安. STAT3在消化系統(tǒng)惡性腫瘤研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際消化病雜志, 2010，30(1):41-43.

[17] Kusaba T, Nakayama T, Yamazumi K, et al．Activation of STAT3 is a marker of poor prognosis in human colorectal cancer[J]. Oncol Rep, 2006,15(6): 1445-1451．