上/下調(diào)miR-21對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)作用及對(duì)西妥昔單抗藥物敏感性的影響*

鞏 波， 李東風(fēng)， 謝子鈞， 段伊帆， 李子俊△

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510515；廣東省人民醫(yī)院， 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 2消化科， 3醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510080)

在美國(guó)和大部分歐洲國(guó)家，結(jié)直腸癌是第3位常見(jiàn)的惡性腫瘤，與腫瘤相關(guān)的死亡原因排第2位，在這些病人中，大約有20%的病人在獲得臨床診斷時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移[1]。西妥昔單抗靶向表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移，已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于KRAS野生型結(jié)直腸癌的治療[2]。但是并非所有KRAS野生型結(jié)直腸癌都能從西妥昔單抗治療中獲益，據(jù)報(bào)道在占結(jié)直腸癌60%～70% 的KRAS野生型中，只有其中60%獲得治療反應(yīng)，余下40% KRAS野生型結(jié)直腸癌治療無(wú)效或耐藥[3]。而迄今研究表明miR-21在人體31種腫瘤中表達(dá)異常，也是最常見(jiàn)的異常microRNA之一，是一種致癌性microRNA， 在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)上調(diào)/下調(diào)miR-21，探討其對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞RKO的增殖、克隆形成能力及對(duì)西妥昔單抗敏感性的影響，為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

人結(jié)腸癌細(xì)胞株RKO(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)使用MEM Alpha培養(yǎng)基(Life Technologies)加10%胎牛血清(Life Technologies)，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)。

2 方法

2.1慢病毒載體的構(gòu)建 根據(jù)人miR-21的基因序列，制備上調(diào)/下調(diào)miR-21雙鏈DNA Oligo，設(shè)計(jì)包含目的基因序列和酶切位點(diǎn)的互補(bǔ)序列，LV-miR-21上游引物5’-CGGCCGCGACTCTAGTTATCAAATCCTGCCTGACTG-3’，下游引物5’- ATAAGCTTGATATCG-TCCTCCCTCCATACTGCTG-3’；LV-anti-miR-21上游引物5’-CCGGTCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTTTG-3’，下游引物5’-AATTCAAAAATAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3’。將引物退火形成帶黏性末端的雙鏈DNA，利用T4 DNA ligase分別連接到GV217和GV159載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，挑選轉(zhuǎn)化的菌落，用菌落PCR進(jìn)行鑒定和測(cè)序。

2.2慢病毒載體的包裝 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化重懸后按1∶5比例傳至poly-(D-lysine)(PDL)包被的10 cm皿中，加完全培養(yǎng)基37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)約24 h，細(xì)胞密度達(dá)50%～70%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。取1.5 mL/dish Opti-MEM、表達(dá)質(zhì)粒6 μg/dish、包裝質(zhì)粒Packaging Mix 6 μg/dish，混勻，室溫下溫育5 min；取1.5 mL/dish Opti-MEM和POLOdeli-vererTM3000 Transfection reagent 24 μL/dish，輕輕混勻，室溫下溫育5 min。將兩者混合，室溫下孵育20 min。將DNA與POLOdelivererTM3000 Transfection reagent 的復(fù)合液均勻地滴加在293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中混勻，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，收集293T細(xì)胞上清液，4 ℃暫存；細(xì)胞更換新鮮完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，收集病毒上清，與第1次收集的混合，于 4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，用0.45 μm 醋酸纖維素膜的濾器過(guò)濾于Beckman SW28離心管中，每管裝36 mL病毒，4 ℃、22 000 r/min 離心2 h，棄上清，每管用130 μL預(yù)冷的PBS溶解沉淀，每管100 μL分裝，-80 ℃保存。

2.3慢病毒滴度測(cè)定 測(cè)定前1 d，取測(cè)定滴度所需的293T細(xì)胞，每孔加100 μL，4×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，根據(jù)病毒的預(yù)期滴度，準(zhǔn)備7～10個(gè)無(wú)菌的EP 管，在每個(gè)管中加入 90 μL 的無(wú)血清培養(yǎng)基，將待測(cè)定的病毒原液 10 μL 加入到第1個(gè)管中，混勻后，取 10 μL 加入到第2個(gè)管中，繼續(xù)相同的操作直到最后1管。選取所需的細(xì)胞孔，吸去 90 μL 培養(yǎng)基，丟棄，加入 90 μL 稀釋好的病毒溶液，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后，加入完全培養(yǎng)基 100 μL。4 d 后，觀察熒光表達(dá)情況。病毒滴度=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×計(jì)量孔稀釋倍數(shù)/接種病毒體積。

2.4細(xì)胞感染 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RKO細(xì)胞，胰酶消化后用全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種到6孔板，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)約24 h。取6孔板中的一孔細(xì)胞進(jìn)行消化，計(jì)數(shù)細(xì)胞，根據(jù)MOI和細(xì)胞數(shù)量計(jì)算所需要的病毒量稀釋到培養(yǎng)基中；吸去舊培養(yǎng)基，加入含病毒液的培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照空載體組和空白對(duì)照組，12 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，初步估計(jì)慢病毒感染效率。

2.5qRT-PCR檢測(cè)miR-21的表達(dá) 收集上調(diào)/下調(diào)miR-21、陰性對(duì)照及空白對(duì)照的RKO細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA并測(cè)定總RNA的濃度及純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo)合成cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min，4 ℃終止。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，用Realtime PCR Master Mix(SYBR Green)試劑盒(Toyobo)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，以U6為內(nèi)參照，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s， 然后95 ℃ 10 s， 60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。采用Lightcycle羅式熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。采用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.6細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上調(diào)/下調(diào)miR-21、陰性對(duì)照及空白對(duì)照的RKO細(xì)胞，胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，與實(shí)驗(yàn)孔平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔，分別接種4塊板，于培養(yǎng)后24 h、48 h、72 h和96 h分別加入MTT溶液(5 g/L)20 μL/well，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值。

2.7克隆形成實(shí)驗(yàn) 配置1.2%和0.7%無(wú)菌低熔點(diǎn)瓊脂液體，40 ℃維持，使之保持溶解狀態(tài)。按1∶1混合1.2%瓊脂糖和2×完全培養(yǎng)基，按每孔取2 mL混合液注入6孔板中，待冷卻凝固，備用。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上調(diào)/下調(diào)miR-21、陰性對(duì)照及空白對(duì)照的RKO細(xì)胞，制成1×107/L的細(xì)胞懸液；按1∶1比例將0.7%瓊脂和2×完全培養(yǎng)基在無(wú)菌試管中混合后，取1 mL混合液+0.1 mL單細(xì)胞懸液(1×103cells/well)，充分混勻、注入已鋪有底層瓊脂的培養(yǎng)板中，在室溫放置20 min使細(xì)胞瓊脂懸液凝固。將6孔板置于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d，觀察細(xì)胞克隆形成情況并計(jì)數(shù)。

2.8凋亡實(shí)驗(yàn) 胰酶消化上調(diào)/下調(diào)miR-21、陰性對(duì)照及空白對(duì)照的RKO細(xì)胞，分別收集(1～5)×105細(xì)胞。在50 μL binding buffer中加入5 μL 7-AAD染液，混勻；收集細(xì)胞中加入上述7-AAD染液，混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min；再加入450 μL binding buffer混勻后加入1 μL Annexin V-PE混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min；1 h內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2.9西妥昔單抗敏感性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上調(diào)/下調(diào)miR-21、陰性對(duì)照及空白對(duì)照的RKO細(xì)胞，胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，24 h后，加入300 mg/L的西妥昔單抗，不同細(xì)胞設(shè)3復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基及10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)，每30 min在波長(zhǎng)450 nm測(cè)定吸光度A值，直至未加藥孔的A值為1.0～1.2時(shí)為最佳時(shí)間。細(xì)胞抑制率=(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(未加藥孔A值-空白孔A值)×100%。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 13.0 軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量資料的方差分析比較轉(zhuǎn)染不同慢病毒的細(xì)胞間miR-21的表達(dá)、細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力、細(xì)胞凋亡、藥物敏感性等的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 重組慢病毒的包裝與轉(zhuǎn)染

將構(gòu)建好的慢病毒干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，包裝產(chǎn)生重組慢病毒顆粒，通過(guò)觀察綠色熒光，可見(jiàn)90%以上的細(xì)胞帶有綠色熒光,見(jiàn)圖1。收集濃縮病毒顆粒后測(cè)定LV-miR-21與LV-anti-miR-21的滴度分別為3.0×1012TU/L和2.0×1012TU/L，將病毒顆粒分別感染人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞，觀察綠色熒光，感染效率在80%以上，見(jiàn)圖2。

Figure 1. 293T cells transfected with the lentivirus interference plasmids(×100). A,B: LV-miR-21; C,D: LV-anti-miR-21.A,C:fluorescence view; B,D: phase-contrast view.

Figure 2. RKO cells transfected with different lentiviral vectors(×100). A1, A2: LV-miR-21; B1, B2: LV-miR-21 NC; C1,C2: LV-anti-miR-21; D1, D2: LV-anti-miR-21 NC.A1,B1,C1,D1: fluorescence view; A2,B2,C2,D2: phase-contrast view.

2 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞RKO轉(zhuǎn)染慢病毒干擾載體后miR-21的表達(dá)

轉(zhuǎn)染LV-miR-21、LV-anti-miR-21、相應(yīng)陰性對(duì)照載體和空白組的miR-21相對(duì)表達(dá)量分別為9.45±0.56、0.55±0.13、1.17±0.10、1.11±0.09和1.00±0.00，其中LV-miR-21組的表達(dá)量高于其陰性對(duì)照組及空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LV-anti-miR-21組的表達(dá)量低于其陰性對(duì)照組及空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而陰性對(duì)照組與空白組的表達(dá)量之間無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

3 MTT檢測(cè)人結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同慢病毒后細(xì)胞增殖能力的變化

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染LV-anti-miR-21后，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞的增殖能力明顯降低；轉(zhuǎn)染LV-miR-21后，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)。在第2天、3天和4天，LV-miR-21組、LV-anti-miR-21組和空白組之間細(xì)胞增殖能力有明顯差異(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

Figure 3. Expression of miR-21 in transfected RKO cells.Mean±SD.n=4. *P<0.05 vs LV-anti-miR-21, LV-miR-21 NC or control; #P<0.05 vs LV-miR-21 or LV-anti-miR-21 NC.

Figure 4. Proliferation of RKO cells with different treatments.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs LV-anti-miR-21.

4 轉(zhuǎn)染不同慢病毒后克隆形成能力的變化

LV-miR-21組的細(xì)胞克隆形成能力明顯高于其陰性對(duì)照組、空白組和LV-anti-miR-21組(P<0.01)；而LV-anti-miR-21組的細(xì)胞克隆形成能力低于其陰性對(duì)照組和空白組(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

5 轉(zhuǎn)染不同慢病毒后細(xì)胞凋亡的變化

LV-anti-miR-21組的早期凋亡率明顯高于LV-miR-21組(P<0.01)，見(jiàn)圖6。這說(shuō)明下調(diào)miR-21可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

Figure 5. Colony-forming ability of the RKO cells with different treatments.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs LV-miR-21.

Figure 6. The early apoptotic rate of the RKO cells with different treatments.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs LV-anti-miR-21.

6 下調(diào)miR-21可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)靶向治療藥物西妥昔單抗的敏感性

在300 mg/L西妥昔單抗作用下，LV-anti-miR-21組的細(xì)胞抑制率高于LV-miR-21組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖7。

討 論

MicroRNA是一類內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，能夠調(diào)控mRNA的表達(dá)或翻譯, 在生物體的發(fā)育、增殖、分化及凋亡等方面發(fā)揮重要的生理作用[4]。近年來(lái), 越來(lái)越多的研究表明, 許多micro-RNA可作為原癌基因或者抑癌基因, 在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的角色。目前發(fā)現(xiàn)，食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、膽管癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中miR-21的水平明顯上調(diào)。miR-21在眾多腫瘤中呈現(xiàn)出癌基因樣的作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要的作用。在結(jié)腸癌的研究中，Schetter等[5]檢測(cè)了84 例結(jié)腸癌組織及其癌旁正常組織的microRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有37個(gè)microRNA表達(dá)存在差異, 其中miR-21在癌組織中表達(dá)顯著上調(diào), 證實(shí)miR-21與結(jié)腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。也有研究發(fā)現(xiàn)miR-21在乳腺癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，其表達(dá)上調(diào)水平與乳腺癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)[6]。許多研究表明，microRNA具有調(diào)節(jié)下游靶基因表達(dá)的作用。在大多腫瘤中高表達(dá)的miR-21很可能是通過(guò)調(diào)節(jié)增殖、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。Park等[7]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的miR-21反義引物的核苷酸顯著抑制胰腺癌細(xì)胞株的增殖，抑制miR-21表達(dá)可使胰腺癌細(xì)胞株HS766T的凋亡增加3～6倍。我們的研究表明下調(diào)miR-21能夠明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)增殖及克隆形成能力等。

Figure 7. The inhibitory rate of cetuximab (300 mg/L) on the RKO cells with different treatments.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs LV-anti-miR-21.

此外，miR-21在腫瘤藥物的耐藥性方面也有重要作用[8]。目前研究認(rèn)為miR-21調(diào)控腫瘤細(xì)胞對(duì)多種藥物敏感性的機(jī)制主要與miR-21參與調(diào)控細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。最初由Meng等[9]關(guān)于microRNA與化療藥物敏感性的研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-21的表達(dá)能夠增加膽管癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。深入研究機(jī)制，還發(fā)現(xiàn)miR-21通過(guò)激活PTEN依賴的PI3K信號(hào)通路從而調(diào)節(jié)吉西他濱介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，說(shuō)明miR-21在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞化療敏感性方面有重要作用。Park等[7]也發(fā)現(xiàn)反義miR-21能夠增強(qiáng)吉西他濱的敏感性。我們通過(guò)上調(diào)/下調(diào)人結(jié)腸癌細(xì)胞RKO的miR-21表達(dá)水平，分析了miR-21對(duì)RKO細(xì)胞增殖、凋亡、克隆形成能力及對(duì)西妥昔單抗敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-21能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及克隆，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗藥物的敏感性。這些結(jié)果表明miR-21的高表達(dá)可作為結(jié)直腸癌的分子標(biāo)記物，下調(diào)miR-21的表達(dá)，在結(jié)直腸癌等腫瘤治療中有應(yīng)用前景，值得深入研究和驗(yàn)證。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Lamas MJ, Duran G, Gallardo E. Anti-EGFR therapy in first-line colorectal cancer[J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2011, 11(10):1499-1503.

[2] Adelstein BA, Dobbins TA, Harris CA, et al. A systematic review and meta-analysis of KRAS status as the determinant of response to anti-EGFR antibodies and the impact of partner chemotherapy in metastatic colorectal cancer[J]. Eur J Cancer, 2011, 47(9):1343-1354.

[3] García-Sáenz JA, Sastre J, Díaz-Rubio García E. Biomarkers and anti-EGFR therapies for KRAS wild-type metastatic colorectal cancer[J]. Clin Transl Oncol, 2009, 11(11):737-747.

[4] Fujita S, Ito T, Mizutani T, et al. miR-21 gene expression triggered by AP-1 is sustained through a double-negative feedback mechanism[J]. J Mol Biol, 2008, 378(3):492-504.

[5] Schetter AJ, Leung SY, Sohn JJ, et al. MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma[J]. JAMA, 2008, 299(4):425-436.

[6] 顏黎栩，黃馬燕，吳秋良，等. miR-21表達(dá)異常與乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系 [J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2009, 25( 4): 676- 681.

[7] Park JK, Lee EJ, Esau C, et al. Antisense inhibition of microRNA-21 or -221 arrests cell cycle, induces apoptosis, and sensitizes the effects of gemcitabine in pancreatic adenocarcinoma[J]. Pancreas, 2009, 38(7):e190-e199.

[8] Meng F, Henson R, Lang M, et al. Involvement of human micro-RNA in growth and response to chemotherapy in human cholangiocarcinoma cell lines[J]. Gastroenterology, 2006, 130(7):2113-2129.

[9] Meng F, Henson R, Wehbe-Janek H, et al. MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer[J]. Gastroenterology, 2007, 133 (2):647-658.