神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓NF-κB、NR2B和iNOS的表達(dá)及意義

葉永賢， 林 洪， 沙 漠， 李招勝， 伍 磊， 馮文龍， 陳智彪， 丁真奇△

(廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院 1骨科, 2神經(jīng)外科，福建 漳州 363000)

國際疼痛研究會將神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain, NPP)定義為：由于中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的直接損傷和功能紊亂引起的疼痛，它屬于一種慢性疼痛，主要表現(xiàn)為痛覺過敏、異常疼痛、感覺異常和自發(fā)性疼痛等臨床特征[1]。其發(fā)病率高，病因復(fù)雜，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，對神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生機(jī)制的研究已成為醫(yī)學(xué)界的前沿課題，具有重要的醫(yī)學(xué)和社會價值。既往研究表明，NPP與外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中復(fù)雜的分子機(jī)制密切相關(guān)。本研究擬通過建立慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury, CCI)模型，觀察CCI大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾的變化,測定CCI大鼠脊髓核因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)、N-甲基D-天冬氨酸受體2B亞基(N-methyl-D-aspartic acid receptor 2B, NR2B)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表達(dá),旨在探討神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動物和主要試劑

SPF級雄性SD大鼠56只(由廈門大學(xué)實驗動物中心提供)，體重180～220 g，出生8～10周。實驗前大鼠適應(yīng)環(huán)境1周，室溫22～24 ℃，保證12 h明暗交替光照，自由飲水?dāng)z食。根據(jù)體重從小到大排列按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為sham組(n=8)和CCI組(n=48)。

Trizol總RNA提取試劑(Invitrogen)、組織RNA提取試劑盒(Omega)、第1鏈cDNA合成試劑盒(TaKaRa)和PCR擴(kuò)增試劑盒(Taq)均購自上海生工生物工程股份有限公司；RIPA裂解液(強(qiáng))、凝膠配置試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Beyontime)和聚偏二氟乙烯膜(polivinylidene fluoride, PVDF)膜(Millipore)購自福州升豐生物技術(shù)有限公司；NF-κBⅠ抗、NR2BⅠ抗和iNOSⅠ抗均購自廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司。

2 主要方法

2.1CCI模型的建立 參考Bennett等[2]的方法結(jié)扎大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)。Sham組僅暴露坐骨神經(jīng)，不結(jié)扎；CCI組建立CCI模型。

2.2機(jī)械縮爪閾值(mechanical withdrawal threshold MWT;即50%縮爪閾值)測定 各組大鼠分別于術(shù)前1 d、術(shù)后1 d、4 d、7 d、14 d和21 d以von Frey纖維測定機(jī)械痛閾。采用up-and-down的方法測定大鼠50%縮爪閾值。依次使用2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g、10.0 g、15.0 g和26.0 g的力度刺激后肢。開始時用4 g的力度刺激，若無縮腿反應(yīng)，則選擇后一個力度6 g刺激后肢；若有縮足反應(yīng)，則選擇前一個力度2 g刺激后趾。依此類推，在出現(xiàn)一次與前一次不同反應(yīng)(有縮腿反應(yīng)至無縮腿反應(yīng)或者無縮腿反應(yīng)至有縮腿反應(yīng))時，繼續(xù)依序刺激4次，包括以前的2次，一共6次，即可完成50%縮爪閾值的測定。50%縮爪閾值的計算公式：50% threshold (g)= 10logXf+kδ/10 000 (Xf為最后刺激所用力度，k為不同刺激方式的系數(shù)，在表中[3-4]查找，δ是指各刺激力度 (log值) 相鄰間距的平均數(shù)，此處δ=0.186)。

2.3熱刺激縮爪潛伏期(paw withdrawal latency,PWL)測定 選用中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所研制生產(chǎn)的BME-410A型熱痛刺激儀，各組大鼠分別于術(shù)前1 d、術(shù)后1 d、4 d、7 d、14 d和21 d使用以下方法測定熱痛閾值：將大鼠置于底為3 mm厚玻璃板的有機(jī)玻璃箱中，當(dāng)大鼠安靜后，用熱輻射刺激儀(50 W, 20 V)發(fā)出5 mm光斑照射大鼠足底，電子秒表記錄從照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避時間即為PWL，注意照射時間不超過30 s，以免造成組織損傷，最長記為30 s。每只大鼠測量5次，間隔10 min，去掉最小值和最大值，計算3次PWL平均值。

2.4RT-PCR CCI組大鼠于術(shù)前1 d、術(shù)后1 d、4 d、7 d、14 d和21 d測定痛閾后斷頭處死(n=4)，處死放光血液后取L4～L6脊髓組織于勻漿器中加入液氮研磨后，加入1 mL Trizol進(jìn)行裂解，使用組織RNA提取試劑盒分離提取總mRNA。初步測定總mRNA濃度后，使用第1鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA模板，以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。BandScan軟件分析NF-κB、NR2B和iNOS mRNA的表達(dá)水平。并將NF-κB、NR2B和iNOS mRNA的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。RT-PCR引物序列如表1所示。

表1 引物序列

2.5Western blotting CCI組大鼠于術(shù)前1 d、術(shù)后1 d、4 d、7 d、14 d和21 d測定痛閾后斷頭處死(n=4)，取L4～L6脊髓組織于細(xì)胞裂解緩沖液中勻漿，分離提取總蛋白溶液。初步測定總蛋白濃度后，以40 μg蛋白在SDS-PAGE膠上電泳分離，之后轉(zhuǎn)印到PVDF上。用5%脫脂牛奶封閉2 h，在4 ℃條件下與Ⅰ抗孵育過夜(1∶1 000)，洗膜后于室溫下置入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗溶液(1∶10 000)中孵育1 h，最后用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯像。Quantity one軟件分析NF-κB、NR2B和iNOS條帶的平均灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。MWT及PWL的數(shù)據(jù)采用成組t檢驗。RT-PCR和Western blotting的數(shù)據(jù)組內(nèi)比較采用單因素方差分析及LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CCI模型的建立

Sham組大鼠CCI術(shù)后傷口未見感染，無異常滲出，肢體活動正常，無受限；CCI組大鼠術(shù)后自發(fā)性抬起左側(cè)肢體，不愿著地負(fù)重，患側(cè)出現(xiàn)跛行，有舔足、咬足和甩足現(xiàn)象，無一例發(fā)生感染和自噬傷殘肢體現(xiàn)象。

2 各組大鼠機(jī)械痛閾值變化

與sham組相比，CCI組術(shù)側(cè)從術(shù)后1 d開始出現(xiàn)MWT值下降(P<0.01)，術(shù)后7 d降至最低(P<0.01)。術(shù)后14 d時仍處于較低水平(P<0.01)，見圖1。

Figure 1. The change of mechanical withdrawal threshold in the rats with CCI of the sciatic nerve.Mean±SD.n=8.**P<0.01 vs sham.

3 各組大鼠熱痛閾值變化

與sham組相比，CCI組術(shù)側(cè)從術(shù)后1 d開始出現(xiàn)PWL值下降(P<0.01)，術(shù)后7 d降至最低(P<0.01)。術(shù)后14 d時仍處于較低水平(P<0.01)，見圖2。

4 RT-PCR檢測脊髓組織中NF-κB、NR2B和iNOS mRNA的表達(dá)

脊髓組織中NF-κB和NR2B mRNA的含量于損傷后1 d開始增加(P<0.01)；7 d達(dá)到高峰，與術(shù)前相比有顯著差異(P<0.01)。術(shù)后14 d雖有所降低，但仍維持在較高水平(P<0.01)。iNOS mRNA的表達(dá)于術(shù)后1d開始增加(P<0.01)，術(shù)后14 d達(dá)到高峰，顯著高于術(shù)前(P<0.01)，術(shù)后21 d時仍保持較高水平表達(dá)(P<0.01)，見圖3和表2。iNOS mRNA與NF-κB mRNA和NR2B mRNA的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.842,P<0.05;r=0.833,P<0.05)。

Figure 2. The change of paw withdrawal latency in the rats with CCI of the sciatic nerve.Mean±SD.n=8.**P<0.01 vs sham.

Figure 3. The mRNA expression of NF-κB, NR2B and iNOS in the spinal cord of the rats with CCI of the sciatic nerve detected by RT-PCR.

表2 CCI組大鼠術(shù)后各時點NF-κB、NR2B和iNOS mRNA的表達(dá)

5 Western blotting檢測脊髓組織中NF-κB、NR2B和iNOS蛋白的表達(dá)

脊髓NF-κB和NR2B 的蛋白含量于損傷后1 d開始增加(P<0.01)；7 d達(dá)到高峰，與術(shù)前1 d相比有顯著差異(P<0.01)，術(shù)后14 d雖有所降低，但仍維持在較高水平(P<0.01)。脊髓iNOS 蛋白表達(dá)于術(shù)后1 d開始增加(P<0.01)，術(shù)后14 d達(dá)到高峰，顯著高于術(shù)前(P<0.01)，術(shù)后21 d時仍保持較高水平表達(dá)(P<0.01)，見圖4。

Figure 4. The relative protein levels of NF-κB, NR2B and iNOS in the spinal cord of the rats with CCI of the sciatic nerve detected by Western blotting. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs -1 d.

討 論

國際疼痛研究學(xué)會的神經(jīng)病理性疼痛專家研究小組(Neuropathic Pain Special Interest Group of the International Association for the Study of Pain, Neu-PSIG)對神經(jīng)病理性疼痛的最新定義是：軀體感覺系統(tǒng)的疾病或病變直接引起的疼痛[5]。NPP在給患者帶來極大的生理和心理折磨的同時，也帶來了嚴(yán)重的社會壓力。NPP是多因素參與的緊密聯(lián)系的過程，對諸多參與機(jī)制間的相互關(guān)系進(jìn)行研究意義重大，其發(fā)生發(fā)展過程中分子機(jī)制的闡明，有助于開發(fā)針對NPP的新的治療方法。

NPP的主要行為學(xué)特征是自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和異常疼痛。其動物模型構(gòu)建的方法較多，各有優(yōu)缺點。本研究采用的是CCI神經(jīng)病理性疼痛動物模型，其致病機(jī)制是大鼠對鉻制腸線特異性的免疫反應(yīng)，引起神經(jīng)干腫脹，進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)壓迫和神經(jīng)干部分切斷，從而導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛的表現(xiàn)。實驗發(fā)現(xiàn)，手術(shù)組術(shù)側(cè)MWT和PWL顯著下降，提示CCI大鼠出現(xiàn)機(jī)械痛敏和熱痛敏。表明適度的坐骨神經(jīng)結(jié)扎選擇性損傷了有髓鞘的粗纖維，保留了大部分傳遞痛覺的C纖維，標(biāo)志CCI模型成功建立。

NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，位于胞質(zhì)中以p50/p56異二聚體的形式存在，平時與抑制性蛋白IκB結(jié)合而呈現(xiàn)非活性狀態(tài)。被多種刺激劑激活后，NF-κB與IκB解離后轉(zhuǎn)位入核與靶基因啟動子/增強(qiáng)子上的κB位點結(jié)合。參與調(diào)節(jié)多種靶基因包括炎癥因子和疼痛介質(zhì)等的表達(dá)，NF-κB與其下游的炎癥因子一同參與了神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生[6]。在神經(jīng)損傷誘導(dǎo)疼痛的大鼠脊髓組織中NF-κB活化并直接參與疼痛發(fā)展。

NMDA受體在神經(jīng)病理性疼痛的神經(jīng)元機(jī)制和膠質(zhì)-免疫機(jī)制的發(fā)生發(fā)展中承擔(dān)著調(diào)節(jié)突觸間信號傳播，加速神經(jīng)元變性和參與神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞間信息通訊等重要作用。NR2B作為NMDA受體的調(diào)節(jié)性亞基，決定著NMDA受體的一系列重要特性。研究表明，神經(jīng)病理性疼痛時，痛覺傳入神經(jīng)元末梢在脊髓中釋放大量的谷氨酸，通過激活NMDA受體，提高痛覺傳遞神經(jīng)元的興奮性；與此同時，經(jīng)NMDA受體內(nèi)流的Ca2+激活鄰近的NOS，NOS合成的一氧化氮(nitric oxide, NO)可透過細(xì)胞膜彌散至突觸前膜加速谷氨酸的釋放，促進(jìn)疼痛的產(chǎn)生。

NO作為一種多功能的信使分子最早被認(rèn)為具有血管內(nèi)皮舒張作用。在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著諸如調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)、阿片耐受和神經(jīng)傳導(dǎo)等作用[7]。受損神經(jīng)相應(yīng)脊髓節(jié)段的NOS在疼痛的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。既往研究表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，NO的合成主要是由NMDA受體的激活而觸發(fā)的。同時亦有文獻(xiàn)表明，iNOS啟動子上有NF-κB結(jié)合位點，iNOS的表達(dá)受NF-κB在轉(zhuǎn)錄上調(diào)控。

實驗發(fā)現(xiàn)，CCI組MWT和PWL于術(shù)后1 d開始下降，在7 d時達(dá)到高峰；與術(shù)前相比，NF-κB于術(shù)后1 d開始增加，7 d時達(dá)到高峰，14 d和21 d時仍維持較高表達(dá)。其變化與CCI大鼠痛覺過敏程度關(guān)系密切，證實NF-κB在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展中有重要的作用。NR2B參與體內(nèi)許多復(fù)雜的生理和病理過程，不僅包括長時程增強(qiáng)、學(xué)習(xí)記憶、細(xì)胞壞死和凋亡等[8]，而且還在痛敏的產(chǎn)生和維持方面起關(guān)鍵作用[9]。本實驗采用CCI模型，術(shù)后7 d和14 d大鼠痛閾明顯低于sham組，并且RT-PCR和Western blotting發(fā)現(xiàn)的脊髓NR2B表達(dá)增加。疼痛行為、痛閾值下降和脊髓NR2B表達(dá)增加具有統(tǒng)一性。說明外周傷害性刺激可引起脊髓NR2B表達(dá)增加，是導(dǎo)致CCI大鼠神經(jīng)病理性疼痛的重要因素之一。與sham組相比，CCI組iNOS mRNA水平于術(shù)后14 d達(dá)到高峰，在21 d時仍維持較高水平。iNOS的表達(dá)高峰較NF-κB、NR2B及疼痛高峰的延遲現(xiàn)象，提示iNOS可能不參與慢性疼痛的觸發(fā)和啟動，而與慢性疼痛的長期維持有關(guān)。通過對RT-PCR和Western blotting結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析也表明，iNOS的表達(dá)與NF-κB和NR2B的表達(dá)呈正相關(guān)。CCI大鼠痛覺過敏在術(shù)后14 d以后仍維持在較高水平，與脊髓iNOS大量表達(dá)有關(guān)，可能是激活的NF-κB上調(diào)iNOS表達(dá)，參與神經(jīng)元細(xì)胞的Ca2+過載引起神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。同時可能包括了NR2B-NOS信號通路[10]的協(xié)同作用。

綜上所述，CCI術(shù)后大鼠脊髓中NF-κB、NR2B及下游iNOS表達(dá)增加，可能與神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持有關(guān)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Attal N, Bouhassira D. Neuropathic pain: experimental advances and clinical applications [J]. Revue Neurologique, 2004, 160(2):199-203.

[2] Bennett GJ, Xie YK. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man [J]. Pain, 1988, 33(1):87-107.

[3] Dixon WJ. Efficient analysis of experimental observations [J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 1980, 20:441-462.

[4] Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW, et al. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw [J]. J Neurosci Methods, 1994, 53(1):55-63.

[5] Geber C, Baumgartner U, Schwab R, et al. Revised definition of neuropathic pain and its grading system: an open case series illustrating its use in clinic practice [J]. Am J Med, 2009, 122(10 Suppl):S3-S12.

[6] Sun T, Luo J, Jia M, et al. Small interfering RNA-mediated knockdown of NF-κBp65 attenuates neuropathic pain following peripheral nerve injury in rats[J]. Eur J Pharmacol, 2012, 682(1-3):79-85.

[7] Tulic MK, Wale JL, Holt PG, et al. Differential effects of nitric oxide synthase inhibitors in aninvivoallergic rat model[J]. Eur Respir J, 2000, 15(5):870-877.

[8] Kloda A, Martinac B, Adams DJ. Polymodal regulation of NMDA receptor channels[J]. Channels(Austin), 2007, 1(5):334-443.

[9] Leem JW, Kim HK, Hulsebosch CE, et al. Ionotropic glutamate receptors contribute to maintained neuronal hyperexcitability following spinal cord injury in rats[J]. Exp Neurol, 2010, 224(1):321-324.

[10] Wang W, Mei XP, Wei YY, et al. Neuronal NR2B-containing NMDA receptor mediates spinal astrocytic c-Jun N-terminal kinase activation in a rat model of neuropathic pain[J]. Brain Behav Immun, 2011, 25(7):1355-1366.