蘋果莖痘病毒的生物學(xué)鑒定

李麗麗

摘要：基于前期研究中獲得的１４個蘋果莖痘病毒（ＡＳＰＶ）分離物，將其分別接種于不同草本、木本指示植物，分析其在不同寄主上的癥狀變化特點(diǎn)。結(jié)果顯示，ＡＳＰＶ各分離物只局部侵染草本指示植物西方煙（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ），而均未引起系統(tǒng)侵染；不同分離物接種的西方煙各植株癥狀沒有明顯差別。在木本指示植物中，所有分離物皆侵染雜種榅桲（Ｐｙｒｏｎｉａ ｖｅｉｔｃｈｉｉ）和Ｓｐｙ２２７，部分分離物不侵染光輝（R65-76 Radiant），僅少數(shù)病毒分離物在梨品種考密斯（Ｄｏｙｅｎｎｅ ｄｕ Ｃｏｍｉｃｅ）上顯示癥狀?？傮w來看，雜種榅桲最適合做ＡＳＰＶ的指示植物，其次為Ｓｐｙ２２７，最后是光輝。不同分離物在不同指示植物上的癥狀較復(fù)雜，并未呈現(xiàn)明顯規(guī)律性，因而單純以生物學(xué)癥狀特點(diǎn)難以進(jìn)行系統(tǒng)的ＡＳＰＶ株系分化分析。

關(guān)鍵詞：蘋果莖痘病毒（ＡＳＰＶ）；檢測；指示植物

中圖分類號：Ｓ６６１．１；Ｓ４３６．６１１．１ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０14）09－2055-03

Biological Identification of ASPV

ＬI Ｌｉ-ｌｉ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Harbin 150081,China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：14 Chinese isolates of ASPV obtained from previous study were inoculated in various woody and herbaceous indicators. The system variation and characteristic of different hosts were analyzed. The results showed that ASPV isolates only partially infected Nicotiana occidentalis and the systems were the same on the whole. In woody indicators, Pyronia veitchii and Spy227 could be infected by all isolates, but R65-76 Radiant could be infected by partial isolates. The systems of few isolates could be found in Doyenne du Comice. On the whole, Pyronia veitchii was the best indicator plant for ASPV, and Spy227 was the second best indicator plant for ASPV. R65-76 Radiant was worse than Pyronia veitchii and Spy227. The systems of various ASPV isolates were complicated in different indicator plants. No obvious rule could be found, therefore, the strain differentiation could not be systematically analyzed only by the biological characteristic.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Apple stem pitting virus(ASPV); detection; indicator plants

蘋果莖痘病毒（ＡＳＰＶ）是一種嚴(yán)重危害果樹生產(chǎn)的潛隱性病毒。ＡＳＰＶ主要侵染蘋果和梨，ＡＳＰＶ常與蘋果退綠葉斑病毒（ＡＣＬＳＶ）、蘋果莖溝病毒（ＡＳＧＶ）等混合侵染，導(dǎo)致蘋果和梨產(chǎn)量降低，品質(zhì)變劣［１］。

ＡＳＰＶ在中國危害較嚴(yán)重，植株帶毒率普遍較高。劉福昌等［２］報道我國的渤海灣、黃河故道和西北高原蘋果主產(chǎn)區(qū)主栽蘋果品種和營養(yǎng)系矮生砧木普遍受ＡＳＰＶ、ＡＳＧＶ、ＡＣＬＳＶ侵染，其中ＡＳＰＶ帶毒率普遍高于５０％，金冠、元帥的帶毒率則高于８０％。王國平等［３］研究結(jié)果表明我國北方梨產(chǎn)區(qū)主栽品種上ＡＳＰＶ的平均帶毒率為６１．８％。

生物學(xué)方法長期以來一直是進(jìn)行病毒鑒定及株系劃分最基礎(chǔ)的方法之一，主要通過病毒汁液摩擦接種、二重芽接法等方式接種于寄主植物上，根據(jù)寄主癥狀表現(xiàn)及寄主范圍來對病毒或病毒株系進(jìn)行鑒定［４］。該方法的結(jié)果較直觀，適合基層農(nóng)技人員使用，此外，也利于發(fā)現(xiàn)新的病毒株系。基于前期研究中獲得的１８個ＡＳＰＶ分離物，本研究將其分別接種于不同草本、木本寄主植物，分析其在不同寄主上的癥狀變化特點(diǎn)，并進(jìn)一步探索基于生物學(xué)方法對ＡＳＰＶ進(jìn)行株系分化研究。

１材料和方法

１．１植物材料

采集蘋果樣本，利用ＲＴ－ＰＣＲ技術(shù)和ＥＬＩＳＡ技術(shù)檢測ＡＣＬＳＶ、ＡＳＧＶ和ＡＳＰＶ的侵染情況［５］，確定僅受ＡＳＰＶ侵染的樣本進(jìn)行后續(xù)研究，共獲得了１４個ＡＳＰＶ分離物，分別命名為ｐｖ２、ｐｖ４、ｐｖ５、ｐｖ６、ｐｖ７、ｐｖ９、ｐｖ１０、ｐｖ１１、ｐｖ１３、ｊｆ１、ｊｆ２、ｊｆ３、ｊｆ４、ｊｆ５。

草本指示植物為西方煙（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ） ３７Ｂ；木本指示植物包括Ｓｐｙ２２７、光輝（Ｒ６５－７６ Ｒａｄｉａｎｔ）和雜種榅桲（Ｐｙｒｏｎｉａ ｖｅｉｔｃｈｉｉ），梨品種考密斯（Ｄｏｙｅｎｎｅ ｄｕ Ｃｏｍｉｃｅ）。

１．２病毒汁液摩擦接種

溫室播種西方煙，待西方煙長到３～４葉時進(jìn)行接種。研缽放于１８０ ℃烘箱滅菌，然后將研缽和接種緩沖液置冰上預(yù)冷；向西方煙葉片撒上金剛砂（１ ０００目），取出待檢樣品葉片，加入２～５倍（Ｗ／Ｖ）接種緩沖液和少許金剛砂，低溫條件下迅速研磨，用研磨棒蘸取汁液，輕輕涂抹葉面，蒸餾水沖洗接種葉面，每個樣品分別用兩種緩沖液重復(fù)４次，放置溫室觀察。

１．３二重芽接法

播種砧木山定子和杜梨，第二年定植實(shí)生苗，之后進(jìn)行二重芽接，接種受ＡＳＰＶ感染接穗（ＲＴ－ＰＣＲ檢測顯示未受ＡＳＧＶ和ＡＣＬＳＶ感染）［５］。當(dāng)指示植物如蘋果時用山定子作砧木，為梨時則用杜梨作砧木。先將供試毒源樣品的芽片嫁接在實(shí)生砧的基部，然后再把指示植物的芽片嫁接在毒源芽片接口上方約２ ｃｍ處。每樣品／指示植物組合重復(fù)４次。第二年苗木發(fā)芽前，在指示植物接芽的上方約１０ ｃｍ處剪除砧干。苗木發(fā)芽后摘除毒源芽的生長點(diǎn)，以促進(jìn)指示植物嫁接芽的生長。定期觀察指示植物的癥狀反應(yīng)。

２結(jié)果與分析

２．１不同ＡＳＰＶ分離物摩擦接種草本指示植物后的癥狀分析

將不同ＡＳＰＶ分離物摩擦接種草本指示植物西方煙３７Ｂ約７ ｄ后，接種葉片上出現(xiàn)白色壞死斑點(diǎn)、退綠斑、葉片皺縮畸形或小凸起等明顯癥狀，而健康葉片未見明顯癥狀（圖１）。不同分離物接種的西方煙３７Ｂ各植株癥狀沒有明顯差別。同時在后期的觀察中，系統(tǒng)葉片沒有表現(xiàn)任何病癥，由此可以判斷ＡＳＰＶ各分離物只局部侵染西方煙３７Ｂ，而均未引起系統(tǒng)侵染。接種ＡＳＰＶ不同分離物的西方煙３７Ｂ各植株葉片均表現(xiàn)出了畸形、皺縮和壞死斑的相同癥狀，僅有ｊｆ３、ｐｖ１０、ｐｖ１１和ｐｖ１３四個分離物侵染的植株葉片額外有小凸起的癥狀。

２．２不同ＡＳＰＶ分離物二重芽接法木本指示植物后的癥狀分析

木本指示植物觀察結(jié)果顯示，雜種榅桲在初期表現(xiàn)不同程度的葉片反卷癥狀，有的分離物還有葉片黃斑、舟形葉癥狀，如分離物ｐｖ１３、ｊｆ５；至６月上旬植株矮化，８月初主干皮層表現(xiàn)壞死斑，后期剝開樹皮，有的可見木質(zhì)部的莖痘斑；光輝經(jīng)ＡＳＰＶ侵染后主要表現(xiàn)葉片反卷、植株矮化，部分植株還會出現(xiàn)葉片皺縮、木質(zhì)部莖痘斑的現(xiàn)象；５月下旬至６月上旬Ｓｐｙ２２７出現(xiàn)葉片反卷的癥狀，６月中旬以后主干皮層表面產(chǎn)生不規(guī)則的紅褐斑，有些植株頂端枯死，生長衰退或矮化，木質(zhì)部表面有凹陷斑（圖２）。

從寄主范圍來看，嫁接木本指示植物梨品種考密斯后，只有病毒分離物ｊｆ４和ｐｖ１０在梨品種考密斯上顯現(xiàn)出沿葉脈退綠癥狀，接種的其他不同分離物并未呈現(xiàn)明顯癥狀。ＡＳＰＶ分離物ｐｖ９、ｐｖ１３和ｊｆ１只侵染Ｓｐｙ２２７、雜種榅桲２種指示植物，不侵染光輝。其他的９個分離物的寄主范圍相同，為雜種榅桲、Ｓｐｙ２２７和光輝。

不同分離物在不同指示植物上的癥狀較復(fù)雜，并未呈現(xiàn)明顯規(guī)律性，因而單純以生物學(xué)癥狀特點(diǎn)難以進(jìn)行系統(tǒng)的ＡＳＰＶ株系分化分析。３種木本指示植物中，除個別分離物以外，光輝顯現(xiàn)較為明顯的病癥時間普遍較晚，一般在６月下旬，和其他２種指示植物相比，大約晚１個月左右，且部分分離物不侵染光輝，較其他２種指示植物靈敏度弱。雜種榅桲較Ｓｐｙ２２７的癥狀反應(yīng)種類更多，如葉片黃斑、退綠斑、舟形葉等，這種靈敏性更有利于區(qū)別同一病毒不同的株系。因此，雜種榅桲最適合做ＡＳＰＶ的指示植物，其次為Ｓｐｙ２２７，最后是光輝，這與王國平等［３，６］的報道基本一致。

３小結(jié)與討論

當(dāng)前研究中較多應(yīng)用分子生物學(xué)方法對病毒進(jìn)行鑒定及株系分化研究，如利用ＰＣＲ技術(shù)擴(kuò)增某特定基因并通過測序獲得核苷酸序列信息之后可進(jìn)行病毒系統(tǒng)進(jìn)化分析。從遺傳學(xué)理論上來看，基于病毒不同分離物基因組核苷酸序列信息能夠反應(yīng)不同分離物間的親緣關(guān)系，但某一特定基因上一個堿基的改變就可能使病毒的表型發(fā)生變化；反之，幾個堿基的變化也可能不引起任何表型上的改變［４］。因此，單純以核苷酸序列信息來劃分株系也存在一定不足，而病毒的寄主范圍及引起的病癥等生物學(xué)特征可彌補(bǔ)此不足，因而病毒的生物學(xué)鑒定當(dāng)前仍具有重要理論及應(yīng)用價值。

ＡＳＰＶ在寄主植物上多呈潛伏侵染，不引起明顯癥狀［１］，在受侵染的植株中病毒的濃度通常很低，因此進(jìn)行生物學(xué)鑒定需要多種寄主植物同時檢測。鑒定ＡＳＰＶ一般采用木本指示植物雜種榅桲、光輝、Ｓｐｙ２２７、梨品種考密斯和Ａ２０，同時結(jié)合草本指示植物西方煙37B進(jìn)行［３，６］，除Ａ２０外，本研究選用了上述指示植物對ＡＳＰＶ進(jìn)行了鑒定。試驗結(jié)果表明，蘋果屬指示植物雜種榅桲、光輝和Ｓｐｙ２２７均能靈敏地檢測出ＡＳＰＶ，表現(xiàn)典型癥狀，而梨屬指示植物梨品種考密斯，只有ＡＳＰＶ分離物ｊｆ４和ｐｖ１０在其上顯現(xiàn)出沿葉脈退綠，接種的其他不同ＡＳＰＶ分離物未呈現(xiàn)明顯癥狀，提供的信息較少，因而尚需開發(fā)更有效的梨屬指示植物。

王國平等［３］報道ＡＳＰＶ在梨品種考密斯上的早期表現(xiàn)為沿葉脈退綠，后期引起系統(tǒng)脈明癥狀。有研究表明脈明是一種光學(xué)幻覺（Ｏｐｔｉｃａｌ ｉｌｌｕｓｉｏｎ），煙草花葉病毒（Ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ， ＴＭＶ）侵染煙草后，溫度若在２５ ℃以上則產(chǎn)生脈明，在４０ ℃以下隨溫度升高脈明程度增強(qiáng)［４］。本研究并未觀察到脈明癥狀，分析其原因可能在于脈明癥狀表現(xiàn)時間較短，在觀察時很可能錯過了脈明癥狀的表現(xiàn)時間，而未能觀察到脈明癥狀。

參考文獻(xiàn)：

［１］ ＪＥＬＫＭＡＮＮ Ｗ． Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ａｐｐｌｅ ｓｔｅｍ ｐｉｔｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ａ ｓｉｍｉｌａｒ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｐｅａｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖｅｉｎ ｙｅｌｌｏｗｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｘ ａｎｄ ｃａｒｌａｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９９４， ７５：１５３５－１５４２．

［２］ 劉福昌， 王煥玉． 蘋果潛隱病毒（Ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ）研究Ⅱ蘋果品種和矮生砧木潛隱病毒鑒定［Ｊ］． 植物病理學(xué)報，１９８９，１９（４）：１９３－１９７．

［３］ 王國平，洪霓，張尊平，等．我國北方梨產(chǎn)區(qū)主要品種病毒種類的鑒定研究［Ｊ］．中國果樹，１９９４（２）：１－４．

［４］ ＨＵＬＬ Ｒ．馬修斯植物病毒學(xué)（Ｍａｔｔｈｅｗｓ′Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）［Ｍ］．范在豐， 李懷方，譯． 北京：科學(xué)出版社，２００７．

［５］ 侯義龍．果樹主要病毒ＲＴ－ＰＣＲ檢測體系的建立、優(yōu)化及病毒特異ＤＮＡ片段克隆測序研究［Ｄ］．沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，２０００．

［６］ 王國平，王煥玉，張尊平，等．幾種木本指示植物對蘋果潛隱病毒敏感性的研究［Ｊ］．北方果樹，１９９２（２）：８－１０．

２．２不同ＡＳＰＶ分離物二重芽接法木本指示植物后的癥狀分析

木本指示植物觀察結(jié)果顯示，雜種榅桲在初期表現(xiàn)不同程度的葉片反卷癥狀，有的分離物還有葉片黃斑、舟形葉癥狀，如分離物ｐｖ１３、ｊｆ５；至６月上旬植株矮化，８月初主干皮層表現(xiàn)壞死斑，后期剝開樹皮，有的可見木質(zhì)部的莖痘斑；光輝經(jīng)ＡＳＰＶ侵染后主要表現(xiàn)葉片反卷、植株矮化，部分植株還會出現(xiàn)葉片皺縮、木質(zhì)部莖痘斑的現(xiàn)象；５月下旬至６月上旬Ｓｐｙ２２７出現(xiàn)葉片反卷的癥狀，６月中旬以后主干皮層表面產(chǎn)生不規(guī)則的紅褐斑，有些植株頂端枯死，生長衰退或矮化，木質(zhì)部表面有凹陷斑（圖２）。

從寄主范圍來看，嫁接木本指示植物梨品種考密斯后，只有病毒分離物ｊｆ４和ｐｖ１０在梨品種考密斯上顯現(xiàn)出沿葉脈退綠癥狀，接種的其他不同分離物并未呈現(xiàn)明顯癥狀。ＡＳＰＶ分離物ｐｖ９、ｐｖ１３和ｊｆ１只侵染Ｓｐｙ２２７、雜種榅桲２種指示植物，不侵染光輝。其他的９個分離物的寄主范圍相同，為雜種榅桲、Ｓｐｙ２２７和光輝。

不同分離物在不同指示植物上的癥狀較復(fù)雜，并未呈現(xiàn)明顯規(guī)律性，因而單純以生物學(xué)癥狀特點(diǎn)難以進(jìn)行系統(tǒng)的ＡＳＰＶ株系分化分析。３種木本指示植物中，除個別分離物以外，光輝顯現(xiàn)較為明顯的病癥時間普遍較晚，一般在６月下旬，和其他２種指示植物相比，大約晚１個月左右，且部分分離物不侵染光輝，較其他２種指示植物靈敏度弱。雜種榅桲較Ｓｐｙ２２７的癥狀反應(yīng)種類更多，如葉片黃斑、退綠斑、舟形葉等，這種靈敏性更有利于區(qū)別同一病毒不同的株系。因此，雜種榅桲最適合做ＡＳＰＶ的指示植物，其次為Ｓｐｙ２２７，最后是光輝，這與王國平等［３，６］的報道基本一致。

３小結(jié)與討論

當(dāng)前研究中較多應(yīng)用分子生物學(xué)方法對病毒進(jìn)行鑒定及株系分化研究，如利用ＰＣＲ技術(shù)擴(kuò)增某特定基因并通過測序獲得核苷酸序列信息之后可進(jìn)行病毒系統(tǒng)進(jìn)化分析。從遺傳學(xué)理論上來看，基于病毒不同分離物基因組核苷酸序列信息能夠反應(yīng)不同分離物間的親緣關(guān)系，但某一特定基因上一個堿基的改變就可能使病毒的表型發(fā)生變化；反之，幾個堿基的變化也可能不引起任何表型上的改變［４］。因此，單純以核苷酸序列信息來劃分株系也存在一定不足，而病毒的寄主范圍及引起的病癥等生物學(xué)特征可彌補(bǔ)此不足，因而病毒的生物學(xué)鑒定當(dāng)前仍具有重要理論及應(yīng)用價值。

ＡＳＰＶ在寄主植物上多呈潛伏侵染，不引起明顯癥狀［１］，在受侵染的植株中病毒的濃度通常很低，因此進(jìn)行生物學(xué)鑒定需要多種寄主植物同時檢測。鑒定ＡＳＰＶ一般采用木本指示植物雜種榅桲、光輝、Ｓｐｙ２２７、梨品種考密斯和Ａ２０，同時結(jié)合草本指示植物西方煙37B進(jìn)行［３，６］，除Ａ２０外，本研究選用了上述指示植物對ＡＳＰＶ進(jìn)行了鑒定。試驗結(jié)果表明，蘋果屬指示植物雜種榅桲、光輝和Ｓｐｙ２２７均能靈敏地檢測出ＡＳＰＶ，表現(xiàn)典型癥狀，而梨屬指示植物梨品種考密斯，只有ＡＳＰＶ分離物ｊｆ４和ｐｖ１０在其上顯現(xiàn)出沿葉脈退綠，接種的其他不同ＡＳＰＶ分離物未呈現(xiàn)明顯癥狀，提供的信息較少，因而尚需開發(fā)更有效的梨屬指示植物。

王國平等［３］報道ＡＳＰＶ在梨品種考密斯上的早期表現(xiàn)為沿葉脈退綠，后期引起系統(tǒng)脈明癥狀。有研究表明脈明是一種光學(xué)幻覺（Ｏｐｔｉｃａｌ ｉｌｌｕｓｉｏｎ），煙草花葉病毒（Ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ， ＴＭＶ）侵染煙草后，溫度若在２５ ℃以上則產(chǎn)生脈明，在４０ ℃以下隨溫度升高脈明程度增強(qiáng)［４］。本研究并未觀察到脈明癥狀，分析其原因可能在于脈明癥狀表現(xiàn)時間較短，在觀察時很可能錯過了脈明癥狀的表現(xiàn)時間，而未能觀察到脈明癥狀。

參考文獻(xiàn)：

［１］ ＪＥＬＫＭＡＮＮ Ｗ． Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ａｐｐｌｅ ｓｔｅｍ ｐｉｔｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ａ ｓｉｍｉｌａｒ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｐｅａｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖｅｉｎ ｙｅｌｌｏｗｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｘ ａｎｄ ｃａｒｌａｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９９４， ７５：１５３５－１５４２．

［２］ 劉福昌， 王煥玉． 蘋果潛隱病毒（Ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ）研究Ⅱ蘋果品種和矮生砧木潛隱病毒鑒定［Ｊ］． 植物病理學(xué)報，１９８９，１９（４）：１９３－１９７．

［３］ 王國平，洪霓，張尊平，等．我國北方梨產(chǎn)區(qū)主要品種病毒種類的鑒定研究［Ｊ］．中國果樹，１９９４（２）：１－４．

［４］ ＨＵＬＬ Ｒ．馬修斯植物病毒學(xué)（Ｍａｔｔｈｅｗｓ′Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）［Ｍ］．范在豐， 李懷方，譯． 北京：科學(xué)出版社，２００７．

［５］ 侯義龍．果樹主要病毒ＲＴ－ＰＣＲ檢測體系的建立、優(yōu)化及病毒特異ＤＮＡ片段克隆測序研究［Ｄ］．沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，２０００．

［６］ 王國平，王煥玉，張尊平，等．幾種木本指示植物對蘋果潛隱病毒敏感性的研究［Ｊ］．北方果樹，１９９２（２）：８－１０．

２．２不同ＡＳＰＶ分離物二重芽接法木本指示植物后的癥狀分析

木本指示植物觀察結(jié)果顯示，雜種榅桲在初期表現(xiàn)不同程度的葉片反卷癥狀，有的分離物還有葉片黃斑、舟形葉癥狀，如分離物ｐｖ１３、ｊｆ５；至６月上旬植株矮化，８月初主干皮層表現(xiàn)壞死斑，后期剝開樹皮，有的可見木質(zhì)部的莖痘斑；光輝經(jīng)ＡＳＰＶ侵染后主要表現(xiàn)葉片反卷、植株矮化，部分植株還會出現(xiàn)葉片皺縮、木質(zhì)部莖痘斑的現(xiàn)象；５月下旬至６月上旬Ｓｐｙ２２７出現(xiàn)葉片反卷的癥狀，６月中旬以后主干皮層表面產(chǎn)生不規(guī)則的紅褐斑，有些植株頂端枯死，生長衰退或矮化，木質(zhì)部表面有凹陷斑（圖２）。

從寄主范圍來看，嫁接木本指示植物梨品種考密斯后，只有病毒分離物ｊｆ４和ｐｖ１０在梨品種考密斯上顯現(xiàn)出沿葉脈退綠癥狀，接種的其他不同分離物并未呈現(xiàn)明顯癥狀。ＡＳＰＶ分離物ｐｖ９、ｐｖ１３和ｊｆ１只侵染Ｓｐｙ２２７、雜種榅桲２種指示植物，不侵染光輝。其他的９個分離物的寄主范圍相同，為雜種榅桲、Ｓｐｙ２２７和光輝。

不同分離物在不同指示植物上的癥狀較復(fù)雜，并未呈現(xiàn)明顯規(guī)律性，因而單純以生物學(xué)癥狀特點(diǎn)難以進(jìn)行系統(tǒng)的ＡＳＰＶ株系分化分析。３種木本指示植物中，除個別分離物以外，光輝顯現(xiàn)較為明顯的病癥時間普遍較晚，一般在６月下旬，和其他２種指示植物相比，大約晚１個月左右，且部分分離物不侵染光輝，較其他２種指示植物靈敏度弱。雜種榅桲較Ｓｐｙ２２７的癥狀反應(yīng)種類更多，如葉片黃斑、退綠斑、舟形葉等，這種靈敏性更有利于區(qū)別同一病毒不同的株系。因此，雜種榅桲最適合做ＡＳＰＶ的指示植物，其次為Ｓｐｙ２２７，最后是光輝，這與王國平等［３，６］的報道基本一致。

３小結(jié)與討論

當(dāng)前研究中較多應(yīng)用分子生物學(xué)方法對病毒進(jìn)行鑒定及株系分化研究，如利用ＰＣＲ技術(shù)擴(kuò)增某特定基因并通過測序獲得核苷酸序列信息之后可進(jìn)行病毒系統(tǒng)進(jìn)化分析。從遺傳學(xué)理論上來看，基于病毒不同分離物基因組核苷酸序列信息能夠反應(yīng)不同分離物間的親緣關(guān)系，但某一特定基因上一個堿基的改變就可能使病毒的表型發(fā)生變化；反之，幾個堿基的變化也可能不引起任何表型上的改變［４］。因此，單純以核苷酸序列信息來劃分株系也存在一定不足，而病毒的寄主范圍及引起的病癥等生物學(xué)特征可彌補(bǔ)此不足，因而病毒的生物學(xué)鑒定當(dāng)前仍具有重要理論及應(yīng)用價值。

ＡＳＰＶ在寄主植物上多呈潛伏侵染，不引起明顯癥狀［１］，在受侵染的植株中病毒的濃度通常很低，因此進(jìn)行生物學(xué)鑒定需要多種寄主植物同時檢測。鑒定ＡＳＰＶ一般采用木本指示植物雜種榅桲、光輝、Ｓｐｙ２２７、梨品種考密斯和Ａ２０，同時結(jié)合草本指示植物西方煙37B進(jìn)行［３，６］，除Ａ２０外，本研究選用了上述指示植物對ＡＳＰＶ進(jìn)行了鑒定。試驗結(jié)果表明，蘋果屬指示植物雜種榅桲、光輝和Ｓｐｙ２２７均能靈敏地檢測出ＡＳＰＶ，表現(xiàn)典型癥狀，而梨屬指示植物梨品種考密斯，只有ＡＳＰＶ分離物ｊｆ４和ｐｖ１０在其上顯現(xiàn)出沿葉脈退綠，接種的其他不同ＡＳＰＶ分離物未呈現(xiàn)明顯癥狀，提供的信息較少，因而尚需開發(fā)更有效的梨屬指示植物。

王國平等［３］報道ＡＳＰＶ在梨品種考密斯上的早期表現(xiàn)為沿葉脈退綠，后期引起系統(tǒng)脈明癥狀。有研究表明脈明是一種光學(xué)幻覺（Ｏｐｔｉｃａｌ ｉｌｌｕｓｉｏｎ），煙草花葉病毒（Ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ， ＴＭＶ）侵染煙草后，溫度若在２５ ℃以上則產(chǎn)生脈明，在４０ ℃以下隨溫度升高脈明程度增強(qiáng)［４］。本研究并未觀察到脈明癥狀，分析其原因可能在于脈明癥狀表現(xiàn)時間較短，在觀察時很可能錯過了脈明癥狀的表現(xiàn)時間，而未能觀察到脈明癥狀。

參考文獻(xiàn)：

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