苦參堿對(duì)人髓母細(xì)胞瘤D341細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響*

周開宇， 毛天明， 陳 茜， 羅永康

(臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬臺(tái)州市立醫(yī)院，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院臺(tái)州分院神經(jīng)外科, 浙江 臺(tái)州318000)

髓母細(xì)胞瘤是一種高度惡性呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的顱內(nèi)腫瘤，好發(fā)于兒童，偶見于成年，目前以顯微手術(shù)切除為主輔以放療、化療等綜合治療[1]；但3歲以下兒童患者放療會(huì)嚴(yán)重影響發(fā)育，化療毒副作用比較嚴(yán)重，仍有30%～50% 的患兒治療效果極差，預(yù)后非常不良[2]。因此尋找一種對(duì)人髓母細(xì)胞瘤有效的抗瘤藥物，有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

惡性腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡是對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的主要方面?？鄥A是苦參、苦豆子、廣豆根等豆科槐屬植物中生物堿的主要成分，具有良好的藥理活性，能利尿解毒、清熱利濕、退黃降酶、抗心律失常等作用，且無(wú)明顯的毒副作用。近期的研究表明，苦參堿具有抗腫瘤的效應(yīng)，能抑制膽囊癌、前列腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[3-4]。但是對(duì)于苦參堿作用于人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的研究卻少有報(bào)道，目前也不清楚苦參堿是否會(huì)抑制該瘤細(xì)胞的增殖，以及分子作用機(jī)制。因此本研究主要通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)來(lái)研究苦參堿對(duì)人髓母細(xì)胞瘤D341細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，并探討相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt和磷酸化Akt(phosphorylated Akt, p-Akt)在苦參堿作用下表達(dá)的改變，為人髓母細(xì)胞瘤的發(fā)病及藥物治療提供重要的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

本研究中苦參堿由寧波天衡制藥有限公司提供，規(guī)格為 50 mg∶5 L。 D341細(xì)胞株由北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞庫(kù)提供，Bax、 Bcl-2、Akt、p-Akt抗體、CCK-8和Annexin V-FITC試劑盒均由上海藍(lán)基生物科技有限公司提供，透射電子顯微鏡(JEM-1011)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將D341細(xì)胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，并于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每2～3 d換1次液、每7 d左右傳代1次。

2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)、配制成濃度為5×107cells/L的細(xì)胞懸液，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液；將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，用培養(yǎng)基稀釋苦參堿至所需濃度(0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L和2.0 g/L)，每孔加入200 μL相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組；再將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72 h；向每孔中加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)3 h；搖床10 min輕輕混勻；酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm讀出每孔的吸光度(A)，計(jì)算抑制率。

2.3細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 將經(jīng)體外培養(yǎng)的D341細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。其中實(shí)驗(yàn)組加入苦參堿濃度為2.0 g/L，對(duì)照組不加苦參堿。苦參堿作用24、48和72 h后分別離心(1 000 r/min，5 min)收集細(xì)胞，冷PBS洗滌2次；2.5%戊二醛固定48 h、1%餓酸再固定90 min，乙醇-丙酮梯度脫水，包埋，烘箱內(nèi)固化，切片，透射電鏡下觀察。

2.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化接種到6孔板中，次日，根據(jù)組別設(shè)置加入用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度(0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L和2.0 g/L)，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組；藥物作用24 h、48 h和72 h后，消化收集細(xì)胞；用PBS洗滌細(xì)胞2次(2 000 r/min離心5 min)收集5×105細(xì)胞；加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞；然后再加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。

2.5Western blotting檢測(cè)瘤細(xì)胞Bax、Bcl-2、Akt和p-Akt蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的D341細(xì)胞接種于24孔板中，每孔200 μL，細(xì)胞密度為2×108/L，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分4組。苦參堿組：加入苦參堿濃度分別為0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L和2.0 g/L；對(duì)照組除不加苦參堿，其余條件完全一致。各組分別再培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，收集各組細(xì)胞。加入100 mL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，以BCA法進(jìn)行蛋白濃度的定量測(cè)定。常規(guī)制膠、上樣，蛋白電泳，然后轉(zhuǎn)膜，封閉。用Ⅰ抗稀釋液 4 ℃孵育過(guò)夜：Bax (1∶5 000)、Bcl-2 (1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶500)和β-actin(鼠抗1∶1 000)。TBST洗膜 3次, 每次10 min。將膜與HRP結(jié)合的Ⅱ抗(辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗兔；1∶5 000)室溫下?lián)u蕩孵育2 h， TBST充分洗膜，漂洗3次，每次10 min?；瘜W(xué)發(fā)光顯色，暗盒中曝光，再顯影和定影，應(yīng)用凝膠掃描儀對(duì)膠片進(jìn)行光密度掃描，并以β-actin為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 苦參堿對(duì)D341細(xì)胞增殖的抑制作用

CCK-8法顯示，在同一作用時(shí)間下，不同濃度的苦參堿對(duì)D341細(xì)胞增殖的抑制程度不同，單因素方差分析顯示任意兩組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在此次檢測(cè)的范圍內(nèi)，相同作用時(shí)間下D341細(xì)胞的增殖抑制率隨藥物濃度的增加而逐漸升高，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；同一濃度的苦參堿對(duì)D341細(xì)胞增殖的抑制程度隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，特別是苦參堿濃度在1.5 g/L和2.0 g/L時(shí)，其作用更明顯,見圖1。

2 苦參堿對(duì)D341細(xì)胞作用下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察

苦參堿(2.0 g/L)作用于人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，在透射電鏡下觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果顯示，苦參堿誘導(dǎo)后細(xì)胞凋亡變化明顯，隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加，染色質(zhì)趨邊固縮，胞漿中空泡增多、變大，并且出現(xiàn)凋亡小體。陰性對(duì)照組細(xì)胞核及染色質(zhì)分布正常，見圖2。

Figure 1. Inhibitory effect of matrine on the proliferation of D341 cells. Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs 72 h; △△P<0.01 vs 0.5, 1.0 or 1.5 g/L matrine.

Figure 2. Cell ultrastructure observation under transmission electron microscope.

3 苦參堿對(duì)D341細(xì)胞的凋亡作用

苦參堿作用于D341細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率見圖3。用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：正常細(xì)胞(FITC-，PI-)在流式細(xì)胞分析圖上為L(zhǎng)L區(qū)；早期凋亡細(xì)胞(FITC+，PI-)在流式細(xì)胞分析圖上為L(zhǎng)R區(qū)；后期凋亡細(xì)胞(FITC+，PI+)在流式細(xì)胞分析圖上為UR區(qū)。苦參堿能夠明顯誘導(dǎo)D341細(xì)胞凋亡，且隨著苦參堿濃度的增加，D341細(xì)胞的凋亡率逐漸升高。方差分析顯示，不同濃度的苦參堿作用下與陰性對(duì)照組間凋亡率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

4 Bax、Bcl-2、Akt和 p-Akt表達(dá)水平的變化

不同濃度的苦參堿對(duì)D341細(xì)胞作用24 h、48 h和72 h后，隨著藥物濃度的增加，D341細(xì)胞Bax的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，Bcl-2和p-Akt的表達(dá)逐漸下降，見圖4。

討 論

《神農(nóng)本草經(jīng)》曾注釋：苦參，味苦寒，主心腹結(jié)氣、瘕、積聚、黃疸?？鄥A是苦參、苦豆子、廣豆根等豆科槐屬植物中生物堿的主要成分，屬于四環(huán)的喹嗪啶類，其化學(xué)式為C15H24N20，分子骨架可看作2個(gè)喹嗪啶環(huán)的雜體。近期的研究結(jié)果表明[5-6]：苦參堿對(duì)腫瘤的防治有很大的作用，它是一種很有前途具有抗腫瘤作用的藥物。

在苦參堿眾多的抗腫瘤活性功能中，抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能成為近年來(lái)各學(xué)者報(bào)道的熱點(diǎn)。Yu等[7]提出,苦參堿能抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，且與劑量呈量效關(guān)系，苦參堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制自噬保護(hù)機(jī)制可能是苦參堿抗腫瘤潛力的一個(gè)主要方面。Shao等[8]發(fā)現(xiàn),苦參堿能有效抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，可作為一種很有發(fā)展前景的抗乳腺癌藥物。Liang等[9]在人骨肉瘤細(xì)胞的體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)研究中指出：苦參堿的增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用，主要是通過(guò)藥物上調(diào)瘤細(xì)胞Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)而起作用。關(guān)于苦參堿對(duì)人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的抑制增殖、促進(jìn)凋亡作用目前鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，在同一作用時(shí)間下，不同濃度的苦參堿對(duì)D341細(xì)胞增殖的抑制程度不同，相同作用時(shí)間下增殖抑制率隨藥物濃度的增加而逐漸升高，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；同一濃度的苦參堿對(duì)D341細(xì)胞增殖的抑制程度隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，特別是苦參堿濃度比較高時(shí)，其作用更明顯；苦參堿能夠明顯誘導(dǎo)D341細(xì)胞凋亡，且隨著苦參堿濃度的增加，D341細(xì)胞的凋亡率逐漸升高。D341細(xì)胞經(jīng)苦參堿作用后，細(xì)胞染色質(zhì)趨邊固縮，胞漿中空泡增多、變大，并且出現(xiàn)凋亡小體。這些均與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[10-11]。

Figure 3. D341 cell apoptosis analysis detected by flow cytometry with matrine treatment for 24 h and apoptotic rates of D341 cells during 24, 48 and 72 h. Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs negative control.

本實(shí)驗(yàn)研究了D341細(xì)胞在苦參堿作用下，凋亡相關(guān)蛋白如Bax和Bcl-2基因表達(dá)水平的變化。隨著藥物濃度的增加或者作用時(shí)間的延長(zhǎng)，D341細(xì)胞Bax的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，Bcl-2的表達(dá)逐漸下降。Bcl-2蛋白家族在誘導(dǎo)凋亡的線粒體信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起著重要的作用，它主要抑制細(xì)胞的凋亡，在腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)[12]。體外研究中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Bcl-2能抑制放療或化療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，是放化療失敗的主要原因[13]。細(xì)胞在凋亡過(guò)程中主要表現(xiàn)為Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-2/Bax比例下降，Bcl-2與Bax的異源二聚體減少，Bax同源二聚體增多[14]。目前認(rèn)為[15]，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與凋亡促進(jìn)蛋白Bax拮抗，抑制細(xì)胞色素C自線粒體釋放到胞質(zhì)，阻止細(xì)胞色素C對(duì)caspase蛋白酶激活。Bcl-2還能促進(jìn)谷胱甘肽進(jìn)入細(xì)胞核，從而改變核內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，阻止caspase蛋白酶的活動(dòng)和其它核改變，抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生。本研究認(rèn)為苦參堿正是通過(guò)調(diào)控Bcl-2與Bax的表達(dá)而誘導(dǎo)人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡、分化，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了D341細(xì)胞在苦參堿作用下，瘤細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)途徑的變化，苦參堿作用48 h后，隨著藥物濃度的增加， p-Akt的表達(dá)水平顯著降低。PI3K是一種細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，PI3K介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以通過(guò)不同的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、分化、凋亡等活動(dòng)[16]。蛋白激酶Akt是PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑重要的信號(hào)分子，其可被PI3K激活成為具有磷酸激酶活性的p-Akt，p-Akt 可以增加NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，增加腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。PI3K/Akt信號(hào)途徑的活化，即p-AKT一方面可以激活或抑制其多種下游靶蛋白，如可抑制促凋亡蛋白Bad的激活以及caspase激酶的活化, 增加轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性以及上調(diào)凋亡拮抗蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，另一方面可誘發(fā)下游一系列底物改變，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡信號(hào)通路酶caspase-9的前體第196位Ser磷酸化，阻止caspase-9 對(duì)Apaf-1的結(jié)合與活化作用，使其失活，從而阻斷內(nèi)源性凋亡途徑[18]。有文獻(xiàn)報(bào)道[19]，在多種白血病細(xì)胞中均有PI3K/Akt 信號(hào)途徑的活化，而且PI3K/Akt的活性與白血病患者的化療效果、臨床預(yù)后等多種指標(biāo)有關(guān)。我們的研究結(jié)果提示，苦參堿作用D341細(xì)胞，可能通過(guò)抑制PI3K/Akt的信號(hào)途徑的活化，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Figure 4. Analysis of Bax, Bcl-2, Akt, p-Akt expression by Western blotting. 1: negative control; 2: matrine 0.5 g/L; 3: matrine 1.0 g/L; 4: matrine 1.5 g/L; 5: matrine 2.0 g/L.Mean±SD.n=3.

因此，深入研究苦參堿對(duì)人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制，通過(guò)干預(yù)腫瘤細(xì)胞凋亡活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，在人髓母細(xì)胞瘤治療領(lǐng)域具有廣泛且深遠(yuǎn)的臨床意義和應(yīng)用前景。

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