• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    蘋果莖痘病毒的生物學鑒定

    2014-08-08 10:49:45李麗麗
    湖北農(nóng)業(yè)科學 2014年9期
    關(guān)鍵詞:檢測

    李麗麗

    摘要:基于前期研究中獲得的14個蘋果莖痘病毒(ASPV)分離物,將其分別接種于不同草本、木本指示植物,分析其在不同寄主上的癥狀變化特點。結(jié)果顯示,ASPV各分離物只局部侵染草本指示植物西方煙(Nicotiana occidentalis),而均未引起系統(tǒng)侵染;不同分離物接種的西方煙各植株癥狀沒有明顯差別。在木本指示植物中,所有分離物皆侵染雜種榅桲(Pyronia veitchii)和Spy227,部分分離物不侵染光輝(R65-76 Radiant),僅少數(shù)病毒分離物在梨品種考密斯(Doyenne du Comice)上顯示癥狀。總體來看,雜種榅桲最適合做ASPV的指示植物,其次為Spy227,最后是光輝。不同分離物在不同指示植物上的癥狀較復雜,并未呈現(xiàn)明顯規(guī)律性,因而單純以生物學癥狀特點難以進行系統(tǒng)的ASPV株系分化分析。

    關(guān)鍵詞:蘋果莖痘病毒(ASPV);檢測;指示植物

    中圖分類號:S661.1;S436.611.1 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2014)09-2055-03

    Biological Identification of ASPV

    LI Li-li

    (Institute of Forestry Science of Heilongjiang Province,Harbin 150081,China)

    Abstract:14 Chinese isolates of ASPV obtained from previous study were inoculated in various woody and herbaceous indicators. The system variation and characteristic of different hosts were analyzed. The results showed that ASPV isolates only partially infected Nicotiana occidentalis and the systems were the same on the whole. In woody indicators, Pyronia veitchii and Spy227 could be infected by all isolates, but R65-76 Radiant could be infected by partial isolates. The systems of few isolates could be found in Doyenne du Comice. On the whole, Pyronia veitchii was the best indicator plant for ASPV, and Spy227 was the second best indicator plant for ASPV. R65-76 Radiant was worse than Pyronia veitchii and Spy227. The systems of various ASPV isolates were complicated in different indicator plants. No obvious rule could be found, therefore, the strain differentiation could not be systematically analyzed only by the biological characteristic.

    Key words: Apple stem pitting virus(ASPV); detection; indicator plants

    蘋果莖痘病毒(ASPV)是一種嚴重危害果樹生產(chǎn)的潛隱性病毒。ASPV主要侵染蘋果和梨,ASPV常與蘋果退綠葉斑病毒(ACLSV)、蘋果莖溝病毒(ASGV)等混合侵染,導致蘋果和梨產(chǎn)量降低,品質(zhì)變劣[1]。

    ASPV在中國危害較嚴重,植株帶毒率普遍較高。劉福昌等[2]報道我國的渤海灣、黃河故道和西北高原蘋果主產(chǎn)區(qū)主栽蘋果品種和營養(yǎng)系矮生砧木普遍受ASPV、ASGV、ACLSV侵染,其中ASPV帶毒率普遍高于50%,金冠、元帥的帶毒率則高于80%。王國平等[3]研究結(jié)果表明我國北方梨產(chǎn)區(qū)主栽品種上ASPV的平均帶毒率為61.8%。

    生物學方法長期以來一直是進行病毒鑒定及株系劃分最基礎(chǔ)的方法之一,主要通過病毒汁液摩擦接種、二重芽接法等方式接種于寄主植物上,根據(jù)寄主癥狀表現(xiàn)及寄主范圍來對病毒或病毒株系進行鑒定[4]。該方法的結(jié)果較直觀,適合基層農(nóng)技人員使用,此外,也利于發(fā)現(xiàn)新的病毒株系?;谇捌谘芯恐蝎@得的18個ASPV分離物,本研究將其分別接種于不同草本、木本寄主植物,分析其在不同寄主上的癥狀變化特點,并進一步探索基于生物學方法對ASPV進行株系分化研究。

    1材料和方法

    1.1植物材料

    采集蘋果樣本,利用RT-PCR技術(shù)和ELISA技術(shù)檢測ACLSV、ASGV和ASPV的侵染情況[5],確定僅受ASPV侵染的樣本進行后續(xù)研究,共獲得了14個ASPV分離物,分別命名為pv2、pv4、pv5、pv6、pv7、pv9、pv10、pv11、pv13、jf1、jf2、jf3、jf4、jf5。

    草本指示植物為西方煙(Nicotiana occidentalis) 37B;木本指示植物包括Spy227、光輝(R65-76 Radiant)和雜種榅桲(Pyronia veitchii),梨品種考密斯(Doyenne du Comice)。

    1.2病毒汁液摩擦接種

    溫室播種西方煙,待西方煙長到3~4葉時進行接種。研缽放于180 ℃烘箱滅菌,然后將研缽和接種緩沖液置冰上預冷;向西方煙葉片撒上金剛砂(1 000目),取出待檢樣品葉片,加入2~5倍(W/V)接種緩沖液和少許金剛砂,低溫條件下迅速研磨,用研磨棒蘸取汁液,輕輕涂抹葉面,蒸餾水沖洗接種葉面,每個樣品分別用兩種緩沖液重復4次,放置溫室觀察。

    1.3二重芽接法

    播種砧木山定子和杜梨,第二年定植實生苗,之后進行二重芽接,接種受ASPV感染接穗(RT-PCR檢測顯示未受ASGV和ACLSV感染)[5]。當指示植物如蘋果時用山定子作砧木,為梨時則用杜梨作砧木。先將供試毒源樣品的芽片嫁接在實生砧的基部,然后再把指示植物的芽片嫁接在毒源芽片接口上方約2 cm處。每樣品/指示植物組合重復4次。第二年苗木發(fā)芽前,在指示植物接芽的上方約10 cm處剪除砧干。苗木發(fā)芽后摘除毒源芽的生長點,以促進指示植物嫁接芽的生長。定期觀察指示植物的癥狀反應。

    2結(jié)果與分析

    2.1不同ASPV分離物摩擦接種草本指示植物后的癥狀分析

    將不同ASPV分離物摩擦接種草本指示植物西方煙37B約7 d后,接種葉片上出現(xiàn)白色壞死斑點、退綠斑、葉片皺縮畸形或小凸起等明顯癥狀,而健康葉片未見明顯癥狀(圖1)。不同分離物接種的西方煙37B各植株癥狀沒有明顯差別。同時在后期的觀察中,系統(tǒng)葉片沒有表現(xiàn)任何病癥,由此可以判斷ASPV各分離物只局部侵染西方煙37B,而均未引起系統(tǒng)侵染。接種ASPV不同分離物的西方煙37B各植株葉片均表現(xiàn)出了畸形、皺縮和壞死斑的相同癥狀,僅有jf3、pv10、pv11和pv13四個分離物侵染的植株葉片額外有小凸起的癥狀。

    2.2不同ASPV分離物二重芽接法木本指示植物后的癥狀分析

    木本指示植物觀察結(jié)果顯示,雜種榅桲在初期表現(xiàn)不同程度的葉片反卷癥狀,有的分離物還有葉片黃斑、舟形葉癥狀,如分離物pv13、jf5;至6月上旬植株矮化,8月初主干皮層表現(xiàn)壞死斑,后期剝開樹皮,有的可見木質(zhì)部的莖痘斑;光輝經(jīng)ASPV侵染后主要表現(xiàn)葉片反卷、植株矮化,部分植株還會出現(xiàn)葉片皺縮、木質(zhì)部莖痘斑的現(xiàn)象;5月下旬至6月上旬Spy227出現(xiàn)葉片反卷的癥狀,6月中旬以后主干皮層表面產(chǎn)生不規(guī)則的紅褐斑,有些植株頂端枯死,生長衰退或矮化,木質(zhì)部表面有凹陷斑(圖2)。

    從寄主范圍來看,嫁接木本指示植物梨品種考密斯后,只有病毒分離物jf4和pv10在梨品種考密斯上顯現(xiàn)出沿葉脈退綠癥狀,接種的其他不同分離物并未呈現(xiàn)明顯癥狀。ASPV分離物pv9、pv13和jf1只侵染Spy227、雜種榅桲2種指示植物,不侵染光輝。其他的9個分離物的寄主范圍相同,為雜種榅桲、Spy227和光輝。

    不同分離物在不同指示植物上的癥狀較復雜,并未呈現(xiàn)明顯規(guī)律性,因而單純以生物學癥狀特點難以進行系統(tǒng)的ASPV株系分化分析。3種木本指示植物中,除個別分離物以外,光輝顯現(xiàn)較為明顯的病癥時間普遍較晚,一般在6月下旬,和其他2種指示植物相比,大約晚1個月左右,且部分分離物不侵染光輝,較其他2種指示植物靈敏度弱。雜種榅桲較Spy227的癥狀反應種類更多,如葉片黃斑、退綠斑、舟形葉等,這種靈敏性更有利于區(qū)別同一病毒不同的株系。因此,雜種榅桲最適合做ASPV的指示植物,其次為Spy227,最后是光輝,這與王國平等[3,6]的報道基本一致。

    3小結(jié)與討論

    當前研究中較多應用分子生物學方法對病毒進行鑒定及株系分化研究,如利用PCR技術(shù)擴增某特定基因并通過測序獲得核苷酸序列信息之后可進行病毒系統(tǒng)進化分析。從遺傳學理論上來看,基于病毒不同分離物基因組核苷酸序列信息能夠反應不同分離物間的親緣關(guān)系,但某一特定基因上一個堿基的改變就可能使病毒的表型發(fā)生變化;反之,幾個堿基的變化也可能不引起任何表型上的改變[4]。因此,單純以核苷酸序列信息來劃分株系也存在一定不足,而病毒的寄主范圍及引起的病癥等生物學特征可彌補此不足,因而病毒的生物學鑒定當前仍具有重要理論及應用價值。

    ASPV在寄主植物上多呈潛伏侵染,不引起明顯癥狀[1],在受侵染的植株中病毒的濃度通常很低,因此進行生物學鑒定需要多種寄主植物同時檢測。鑒定ASPV一般采用木本指示植物雜種榅桲、光輝、Spy227、梨品種考密斯和A20,同時結(jié)合草本指示植物西方煙37B進行[3,6],除A20外,本研究選用了上述指示植物對ASPV進行了鑒定。試驗結(jié)果表明,蘋果屬指示植物雜種榅桲、光輝和Spy227均能靈敏地檢測出ASPV,表現(xiàn)典型癥狀,而梨屬指示植物梨品種考密斯,只有ASPV分離物jf4和pv10在其上顯現(xiàn)出沿葉脈退綠,接種的其他不同ASPV分離物未呈現(xiàn)明顯癥狀,提供的信息較少,因而尚需開發(fā)更有效的梨屬指示植物。

    王國平等[3]報道ASPV在梨品種考密斯上的早期表現(xiàn)為沿葉脈退綠,后期引起系統(tǒng)脈明癥狀。有研究表明脈明是一種光學幻覺(Optical illusion),煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)侵染煙草后,溫度若在25 ℃以上則產(chǎn)生脈明,在40 ℃以下隨溫度升高脈明程度增強[4]。本研究并未觀察到脈明癥狀,分析其原因可能在于脈明癥狀表現(xiàn)時間較短,在觀察時很可能錯過了脈明癥狀的表現(xiàn)時間,而未能觀察到脈明癥狀。

    參考文獻:

    [1] JELKMANN W. Nucleotide sequences of apple stem pitting virus and of the coat protein gene of a similar virus from pear associated with vein yellows disease and their relationship with potex and carlaviruses[J]. Journal of General Virology, 1994, 75:1535-1542.

    [2] 劉福昌, 王煥玉. 蘋果潛隱病毒(Latent virus)研究Ⅱ蘋果品種和矮生砧木潛隱病毒鑒定[J]. 植物病理學報,1989,19(4):193-197.

    [3] 王國平,洪霓,張尊平,等.我國北方梨產(chǎn)區(qū)主要品種病毒種類的鑒定研究[J].中國果樹,1994(2):1-4.

    [4] HULL R.馬修斯植物病毒學(Matthews′Plant Virology)[M].范在豐, 李懷方,譯. 北京:科學出版社,2007.

    [5] 侯義龍.果樹主要病毒RT-PCR檢測體系的建立、優(yōu)化及病毒特異DNA片段克隆測序研究[D].沈陽:沈陽農(nóng)業(yè)大學,2000.

    [6] 王國平,王煥玉,張尊平,等.幾種木本指示植物對蘋果潛隱病毒敏感性的研究[J].北方果樹,1992(2):8-10.

    2.2不同ASPV分離物二重芽接法木本指示植物后的癥狀分析

    木本指示植物觀察結(jié)果顯示,雜種榅桲在初期表現(xiàn)不同程度的葉片反卷癥狀,有的分離物還有葉片黃斑、舟形葉癥狀,如分離物pv13、jf5;至6月上旬植株矮化,8月初主干皮層表現(xiàn)壞死斑,后期剝開樹皮,有的可見木質(zhì)部的莖痘斑;光輝經(jīng)ASPV侵染后主要表現(xiàn)葉片反卷、植株矮化,部分植株還會出現(xiàn)葉片皺縮、木質(zhì)部莖痘斑的現(xiàn)象;5月下旬至6月上旬Spy227出現(xiàn)葉片反卷的癥狀,6月中旬以后主干皮層表面產(chǎn)生不規(guī)則的紅褐斑,有些植株頂端枯死,生長衰退或矮化,木質(zhì)部表面有凹陷斑(圖2)。

    從寄主范圍來看,嫁接木本指示植物梨品種考密斯后,只有病毒分離物jf4和pv10在梨品種考密斯上顯現(xiàn)出沿葉脈退綠癥狀,接種的其他不同分離物并未呈現(xiàn)明顯癥狀。ASPV分離物pv9、pv13和jf1只侵染Spy227、雜種榅桲2種指示植物,不侵染光輝。其他的9個分離物的寄主范圍相同,為雜種榅桲、Spy227和光輝。

    不同分離物在不同指示植物上的癥狀較復雜,并未呈現(xiàn)明顯規(guī)律性,因而單純以生物學癥狀特點難以進行系統(tǒng)的ASPV株系分化分析。3種木本指示植物中,除個別分離物以外,光輝顯現(xiàn)較為明顯的病癥時間普遍較晚,一般在6月下旬,和其他2種指示植物相比,大約晚1個月左右,且部分分離物不侵染光輝,較其他2種指示植物靈敏度弱。雜種榅桲較Spy227的癥狀反應種類更多,如葉片黃斑、退綠斑、舟形葉等,這種靈敏性更有利于區(qū)別同一病毒不同的株系。因此,雜種榅桲最適合做ASPV的指示植物,其次為Spy227,最后是光輝,這與王國平等[3,6]的報道基本一致。

    3小結(jié)與討論

    當前研究中較多應用分子生物學方法對病毒進行鑒定及株系分化研究,如利用PCR技術(shù)擴增某特定基因并通過測序獲得核苷酸序列信息之后可進行病毒系統(tǒng)進化分析。從遺傳學理論上來看,基于病毒不同分離物基因組核苷酸序列信息能夠反應不同分離物間的親緣關(guān)系,但某一特定基因上一個堿基的改變就可能使病毒的表型發(fā)生變化;反之,幾個堿基的變化也可能不引起任何表型上的改變[4]。因此,單純以核苷酸序列信息來劃分株系也存在一定不足,而病毒的寄主范圍及引起的病癥等生物學特征可彌補此不足,因而病毒的生物學鑒定當前仍具有重要理論及應用價值。

    ASPV在寄主植物上多呈潛伏侵染,不引起明顯癥狀[1],在受侵染的植株中病毒的濃度通常很低,因此進行生物學鑒定需要多種寄主植物同時檢測。鑒定ASPV一般采用木本指示植物雜種榅桲、光輝、Spy227、梨品種考密斯和A20,同時結(jié)合草本指示植物西方煙37B進行[3,6],除A20外,本研究選用了上述指示植物對ASPV進行了鑒定。試驗結(jié)果表明,蘋果屬指示植物雜種榅桲、光輝和Spy227均能靈敏地檢測出ASPV,表現(xiàn)典型癥狀,而梨屬指示植物梨品種考密斯,只有ASPV分離物jf4和pv10在其上顯現(xiàn)出沿葉脈退綠,接種的其他不同ASPV分離物未呈現(xiàn)明顯癥狀,提供的信息較少,因而尚需開發(fā)更有效的梨屬指示植物。

    王國平等[3]報道ASPV在梨品種考密斯上的早期表現(xiàn)為沿葉脈退綠,后期引起系統(tǒng)脈明癥狀。有研究表明脈明是一種光學幻覺(Optical illusion),煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)侵染煙草后,溫度若在25 ℃以上則產(chǎn)生脈明,在40 ℃以下隨溫度升高脈明程度增強[4]。本研究并未觀察到脈明癥狀,分析其原因可能在于脈明癥狀表現(xiàn)時間較短,在觀察時很可能錯過了脈明癥狀的表現(xiàn)時間,而未能觀察到脈明癥狀。

    參考文獻:

    [1] JELKMANN W. Nucleotide sequences of apple stem pitting virus and of the coat protein gene of a similar virus from pear associated with vein yellows disease and their relationship with potex and carlaviruses[J]. Journal of General Virology, 1994, 75:1535-1542.

    [2] 劉福昌, 王煥玉. 蘋果潛隱病毒(Latent virus)研究Ⅱ蘋果品種和矮生砧木潛隱病毒鑒定[J]. 植物病理學報,1989,19(4):193-197.

    [3] 王國平,洪霓,張尊平,等.我國北方梨產(chǎn)區(qū)主要品種病毒種類的鑒定研究[J].中國果樹,1994(2):1-4.

    [4] HULL R.馬修斯植物病毒學(Matthews′Plant Virology)[M].范在豐, 李懷方,譯. 北京:科學出版社,2007.

    [5] 侯義龍.果樹主要病毒RT-PCR檢測體系的建立、優(yōu)化及病毒特異DNA片段克隆測序研究[D].沈陽:沈陽農(nóng)業(yè)大學,2000.

    [6] 王國平,王煥玉,張尊平,等.幾種木本指示植物對蘋果潛隱病毒敏感性的研究[J].北方果樹,1992(2):8-10.

    2.2不同ASPV分離物二重芽接法木本指示植物后的癥狀分析

    木本指示植物觀察結(jié)果顯示,雜種榅桲在初期表現(xiàn)不同程度的葉片反卷癥狀,有的分離物還有葉片黃斑、舟形葉癥狀,如分離物pv13、jf5;至6月上旬植株矮化,8月初主干皮層表現(xiàn)壞死斑,后期剝開樹皮,有的可見木質(zhì)部的莖痘斑;光輝經(jīng)ASPV侵染后主要表現(xiàn)葉片反卷、植株矮化,部分植株還會出現(xiàn)葉片皺縮、木質(zhì)部莖痘斑的現(xiàn)象;5月下旬至6月上旬Spy227出現(xiàn)葉片反卷的癥狀,6月中旬以后主干皮層表面產(chǎn)生不規(guī)則的紅褐斑,有些植株頂端枯死,生長衰退或矮化,木質(zhì)部表面有凹陷斑(圖2)。

    從寄主范圍來看,嫁接木本指示植物梨品種考密斯后,只有病毒分離物jf4和pv10在梨品種考密斯上顯現(xiàn)出沿葉脈退綠癥狀,接種的其他不同分離物并未呈現(xiàn)明顯癥狀。ASPV分離物pv9、pv13和jf1只侵染Spy227、雜種榅桲2種指示植物,不侵染光輝。其他的9個分離物的寄主范圍相同,為雜種榅桲、Spy227和光輝。

    不同分離物在不同指示植物上的癥狀較復雜,并未呈現(xiàn)明顯規(guī)律性,因而單純以生物學癥狀特點難以進行系統(tǒng)的ASPV株系分化分析。3種木本指示植物中,除個別分離物以外,光輝顯現(xiàn)較為明顯的病癥時間普遍較晚,一般在6月下旬,和其他2種指示植物相比,大約晚1個月左右,且部分分離物不侵染光輝,較其他2種指示植物靈敏度弱。雜種榅桲較Spy227的癥狀反應種類更多,如葉片黃斑、退綠斑、舟形葉等,這種靈敏性更有利于區(qū)別同一病毒不同的株系。因此,雜種榅桲最適合做ASPV的指示植物,其次為Spy227,最后是光輝,這與王國平等[3,6]的報道基本一致。

    3小結(jié)與討論

    當前研究中較多應用分子生物學方法對病毒進行鑒定及株系分化研究,如利用PCR技術(shù)擴增某特定基因并通過測序獲得核苷酸序列信息之后可進行病毒系統(tǒng)進化分析。從遺傳學理論上來看,基于病毒不同分離物基因組核苷酸序列信息能夠反應不同分離物間的親緣關(guān)系,但某一特定基因上一個堿基的改變就可能使病毒的表型發(fā)生變化;反之,幾個堿基的變化也可能不引起任何表型上的改變[4]。因此,單純以核苷酸序列信息來劃分株系也存在一定不足,而病毒的寄主范圍及引起的病癥等生物學特征可彌補此不足,因而病毒的生物學鑒定當前仍具有重要理論及應用價值。

    ASPV在寄主植物上多呈潛伏侵染,不引起明顯癥狀[1],在受侵染的植株中病毒的濃度通常很低,因此進行生物學鑒定需要多種寄主植物同時檢測。鑒定ASPV一般采用木本指示植物雜種榅桲、光輝、Spy227、梨品種考密斯和A20,同時結(jié)合草本指示植物西方煙37B進行[3,6],除A20外,本研究選用了上述指示植物對ASPV進行了鑒定。試驗結(jié)果表明,蘋果屬指示植物雜種榅桲、光輝和Spy227均能靈敏地檢測出ASPV,表現(xiàn)典型癥狀,而梨屬指示植物梨品種考密斯,只有ASPV分離物jf4和pv10在其上顯現(xiàn)出沿葉脈退綠,接種的其他不同ASPV分離物未呈現(xiàn)明顯癥狀,提供的信息較少,因而尚需開發(fā)更有效的梨屬指示植物。

    王國平等[3]報道ASPV在梨品種考密斯上的早期表現(xiàn)為沿葉脈退綠,后期引起系統(tǒng)脈明癥狀。有研究表明脈明是一種光學幻覺(Optical illusion),煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)侵染煙草后,溫度若在25 ℃以上則產(chǎn)生脈明,在40 ℃以下隨溫度升高脈明程度增強[4]。本研究并未觀察到脈明癥狀,分析其原因可能在于脈明癥狀表現(xiàn)時間較短,在觀察時很可能錯過了脈明癥狀的表現(xiàn)時間,而未能觀察到脈明癥狀。

    參考文獻:

    [1] JELKMANN W. Nucleotide sequences of apple stem pitting virus and of the coat protein gene of a similar virus from pear associated with vein yellows disease and their relationship with potex and carlaviruses[J]. Journal of General Virology, 1994, 75:1535-1542.

    [2] 劉福昌, 王煥玉. 蘋果潛隱病毒(Latent virus)研究Ⅱ蘋果品種和矮生砧木潛隱病毒鑒定[J]. 植物病理學報,1989,19(4):193-197.

    [3] 王國平,洪霓,張尊平,等.我國北方梨產(chǎn)區(qū)主要品種病毒種類的鑒定研究[J].中國果樹,1994(2):1-4.

    [4] HULL R.馬修斯植物病毒學(Matthews′Plant Virology)[M].范在豐, 李懷方,譯. 北京:科學出版社,2007.

    [5] 侯義龍.果樹主要病毒RT-PCR檢測體系的建立、優(yōu)化及病毒特異DNA片段克隆測序研究[D].沈陽:沈陽農(nóng)業(yè)大學,2000.

    [6] 王國平,王煥玉,張尊平,等.幾種木本指示植物對蘋果潛隱病毒敏感性的研究[J].北方果樹,1992(2):8-10.

    猜你喜歡
    檢測
    QC 檢測
    “不等式”檢測題
    “一元一次不等式”檢測題
    “一元一次不等式組”檢測題
    “幾何圖形”檢測題
    “角”檢測題
    “有理數(shù)的乘除法”檢測題
    “有理數(shù)”檢測題
    “角”檢測題
    “幾何圖形”檢測題
    伦理电影大哥的女人| 成人无遮挡网站| 天美传媒精品一区二区| 91在线精品国自产拍蜜月| xxxhd国产人妻xxx| 久久精品国产a三级三级三级| 午夜精品国产一区二区电影| 成人二区视频| av线在线观看网站| videos熟女内射| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产色爽女视频免费观看| 少妇精品久久久久久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 欧美激情 高清一区二区三区| 国产不卡av网站在线观看| 色5月婷婷丁香| 看免费成人av毛片| 日本免费在线观看一区| 边亲边吃奶的免费视频| 2022亚洲国产成人精品| 婷婷色综合大香蕉| 国产成人91sexporn| 久久人人爽人人爽人人片va| 制服人妻中文乱码| 国产精品一区二区在线不卡| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲 欧美一区二区三区| videossex国产| 一二三四在线观看免费中文在 | 欧美激情国产日韩精品一区| av有码第一页| 免费观看在线日韩| 久久免费观看电影| av福利片在线| 日韩三级伦理在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 中国三级夫妇交换| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 多毛熟女@视频| 亚洲国产精品一区三区| 人人澡人人妻人| 99久久综合免费| 狂野欧美激情性bbbbbb| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲av在线观看美女高潮| 男女无遮挡免费网站观看| 国产探花极品一区二区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 99香蕉大伊视频| 一级片'在线观看视频| 亚洲国产精品一区三区| 99久久精品国产国产毛片| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产深夜福利视频在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产伦理片在线播放av一区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲欧美精品自产自拍| 2022亚洲国产成人精品| 免费在线观看黄色视频的| 国产精品人妻久久久影院| 中国国产av一级| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲伊人色综图| 97超碰精品成人国产| 欧美日韩综合久久久久久| 一级,二级,三级黄色视频| 久久久久久伊人网av| 多毛熟女@视频| av国产久精品久网站免费入址| 水蜜桃什么品种好| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 少妇的逼水好多| 国产精品人妻久久久久久| 久久久国产精品麻豆| av免费观看日本| 97在线视频观看| 亚洲欧美清纯卡通| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产在线一区二区三区精| 亚洲,欧美精品.| 久久久久久久久久人人人人人人| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产成人91sexporn| 国产精品女同一区二区软件| 好男人视频免费观看在线| 五月天丁香电影| 中文字幕制服av| 成年动漫av网址| 九草在线视频观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 两性夫妻黄色片 | 看免费av毛片| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 免费在线观看完整版高清| 精品熟女少妇av免费看| 欧美精品一区二区免费开放| 色吧在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 在线 av 中文字幕| 三上悠亚av全集在线观看| 成年女人在线观看亚洲视频| 国产欧美亚洲国产| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 香蕉丝袜av| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 色哟哟·www| 色视频在线一区二区三区| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 男女午夜视频在线观看 | 男女边吃奶边做爰视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲国产色片| 高清毛片免费看| 亚洲人成网站在线观看播放| 精品国产露脸久久av麻豆| a级毛片在线看网站| 精品国产一区二区久久| 国产亚洲欧美精品永久| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 热99国产精品久久久久久7| 久久久久久久大尺度免费视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久久久精品人妻al黑| av.在线天堂| 国产精品成人在线| 在线观看三级黄色| 91精品国产国语对白视频| 最后的刺客免费高清国语| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲性久久影院| 寂寞人妻少妇视频99o| 99香蕉大伊视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 好男人视频免费观看在线| 天堂俺去俺来也www色官网| 丝袜喷水一区| a级片在线免费高清观看视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产精品无大码| 一边亲一边摸免费视频| 成人无遮挡网站| 啦啦啦啦在线视频资源| h视频一区二区三区| 波野结衣二区三区在线| 国产黄频视频在线观看| 国产成人精品婷婷| 久久国产亚洲av麻豆专区| 免费黄色在线免费观看| av在线app专区| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲av.av天堂| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久久久网色| 久久精品国产a三级三级三级| 91精品三级在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 一区二区av电影网| 制服人妻中文乱码| 亚洲精品国产av成人精品| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产又爽黄色视频| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 青春草国产在线视频| 国产免费又黄又爽又色| 色网站视频免费| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲av综合色区一区| 国产精品人妻久久久久久| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲美女视频黄频| av国产精品久久久久影院| 99热这里只有是精品在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 男女国产视频网站| 高清欧美精品videossex| 欧美成人午夜免费资源| 99re6热这里在线精品视频| 国产永久视频网站| 亚洲精品色激情综合| 久久青草综合色| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久久久久久亚洲中文字幕| 大陆偷拍与自拍| 少妇被粗大猛烈的视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产高清三级在线| 久久精品人人爽人人爽视色| 大香蕉久久成人网| 777米奇影视久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 一二三四在线观看免费中文在 | 免费观看在线日韩| av片东京热男人的天堂| 国产成人免费无遮挡视频| 在线观看www视频免费| 国产又爽黄色视频| 熟女电影av网| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 男女高潮啪啪啪动态图| 99久国产av精品国产电影| 亚洲av在线观看美女高潮| 不卡视频在线观看欧美| 国产黄频视频在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 精品国产一区二区久久| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久久精品区二区三区| 久久久欧美国产精品| 男女啪啪激烈高潮av片| 有码 亚洲区| 9热在线视频观看99| 久热这里只有精品99| 国产成人精品久久久久久| 亚洲成国产人片在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲伊人色综图| 久久久久久久久久久免费av| av福利片在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 久久av网站| 最新的欧美精品一区二区| 夫妻午夜视频| 久久久久精品性色| 欧美97在线视频| 久久99一区二区三区| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 日日啪夜夜爽| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 人人妻人人澡人人看| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 免费大片黄手机在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 国产成人免费无遮挡视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日韩电影二区| 久久久国产精品麻豆| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 精品国产一区二区久久| 9色porny在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 黄色 视频免费看| 国产日韩欧美在线精品| 久久久国产精品麻豆| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲 欧美一区二区三区| 少妇熟女欧美另类| 久久久a久久爽久久v久久| 久久鲁丝午夜福利片| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲国产精品成人久久小说| 丁香六月天网| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲av综合色区一区| www.av在线官网国产| 久久这里只有精品19| 春色校园在线视频观看| av在线app专区| 国产精品久久久久久久电影| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧美日韩av久久| 成人午夜精彩视频在线观看| 2022亚洲国产成人精品| 久久久久久久精品精品| 免费黄网站久久成人精品| 熟女电影av网| 91久久精品国产一区二区三区| 激情视频va一区二区三区| 成年人免费黄色播放视频| 国产成人91sexporn| 婷婷色综合www| 午夜视频国产福利| 久久99精品国语久久久| 日韩成人av中文字幕在线观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 黑丝袜美女国产一区| 五月玫瑰六月丁香| 97人妻天天添夜夜摸| 蜜桃在线观看..| 婷婷色综合大香蕉| 午夜老司机福利剧场| 精品国产一区二区三区四区第35| 免费高清在线观看视频在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲少妇的诱惑av| 黑丝袜美女国产一区| 777米奇影视久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 97在线视频观看| 另类精品久久| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 久久久久视频综合| 少妇 在线观看| 色5月婷婷丁香| 国产麻豆69| 下体分泌物呈黄色| 亚洲国产精品999| 国产一区二区在线观看av| 老司机影院成人| 国产成人午夜福利电影在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 成人无遮挡网站| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 丝袜美足系列| 日韩视频在线欧美| 只有这里有精品99| 热re99久久国产66热| 亚洲三级黄色毛片| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产成人a∨麻豆精品| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | a级毛色黄片| 成人亚洲欧美一区二区av| 男女国产视频网站| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 边亲边吃奶的免费视频| 日本爱情动作片www.在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| av国产精品久久久久影院| 午夜免费观看性视频| 免费观看a级毛片全部| 久久精品国产综合久久久 | 国产激情久久老熟女| 啦啦啦啦在线视频资源| videosex国产| 亚洲内射少妇av| 亚洲国产成人一精品久久久| 在线天堂最新版资源| 激情五月婷婷亚洲| 在线精品无人区一区二区三| 日本午夜av视频| 国产精品久久久久成人av| 尾随美女入室| 亚洲美女视频黄频| 五月天丁香电影| 免费看光身美女| 国产成人精品婷婷| 亚洲av综合色区一区| 黑丝袜美女国产一区| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久精品国产a三级三级三级| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精品一区二区在线不卡| 在线观看人妻少妇| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 青春草视频在线免费观看| 一区在线观看完整版| 在现免费观看毛片| 宅男免费午夜| 十分钟在线观看高清视频www| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲av电影在线进入| 精品久久国产蜜桃| 青春草国产在线视频| 在线天堂中文资源库| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产男女超爽视频在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美成人午夜免费资源| 男女下面插进去视频免费观看 | 不卡视频在线观看欧美| 亚洲精品乱久久久久久| 天堂俺去俺来也www色官网| 大陆偷拍与自拍| 国产亚洲欧美精品永久| 自线自在国产av| 一级片免费观看大全| 精品卡一卡二卡四卡免费| 赤兔流量卡办理| 精品一区二区免费观看| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美人与善性xxx| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产一级毛片在线| 国产免费一级a男人的天堂| 中国国产av一级| 免费少妇av软件| 日韩伦理黄色片| 国产乱来视频区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 制服人妻中文乱码| 高清毛片免费看| 最新的欧美精品一区二区| 国内精品宾馆在线| 99国产精品免费福利视频| 大片电影免费在线观看免费| 国产爽快片一区二区三区| 国产精品成人在线| 老司机影院成人| 久久久国产精品麻豆| 中文字幕最新亚洲高清| 日本91视频免费播放| 香蕉国产在线看| 欧美日韩av久久| 国产av精品麻豆| 日韩成人av中文字幕在线观看| 日韩视频在线欧美| 国产国语露脸激情在线看| 久久久久网色| videosex国产| 亚洲国产精品一区三区| 在线观看一区二区三区激情| 成人国产麻豆网| 激情视频va一区二区三区| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 在现免费观看毛片| 九草在线视频观看| 伦理电影免费视频| 欧美97在线视频| 女人精品久久久久毛片| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 午夜福利影视在线免费观看| 捣出白浆h1v1| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲欧美色中文字幕在线| 欧美日韩成人在线一区二区| 搡老乐熟女国产| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 少妇被粗大猛烈的视频| 水蜜桃什么品种好| 丝袜喷水一区| 99热国产这里只有精品6| 亚洲精品成人av观看孕妇| 寂寞人妻少妇视频99o| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 伦精品一区二区三区| 亚洲内射少妇av| 伊人久久国产一区二区| 欧美精品一区二区免费开放| 国产 精品1| 久久99一区二区三区| 一二三四中文在线观看免费高清| a级片在线免费高清观看视频| 大片电影免费在线观看免费| 成年av动漫网址| 黄片无遮挡物在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 黑丝袜美女国产一区| 久久精品久久精品一区二区三区| kizo精华| 国产激情久久老熟女| 国产精品久久久av美女十八| 精品一区二区免费观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| a级毛片黄视频| 熟女电影av网| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲久久久国产精品| av天堂久久9| 久久狼人影院| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 街头女战士在线观看网站| 99热全是精品| 母亲3免费完整高清在线观看 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 另类精品久久| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 精品国产国语对白av| 伦理电影大哥的女人| 免费观看性生交大片5| 伦精品一区二区三区| 黑人高潮一二区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲av.av天堂| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产极品粉嫩免费观看在线| 婷婷色av中文字幕| 2022亚洲国产成人精品| 九色亚洲精品在线播放| 国产免费福利视频在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产男女超爽视频在线观看| 在线观看免费高清a一片| 亚洲性久久影院| 国产高清国产精品国产三级| 精品视频人人做人人爽| 日日撸夜夜添| 国产乱人偷精品视频| 99香蕉大伊视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品无大码| a级毛色黄片| 国产精品偷伦视频观看了| 在线观看www视频免费| 久久99精品国语久久久| 亚洲成人一二三区av| 成人手机av| 国产精品一二三区在线看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美精品亚洲一区二区| 男女免费视频国产| 老司机亚洲免费影院| 日本免费在线观看一区| 成人无遮挡网站| 国产精品久久久久久久电影| 咕卡用的链子| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 嫩草影院入口| 免费av不卡在线播放| 午夜老司机福利剧场| 全区人妻精品视频| 久久国内精品自在自线图片| 最近中文字幕2019免费版| 美国免费a级毛片| 天堂中文最新版在线下载| 国产在视频线精品| 九九在线视频观看精品| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 在线观看免费高清a一片| 精品酒店卫生间| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲经典国产精华液单| 久久韩国三级中文字幕| 国产一区二区激情短视频 | 这个男人来自地球电影免费观看 | 街头女战士在线观看网站| 久久人人爽人人片av| 欧美精品一区二区免费开放| 国产乱来视频区| 亚洲天堂av无毛| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲av成人精品一二三区| 高清毛片免费看| av片东京热男人的天堂| 久久久国产欧美日韩av| 日韩三级伦理在线观看| 天天影视国产精品| 欧美精品国产亚洲| 在线观看免费视频网站a站| 欧美少妇被猛烈插入视频| 在线观看免费视频网站a站| 国产片内射在线| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产视频首页在线观看| 考比视频在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 18+在线观看网站| 国产高清国产精品国产三级| 伦精品一区二区三区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲久久久国产精品| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产免费现黄频在线看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 欧美xxⅹ黑人| 精品一区二区三区视频在线| 美女大奶头黄色视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 制服诱惑二区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| av免费观看日本| 乱人伦中国视频| 亚洲成国产人片在线观看| 午夜影院在线不卡| 欧美另类一区| 色5月婷婷丁香| 国产免费视频播放在线视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 一本大道久久a久久精品| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 最近的中文字幕免费完整| 大香蕉久久成人网| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲伊人久久精品综合| 国产成人精品一,二区| 有码 亚洲区| 久久久欧美国产精品| 一区二区三区四区激情视频| 免费高清在线观看日韩| 热99国产精品久久久久久7| 精品福利永久在线观看| 日韩一区二区三区影片| av播播在线观看一区| 国产在线一区二区三区精| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产av一区二区精品久久| 国产成人av激情在线播放| 女人久久www免费人成看片| 精品卡一卡二卡四卡免费|