小鼠局灶性腦缺血再灌注模型的建立與評(píng)價(jià)

陳永暢+鄧之婧+陳誠+柯晶晶+吳艷秋+王向坤+何萍

[摘要] 目的 建立小鼠局灶性腦缺血再灌注（I/R）模型并予以評(píng)價(jià)。 方法 將昆明小鼠60只隨機(jī)分為假手術(shù)組30只，I/R模型組30只。改良線栓法制備小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞/再灌注（MCAO/R）模型。通過神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法測(cè)定腦梗死比（%）、干濕重法測(cè)定腦含水量（%）及HE染色觀察腦組織病理改變?cè)u(píng)價(jià)模型可靠性。 結(jié)果 模型存活率為83.33%，造模總成功率為76.67％。假手術(shù)組的小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為0分，腦梗死比為0，腦含水量（77.29±0.45）%。I/R模型組的小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為（2.42±0.63）分，腦梗死比為（23.03±3.42）％，腦含水量（83.18±1.65）%，均較假手術(shù)組明顯增高（P<0.01）；病理檢查出現(xiàn)典型腦梗死病理改變。 結(jié)論 改良線栓法成功建立簡便、可靠的小鼠局灶性I/R模型。

[關(guān)鍵詞] 小鼠；腦缺血再灌注；大腦中動(dòng)脈阻塞；動(dòng)物模型

[中圖分類號(hào)] R332[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1674-4721（2014）05（c）-0004-04

Establishment and evaluation of focal cerebral ischemia-reperfusion model in mice

CHEN Yong-chang DENG Zhi-jing CHEN Cheng KE Jing-jing WU Yan-qiu WANG Xiang-kun HE Ping▲

Pharmaceutical College,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China

[Abstract] Objective To establish and evaluate the focal cerebral ischemia-reperfusion (I/R) model in mice. Methods Sixty Kunming mice were randomly divided into the sham group (n=30) and the I/R model group (n=30).The middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model was established by the improved intraluminal filament technique in mice.The reliability of the model was evaluated by the neurologic behavior score,cerebral infarction rate determined by triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining method,brain water content determined by dry-wet method,and brain histopathological change observed. Results The survival rate and total success rate of the model was 83.33% and 76.67％respectively.In the sham group,the neurologic behavior score was 0 point,the cerebral infarction rate was 0,and the brain water content was(77.29±0.45)%.In the I/R group,the neurologic behavior score was(2.42±0.53)points,the cerebral infarction rate was (23.03±3.42)％,and the brain water content was(83.18±2.35)%,and compared with the sham group,the above-mentioned indicators in the I/R model group were all markedly increased (P<0.01).At the same time,the typical pathological change of cerebral infarctionwas also observed in the I/R group. Conclusion The simple and reliable focal cerebral I/R model has been successfully established by improved intraluminal filament technique in mice.

[Key words] Mice;Cerebral ischemia-reperfusion;Middle cerebral artery occlusion;Animal model

缺血性腦血管病約占全部腦血管病的80%，具有高發(fā)病率、高患病率、高死亡率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，已成為嚴(yán)重危害人類健康的三大疾病之一[1]。大腦中動(dòng)脈是腦梗死的多發(fā)部位，占腦梗死的60%以上；大腦中動(dòng)脈阻塞/再灌注（MCAO/R）模型是目前使用最為廣泛的、研究局灶性腦缺血再灌注損傷的理想模型，以往多采用大鼠作為研究對(duì)象[2-3]。近年來，鑒于小鼠體重差異小，模型成功率較高，其腦缺血更接近于人類腦供血不足或腦梗死再灌時(shí)腦組織病理生理演變過程等優(yōu)點(diǎn)，故小鼠腦缺血模型成為研究腦梗死后神經(jīng)細(xì)胞死亡、神經(jīng)功能修復(fù)及藥物保護(hù)作用的重要?jiǎng)游锬Ｐ蚚4-5]，因此，建立簡便、可靠、穩(wěn)定的小鼠腦缺血再灌注模型是研究腦缺血再灌注損傷的重要手段。本研究探討建立小鼠MCAO/R致局灶性腦缺血再灌注模型的方法，并對(duì)造模方法進(jìn)行優(yōu)化、改進(jìn)及評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品、試劑與材料

2，3，5-氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）（美國Amresco，批號(hào)2603c312）；0.6號(hào)尼龍漁線（日本YunHai公司，直徑0.12 mm，批號(hào)20120312）；704硅橡膠（溧陽市宏大膠業(yè)有限公司，批號(hào)20130526）；戊巴比妥鈉（美國Sigma，批號(hào)051135）。

1.2 主要儀器設(shè)備

XTZ-D解剖顯微鏡（上海光學(xué)五廠）；DMR+Q550病理圖像分析儀（德國Leica）。

1.3 動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物成年SPF級(jí)雄性昆明種小鼠60只，體質(zhì)量為25~30g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK桂2003-003；隨機(jī)分為假手術(shù)組30只，I/R模型組30只。

1.3.2 線栓制備尼龍漁線用鋒利剃須刀片切割為4 cm/段，頭端0.5 cm均勻包裹704硅橡膠，室溫固化24 h后，鏡下篩選頭端光滑圓鈍、直徑為0.20~0.23 mm的線栓備用。實(shí)驗(yàn)前用記號(hào)筆在線栓距離頭端4 mm及8~9 mm處涂色標(biāo)記，浸泡于生理鹽水中備用。

1.3.3 模型制備參考唐穎馨等[6-7]的方法采用改良線栓法制作小鼠MCAO/R模型并做適當(dāng)改進(jìn)，將線栓自頸總動(dòng)脈經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈插入MCAO起始部，但手術(shù)過程中僅分離結(jié)扎頸總動(dòng)脈，不分離結(jié)扎頸外動(dòng)脈或翼腭動(dòng)脈，也無需分離頸內(nèi)動(dòng)脈。腹腔注射1%戊巴比妥鈉0.2 ml/只麻醉小鼠后，仰臥固定，解剖顯微鏡下行頸部正中切口。鏡下用顯微鑷分離左側(cè)頸總動(dòng)脈約4 mm至頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈分叉處并穿雙線備用，期間注意避免牽拉損傷迷走神經(jīng)。結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端并用微動(dòng)脈夾在頸總動(dòng)脈分叉下方夾閉頸總動(dòng)脈血流后，在距離頸總動(dòng)脈分叉下方約3 mm處用顯微剪剪開一小口，插入線栓并用預(yù)留絲線固定在頸總動(dòng)脈上，固定松緊度以能推進(jìn)線栓為宜。此時(shí)松開微動(dòng)脈夾，將線栓緩慢沿頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，操作過程中注意栓線走行方向勿入頸外動(dòng)脈或翼腭動(dòng)脈。線栓插入深度距頸總動(dòng)脈分叉約4 mm時(shí)，提示線栓接近頸內(nèi)動(dòng)脈入顱點(diǎn)；插入深度距頸總動(dòng)脈分叉8~9 mm時(shí)，此時(shí)有輕微阻力感，提示線栓頭端到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始部。扎緊絲線以固定線栓，縫合切口，注意術(shù)后保溫，待動(dòng)物蘇醒后單獨(dú)置于飼養(yǎng)籠中。缺血3 h后，小心拔出栓線并結(jié)扎頸總動(dòng)脈殘端，再灌注24 h。假手術(shù)組只分離和結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，不插入線栓，其余操作步驟同I/R模型組。

1.3.4 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分所有實(shí)驗(yàn)小鼠在再灌注24 h后采用Bederson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：提尾時(shí)，右前肢屈曲；2分：右側(cè)推阻力下降，伴前肢屈曲，無轉(zhuǎn)圈行為；3分：同2分行為，同時(shí)伴自發(fā)性向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；4分：沒有自發(fā)活動(dòng)。以神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分≥1分為模型成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.5 TTC染色測(cè)定腦梗死比[9]神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后，隨機(jī)選擇10只假手術(shù)組及神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分≥1分的10只I/R模型小鼠，斷頭取腦，置-20℃冰箱中冷凍20 min。去除嗅腦、小腦及腦干，沿腦前級(jí)和視交叉中點(diǎn)、視交叉、漏斗部作冠狀切片，共4片。用0.5%TTC 溶液37℃孵育腦片10 min后，濾紙吸取表面液體后，分離各腦片白色區(qū)（梗死區(qū)）和紅色區(qū)（正常區(qū)）后分別稱重，按下式計(jì)算腦梗死比：腦梗死比（%）=（梗死區(qū)重量-腦片總重量）/腦片總重量×100%。

1.3.6 干濕重法測(cè)定腦含水量[10]神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后，隨機(jī)選擇10只假手術(shù)組及神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分≥1分的10只I/R模型小鼠，斷頭取腦，去除嗅腦、小腦及腦干，沿中線分為左右半球后稱濕重，并置100℃烘箱內(nèi)24 h烘干后稱干重。腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.3.7 腦組織病理學(xué)觀察神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后，隨機(jī)選擇3只假手術(shù)組及神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分≥1分的3只I/R模型小鼠，全身4%多聚甲醛灌流后斷頭取腦， 4 μm連續(xù)冠狀切片，常規(guī)HE染色后，光鏡下觀察腦組織病理改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用x±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模成功率和兩組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的比較

假手術(shù)組小鼠術(shù)后無神經(jīng)功能缺損癥狀，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為0分。再灌注24 h后，I/R模型組小鼠存活25只，存活率為83.33%（25/30）；其中無神經(jīng)功能缺損癥狀者2只，經(jīng)TTC染色證實(shí)無梗死灶；神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分≥1分者23只，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為（2.42±0.63）分，兩組的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。造?？偝晒β蕿?6.67％（23/30）。

2.2 兩組TTC染色及腦梗死比的比較

假手術(shù)組腦片TTC染色呈全腦均勻紅染，未見白色梗死灶，腦梗死比為0；I/R模型組腦片出現(xiàn)左側(cè)皮層及皮層下白色梗死區(qū)，主要集中在第2、3腦片，腦梗死比為（23.03±3.42）％，兩組的腦梗死比比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。小鼠腦TTC染色見圖1。

圖1 小鼠腦TTC染色結(jié)果

A.假手術(shù)組；B.I/R模型組

2.3 兩組腦含水量的比較

假手術(shù)組左右腦對(duì)稱，腦含水量為（77.29±0.45）%；I/R模型組可見左側(cè)大腦體積增大，腦含水量為（83.18±1.65）％，兩組的腦含水量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.4 兩組腦組織病理改變的比較

假手術(shù)組皮層和紋狀體神經(jīng)元數(shù)量、形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)纖維密集，排列整齊。I/R模型組缺血側(cè)腦組織可見大量篩狀壞死灶，壞死灶內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)核固縮、濃染；神經(jīng)纖維稀疏，排列紊亂，間隙擴(kuò)大；間質(zhì)水腫明顯。小鼠腦組織病理學(xué)變化見圖2。

圖2 小鼠腦組織病理學(xué)變化圖（HE染色，400×）

A.假手術(shù)組；B.I/R模型組

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

動(dòng)物品系的選擇對(duì)MCAO模型的成功率／術(shù)后梗死體積的大小及區(qū)域有一定的影響[11]。杜芳等[12]研究認(rèn)為，線栓法制作昆明小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注模型創(chuàng)傷小，缺血的部位較恒定，可以準(zhǔn)確控制缺血和再灌注時(shí)間，可以成為研究腦血管疾病的病理生理改變、預(yù)后及治療作用的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型；與BALB/c小鼠（另一種常用于制備MCAO/R模型的小鼠），昆明小鼠制作MCAO/R模型的存活率、模型成功率明顯高于BALB/c小鼠，而梗死體積僅略低于BALB/c小鼠，因此，本研究采用昆明小鼠建立MCAO/R模型，并對(duì)造模方法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)。

3.2 線栓的制備及進(jìn)栓深度

線栓是MCAO模型制備成功的關(guān)鍵因素之一[13]。704硅橡膠是一種黏接性好、高強(qiáng)度、無腐蝕的單組分室溫硫化硅橡膠，具有安全無毒、可塑性好、常溫固化、使用方便等特點(diǎn)。與常用的石蠟包裹線栓相比，704硅橡膠包裹的線栓形狀均勻一致，頭端包裹圓潤，栓體光滑及固化后不易損傷變形或脫落等，從而提高模型成功率和穩(wěn)定性。

進(jìn)栓深度是MCAO模型制作成功的另一重要因素。關(guān)于小鼠MCAO模型進(jìn)線深度的報(bào)道不多，多推薦進(jìn)線深度超過頸總動(dòng)脈分叉處8～9 mm[7，14]。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于昆明小鼠，插入深度以超過頸總動(dòng)脈分叉處8 mm 為宜，進(jìn)線過深則會(huì)導(dǎo)致梗死面積過大，動(dòng)物死亡率增高。

線栓除了在距離頭端8~9 mm處涂色標(biāo)記外，還增加了距離頭端4 mm處進(jìn)行標(biāo)記。4 mm標(biāo)記點(diǎn)有助于判斷線栓是否入顱，8~9 mm標(biāo)記點(diǎn)則有助于判斷線栓頭端是否到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始部，由此提高線栓插入成功率。

3.3 進(jìn)栓方式的選擇

線栓法制備MCAO模型不需要開顱，侵入性小，操作方便并且可以產(chǎn)生相對(duì)穩(wěn)定的腦缺血病灶，術(shù)后動(dòng)物生存狀態(tài)穩(wěn)定，但longa傳統(tǒng)線栓法[2，14]從頸外動(dòng)脈斷端插入線栓至大腦中動(dòng)脈，需要分離結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端及其所有分支，造模時(shí)間長，動(dòng)物出血多，死亡率高。目前在制備大鼠MCAO模型中常用改良線栓法，術(shù)中將線栓自頸總動(dòng)脈經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈插入大腦中動(dòng)脈起始部，使大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域產(chǎn)生局灶性腦缺血；拔除線栓后，依靠Wills環(huán)由對(duì)側(cè)頸總動(dòng)脈供血而實(shí)現(xiàn)再灌[15]。昆明種小鼠的Willis環(huán)解剖結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，變異較少，后交通動(dòng)脈多發(fā)育良好，90%有完整的Willis環(huán)[16]，因此采用改良線栓法制備MCAO模型后拔除線栓，仍可通過Willis環(huán)達(dá)到再灌的目的。

改良線栓法[6，7，15]操作中，常分離結(jié)扎頸外動(dòng)脈和（或）翼腭動(dòng)脈以防止線栓誤入頸外動(dòng)脈或翼腭動(dòng)脈；微動(dòng)脈夾閉位置選擇在頸內(nèi)動(dòng)脈，因此需分離頸內(nèi)動(dòng)脈起始段，由此造成手術(shù)時(shí)間延長、手術(shù)難度加大，甚至導(dǎo)致術(shù)中出血、動(dòng)物死亡。本研究嘗試僅分離結(jié)扎頸總動(dòng)脈，不分離結(jié)扎頸外動(dòng)脈或翼腭動(dòng)脈，而是通過調(diào)整插入線栓插入方向?qū)⒕€栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈；同時(shí)將頸總動(dòng)脈開口選擇在頸總動(dòng)脈分叉下方約3 mm處，因而微動(dòng)脈夾夾閉位置可以選擇在頸總動(dòng)脈分叉下方而非頸內(nèi)動(dòng)脈，因而也無需分離頸內(nèi)動(dòng)脈。手術(shù)方式更簡單，手術(shù)時(shí)間通?？煽刂圃?0 min內(nèi)完成，同時(shí)也降低了術(shù)中出血的可能，亦避免了對(duì)頸總動(dòng)脈分叉周圍區(qū)域血管、頸上神經(jīng)節(jié)及頸交感干、迷走神經(jīng)及其分支的損害，提高動(dòng)物術(shù)后恢復(fù)能力，降低死亡率。

3.4 模型的評(píng)價(jià)

經(jīng)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、TTC染色腦梗死比測(cè)定、腦含水量及腦組織病理改變檢測(cè)，I/R模型組小鼠造模后出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯高于假手術(shù)組；腦組織TTC染色呈皮質(zhì)及皮層下白色梗死灶，腦梗死比和腦含水量亦明顯高于假手術(shù)組，腦組織病理符合腦缺血再灌注損傷病理改變，提示造模成功。

綜上所述，本研究成功采用改良線栓MCAO/R法制備小鼠局灶性腦缺血再灌模型，該改良方法制作簡單易行，成功率較高，結(jié)果穩(wěn)定、可靠，可用于腦缺血再灌注的研究。

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（收稿日期：2014-03-26本文編輯：許俊琴）

[基金項(xiàng)目] 國家自然科學(xué)基金（81360056）；廣西自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2013GXNSFAA019147）；廣西自然科學(xué)基金回國基金項(xiàng)目（2012GXNSFCA053005）；廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（YCSZ2012032）；廣西醫(yī)科大學(xué)“未來學(xué)術(shù)之星”大學(xué)生課外科研課題項(xiàng)目

[作者簡介] 陳永暢（1985-），女，籍貫：廣西桂林，廣西醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)碩士研究生，主要從事神經(jīng)藥理學(xué)研究

▲通訊作者：何萍（1975-），女，籍貫：湖南岳陽，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)藥理學(xué)研究

改良線栓法[6，7，15]操作中，常分離結(jié)扎頸外動(dòng)脈和（或）翼腭動(dòng)脈以防止線栓誤入頸外動(dòng)脈或翼腭動(dòng)脈；微動(dòng)脈夾閉位置選擇在頸內(nèi)動(dòng)脈，因此需分離頸內(nèi)動(dòng)脈起始段，由此造成手術(shù)時(shí)間延長、手術(shù)難度加大，甚至導(dǎo)致術(shù)中出血、動(dòng)物死亡。本研究嘗試僅分離結(jié)扎頸總動(dòng)脈，不分離結(jié)扎頸外動(dòng)脈或翼腭動(dòng)脈，而是通過調(diào)整插入線栓插入方向?qū)⒕€栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈；同時(shí)將頸總動(dòng)脈開口選擇在頸總動(dòng)脈分叉下方約3 mm處，因而微動(dòng)脈夾夾閉位置可以選擇在頸總動(dòng)脈分叉下方而非頸內(nèi)動(dòng)脈，因而也無需分離頸內(nèi)動(dòng)脈。手術(shù)方式更簡單，手術(shù)時(shí)間通?？煽刂圃?0 min內(nèi)完成，同時(shí)也降低了術(shù)中出血的可能，亦避免了對(duì)頸總動(dòng)脈分叉周圍區(qū)域血管、頸上神經(jīng)節(jié)及頸交感干、迷走神經(jīng)及其分支的損害，提高動(dòng)物術(shù)后恢復(fù)能力，降低死亡率。

3.4 模型的評(píng)價(jià)

經(jīng)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、TTC染色腦梗死比測(cè)定、腦含水量及腦組織病理改變檢測(cè)，I/R模型組小鼠造模后出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯高于假手術(shù)組；腦組織TTC染色呈皮質(zhì)及皮層下白色梗死灶，腦梗死比和腦含水量亦明顯高于假手術(shù)組，腦組織病理符合腦缺血再灌注損傷病理改變，提示造模成功。

綜上所述，本研究成功采用改良線栓MCAO/R法制備小鼠局灶性腦缺血再灌模型，該改良方法制作簡單易行，成功率較高，結(jié)果穩(wěn)定、可靠，可用于腦缺血再灌注的研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]黃玉蘭，楊肖敏，石廣霞.各種腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ脱芯楷F(xiàn)狀[J].中國中醫(yī)急癥，2011，20（12）：1985-1987.

[2]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：84-91.

[3]趙丹，武麗斐，劉振權(quán).大鼠腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ脱芯楷F(xiàn)狀與展望[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2012，10（5）：598-600.

[4]馬叢，王蕾.小鼠腦缺血再灌注模型方法及中藥的藥理作用[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（2）：280-282

[5]鄒永杰.腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷难芯窟M(jìn)展[J].國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2012，39（5）：423-426.

[6]唐穎馨，劉敏珍，丁鳳菲，等.小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型的改良及評(píng)價(jià)[J].神經(jīng)損傷與功能重建，2012，7（2）：79-83.

[7]王梧霖，史小軍，侯天德，等.小鼠腦缺血再灌注模型的構(gòu)建及條件優(yōu)化[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10（1）：70-73.

[8]Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke，1986，17（3）：472-476.

[9]魏偉.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：1004-1005.

[10]趙剛，王偉民，楊帥，等.白藜蘆醇對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2014， 13（1）：26-29.

[11]劉慧勤，劉建仁，丁美萍.小鼠不同腦缺血模型及品系差異[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)·醫(yī)學(xué)版，2009，38（5）：541-546.

[12]杜芳，王濤，楊學(xué)偉，等.小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注模型的建立和評(píng)價(jià)[J].中國臨床康復(fù)，2006，10（46）：201-204.

[13]甄毅嵐，王亞男，李晟，等.線栓法制備不同體重KM小鼠局灶性腦缺血/再灌注模型的建立及評(píng)價(jià)[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2013，21（2）：39-44.

[14]趙瑾，苑琳，王馭龍，等.線栓法復(fù)制昆明小鼠局灶性腦缺血再灌注模型的穩(wěn)定性研究[J].中國病理生理雜志，2011，27（7）：1450-1452，1456.

[15]梁盼，陳偉建，楊運(yùn)俊，等.改良線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型[J].浙江醫(yī)學(xué)，2011，33（10）：1483-1485.

[16]高大寬，章翔，蔣曉帆，等.小鼠腦Willis環(huán)的解剖及其對(duì)局灶性腦缺血模型的影響[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2006， 35（1）：3-5，17.

（收稿日期：2014-03-26本文編輯：許俊琴）

[基金項(xiàng)目] 國家自然科學(xué)基金（81360056）；廣西自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2013GXNSFAA019147）；廣西自然科學(xué)基金回國基金項(xiàng)目（2012GXNSFCA053005）；廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（YCSZ2012032）；廣西醫(yī)科大學(xué)“未來學(xué)術(shù)之星”大學(xué)生課外科研課題項(xiàng)目

[作者簡介] 陳永暢（1985-），女，籍貫：廣西桂林，廣西醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)碩士研究生，主要從事神經(jīng)藥理學(xué)研究

▲通訊作者：何萍（1975-），女，籍貫：湖南岳陽，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)藥理學(xué)研究

改良線栓法[6，7，15]操作中，常分離結(jié)扎頸外動(dòng)脈和（或）翼腭動(dòng)脈以防止線栓誤入頸外動(dòng)脈或翼腭動(dòng)脈；微動(dòng)脈夾閉位置選擇在頸內(nèi)動(dòng)脈，因此需分離頸內(nèi)動(dòng)脈起始段，由此造成手術(shù)時(shí)間延長、手術(shù)難度加大，甚至導(dǎo)致術(shù)中出血、動(dòng)物死亡。本研究嘗試僅分離結(jié)扎頸總動(dòng)脈，不分離結(jié)扎頸外動(dòng)脈或翼腭動(dòng)脈，而是通過調(diào)整插入線栓插入方向?qū)⒕€栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈；同時(shí)將頸總動(dòng)脈開口選擇在頸總動(dòng)脈分叉下方約3 mm處，因而微動(dòng)脈夾夾閉位置可以選擇在頸總動(dòng)脈分叉下方而非頸內(nèi)動(dòng)脈，因而也無需分離頸內(nèi)動(dòng)脈。手術(shù)方式更簡單，手術(shù)時(shí)間通?？煽刂圃?0 min內(nèi)完成，同時(shí)也降低了術(shù)中出血的可能，亦避免了對(duì)頸總動(dòng)脈分叉周圍區(qū)域血管、頸上神經(jīng)節(jié)及頸交感干、迷走神經(jīng)及其分支的損害，提高動(dòng)物術(shù)后恢復(fù)能力，降低死亡率。

3.4 模型的評(píng)價(jià)

經(jīng)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、TTC染色腦梗死比測(cè)定、腦含水量及腦組織病理改變檢測(cè)，I/R模型組小鼠造模后出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯高于假手術(shù)組；腦組織TTC染色呈皮質(zhì)及皮層下白色梗死灶，腦梗死比和腦含水量亦明顯高于假手術(shù)組，腦組織病理符合腦缺血再灌注損傷病理改變，提示造模成功。

綜上所述，本研究成功采用改良線栓MCAO/R法制備小鼠局灶性腦缺血再灌模型，該改良方法制作簡單易行，成功率較高，結(jié)果穩(wěn)定、可靠，可用于腦缺血再灌注的研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]黃玉蘭，楊肖敏，石廣霞.各種腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ脱芯楷F(xiàn)狀[J].中國中醫(yī)急癥，2011，20（12）：1985-1987.

[2]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：84-91.

[3]趙丹，武麗斐，劉振權(quán).大鼠腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ脱芯楷F(xiàn)狀與展望[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2012，10（5）：598-600.

[4]馬叢，王蕾.小鼠腦缺血再灌注模型方法及中藥的藥理作用[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（2）：280-282

[5]鄒永杰.腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷难芯窟M(jìn)展[J].國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2012，39（5）：423-426.

[6]唐穎馨，劉敏珍，丁鳳菲，等.小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型的改良及評(píng)價(jià)[J].神經(jīng)損傷與功能重建，2012，7（2）：79-83.

[7]王梧霖，史小軍，侯天德，等.小鼠腦缺血再灌注模型的構(gòu)建及條件優(yōu)化[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10（1）：70-73.

[8]Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke，1986，17（3）：472-476.

[9]魏偉.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：1004-1005.

[10]趙剛，王偉民，楊帥，等.白藜蘆醇對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2014， 13（1）：26-29.

[11]劉慧勤，劉建仁，丁美萍.小鼠不同腦缺血模型及品系差異[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)·醫(yī)學(xué)版，2009，38（5）：541-546.

[12]杜芳，王濤，楊學(xué)偉，等.小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注模型的建立和評(píng)價(jià)[J].中國臨床康復(fù)，2006，10（46）：201-204.

[13]甄毅嵐，王亞男，李晟，等.線栓法制備不同體重KM小鼠局灶性腦缺血/再灌注模型的建立及評(píng)價(jià)[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2013，21（2）：39-44.

[14]趙瑾，苑琳，王馭龍，等.線栓法復(fù)制昆明小鼠局灶性腦缺血再灌注模型的穩(wěn)定性研究[J].中國病理生理雜志，2011，27（7）：1450-1452，1456.

[15]梁盼，陳偉建，楊運(yùn)俊，等.改良線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型[J].浙江醫(yī)學(xué)，2011，33（10）：1483-1485.

[16]高大寬，章翔，蔣曉帆，等.小鼠腦Willis環(huán)的解剖及其對(duì)局灶性腦缺血模型的影響[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2006， 35（1）：3-5，17.

（收稿日期：2014-03-26本文編輯：許俊琴）

[基金項(xiàng)目] 國家自然科學(xué)基金（81360056）；廣西自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2013GXNSFAA019147）；廣西自然科學(xué)基金回國基金項(xiàng)目（2012GXNSFCA053005）；廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（YCSZ2012032）；廣西醫(yī)科大學(xué)“未來學(xué)術(shù)之星”大學(xué)生課外科研課題項(xiàng)目

[作者簡介] 陳永暢（1985-），女，籍貫：廣西桂林，廣西醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)碩士研究生，主要從事神經(jīng)藥理學(xué)研究

▲通訊作者：何萍（1975-），女，籍貫：湖南岳陽，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)藥理學(xué)研究