姜黃素納米粒（NanoCurcTM）聯(lián)合索拉非尼對(duì)肝細(xì)胞癌（HCC）的協(xié)同抑制作用

胡 博 孫 超 孫 鼎 孫云帆 徐 泱

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所 上海 200032）

姜黃素納米粒（NanoCurcTM）聯(lián)合索拉非尼對(duì)肝細(xì)胞癌（HCC）的協(xié)同抑制作用

胡 博 孫 超 孫 鼎 孫云帆 徐 泱△

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所 上海 200032）

目的探討姜黃素納米粒（NanoCurcTM，NC）單藥或聯(lián)合索拉非尼對(duì)人肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的作用。方法采用體外細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（CCK-8）、體外劃痕試驗(yàn)和Transwell侵襲試驗(yàn)法檢測(cè)NC和/或索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞株MHCCLM3增殖、遷移、侵襲能力的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析其對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。建立裸鼠MHCCLM3原位移植模型并觀察NC和/或索拉非尼對(duì)腫瘤大小和肺轉(zhuǎn)移率的影響。應(yīng)用RTPCR、ELISA、Western blot法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）mRNA或相應(yīng)蛋白表達(dá)變化；并測(cè)定ERK1/2的磷酸化變化。結(jié)果NC與索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用可顯著抑制HCC體外增殖和侵襲能力（P＜0.01），抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移（P＜0.01）。單獨(dú)應(yīng)用NC和索拉非尼時(shí)肺轉(zhuǎn)移率分別為50.0%和66.7%，兩者聯(lián)合用藥時(shí)則顯著降低至16.7%。兩藥聯(lián)合應(yīng)用可協(xié)同抑制ERK磷酸化，從而下調(diào)MMP-9的表達(dá)。結(jié)論NC聯(lián)合索拉非尼可通過(guò)協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制MMP-9的表達(dá)而抑制肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

肝細(xì)胞癌（HCC）； 姜黃素納米粒（NC）； 索拉非尼； 基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）

姜黃素是提取自姜科姜黃屬植物姜黃根莖的一種酚化合物，具有抗炎、抗風(fēng)濕和治療肝、膽疾病等作用[1]。然而，姜黃素親水性及親脂性差，生物利用率低，極大限制了其臨床應(yīng)用[2]。相關(guān)研究證明姜黃素納米粒（NanoCurcTM，NC）可顯著提高姜黃素溶解度和生物利用率，減少用藥劑量，并抑制肝腫瘤生長(zhǎng)[3-4]。索拉非尼被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療不能手術(shù)切除和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移肝癌的靶向藥物，但其價(jià)格昂貴、不良反應(yīng)大，并且仍有約50%的晚期肝癌對(duì)其不敏感[5]。通過(guò)與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用，可降低索拉非尼的劑量，減少不良反應(yīng)，增強(qiáng)藥物療效。而NC與索拉非尼聯(lián)用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在觀察NC單藥或聯(lián)合索拉非尼對(duì)人肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的抗腫瘤作用，并探討其作用機(jī)制。

材料和方法

藥物姜黃素納米粒（NanoCurcTM）由美國(guó)霍普金斯大學(xué)提供。索拉非尼購(gòu)自德國(guó)拜耳公司，溶解于100%DMSO保存，體外實(shí)驗(yàn)中DMSO終濃度小于0.1%。

細(xì)胞培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株MHCCLM3由復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所建立，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將消化好的細(xì)胞按照3 000/孔接種于96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁后加藥處理。分別予不同濃度NC（10、20、40、60、80μmol/L）作用于肝癌MHCCLM3細(xì)胞。培養(yǎng)不同時(shí)間后（24，48，72 h）每孔加入CCK8（杭州碧云天公司），孵育2 h。570 nm酶標(biāo)儀（Model 680，美國(guó)Bio-Rad公司）測(cè)吸光度（D）值。分對(duì)照（DMSO）組、NC（40μmol/L）組、索拉非尼（10μmol/L）組及NC（40μmol/L）+索拉非尼組（10μmol/L），加藥后培養(yǎng)48 h，按照上述方法檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)按照試劑盒說(shuō)明書操作，將MHCCLM3細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，按上述方法分4組。經(jīng)48 h處理后胰酶消化收集細(xì)胞，經(jīng)400×g離心5 min并用Annexin-VFITC/PI試劑盒（美國(guó)BD公司）染色。避光孵育15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞以1×105/孔接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)；待細(xì)胞80%～90%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗1次，用滅菌的1μL Tip頭在皿底劃一直線，PBS漂洗2次。按上述分組方法處理細(xì)胞，并分別在0、24、48 h于倒置顯微鏡下拍攝。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)MHCCLM3細(xì)胞用Matrigel（美國(guó)BD公司）按1∶7稀釋后，取75μL包被Transwell上室，置于37℃ 下4 h。細(xì)胞用胰酶消化、400×g離心5 min，加DMEM培養(yǎng)基制成含2×104個(gè)單細(xì)胞懸液500μL，加入Transwell上室中，并按上述分組方法加入存物。下室中加入含10%血清培養(yǎng)液。放入37℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h后固定，Giemsa染色，于倒置顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野計(jì)數(shù)染色細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。侵襲率（%）=用藥孔穿膜細(xì)胞數(shù)/對(duì)照孔穿膜細(xì)胞數(shù)×100%。

人肝癌裸鼠原位模型及分組采用人肝癌細(xì)胞株MHCCLM3建立裸鼠原位肝癌模型[6]，將小鼠（上海斯萊克公司）隨機(jī)分為NC組（NC每日1.56 g/kg）、索拉非尼組（索拉非尼每日30 mg/kg）、聯(lián)合用藥組（每日NC 1.56 g/kg+索拉非尼30 mg/kg）和對(duì)照組（PBS），每組6只。裸鼠于腫瘤接種后第7天開(kāi)始用藥，治療持續(xù)4周。于種植后第5周末處死，切除肝臟腫瘤及肺臟，以10%甲醛固定。（1）計(jì)算腫瘤體積，V=AB2/2（A、B分別為腫瘤的最大和最小直徑）。（2）連續(xù)切取30張肺組織切片做組織學(xué)檢查，顯微鏡下觀察，計(jì)算肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目及肺轉(zhuǎn)移率。

實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）細(xì)胞或組織抽提總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄以及擴(kuò)增試劑盒（日本Takara公司）說(shuō)明書要求進(jìn)行反應(yīng)。MMP-9上 游 引 物：5＇-GCCAACTACGACACCGACGAC-3＇；下 游 引 物：5＇-TTGGCCTTGGAAGATGAATGGA-3＇。GAPDH 上游引物：5＇-GGCATCCTGGGCTACACTGA-3＇；下 游 引 物：5＇-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3＇。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。ΔCt=目的基因ct值-GAPDH Ct值，ΔΔCt=用藥組ΔCt的均數(shù)-對(duì)照組ΔCt的均數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）1×105/孔細(xì)胞接種于6孔板上，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞80%～90%融合時(shí)，按照上述分組處理。48 h后收集上清液，采用ELISA試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）檢測(cè)MMP-9蛋白含量，實(shí)驗(yàn)步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

蛋白質(zhì)印跡法（Western hlot）采用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）檢測(cè)標(biāo)本組織抽提液中總蛋白的濃度，操作步驟參照說(shuō)明書。NF-κB（p65）（#3034），p44/42 MAPK （Erk1/2）（#9102），TIMP1（D10E6）Rabbit mAb（#8946）購(gòu)自美國(guó)CST公司；Anti-ERK1/ERK2抗體（#ab17942），MMP-9（#AB911）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Actin抗體（H-196）（#sc-7210），兔IgG-HRP（#sc-2749），鼠IgG-HRP（#sc-2748）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；RapidStepTMECL Reagent Millipore試劑（#345818）購(gòu)自德國(guó)Millipore公司。

統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用±s表示。組間比較用ANOVA方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

NC單藥或聯(lián)合索拉非尼對(duì)MHCCLM3細(xì)胞增殖能力的影響MHCCLM3細(xì)胞與NC有著劑量-時(shí)間依賴的關(guān)系，細(xì)胞存活率會(huì)隨著劑量的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯降低。作用24、48、72 h后NC的IC50值分別是40、35、33μmol/L （圖1A）。聯(lián)合用藥組細(xì)胞存活率最低，但與NC（P=0.910）或索拉非尼（P=0.415）單藥組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1B）。

圖1 NC單藥或聯(lián)合索拉非尼抑制MHCCLM3細(xì)胞增殖能力和侵襲能力（×200）Fig 1 NC alone and in comhination with sorafenih inhihited MHCCLM3 cell proliferation and invasion（×200）A and B：Viability of MHCCLM3；C and D：MHCCLM3 transwell figure and data.（1）vs.Control，P＜0.01；（2）vs.NC，P＜0.05；（3）vs.So，P＜0.05.

NC單藥或聯(lián)合索拉非尼對(duì)MHCCLM3細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響體外劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，用藥組均使細(xì)胞遷移能力明顯減弱。當(dāng)聯(lián)合用藥時(shí)，細(xì)胞遷移能力弱于單藥組。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NC單獨(dú)應(yīng)用對(duì)侵襲有明顯的抑制作用（P＜0.01），與索拉非尼單藥相似（P＜0.01）；但聯(lián)合用藥組對(duì)細(xì)胞侵襲抑制作用強(qiáng)于單用NC或索拉非尼組（P＜0.05，圖1C、D）。

NC單藥或聯(lián)合索拉非尼對(duì)MHCCLM3細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡的結(jié)果見(jiàn)圖2A。3個(gè)用藥組與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.01）。對(duì)照組的 MHCCLM3細(xì)胞凋亡率為9.36%±0.12%，NC單藥組為17.40%±0.18%，索拉非尼單藥組為15.39%±0.14%，兩藥聯(lián)合組為22.85%±0.25%。聯(lián)合組與NC單藥組或索拉非尼單藥組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有明顯的協(xié)同作用（圖2B）。

圖2 NC單藥或聯(lián)合索拉非尼誘導(dǎo)MHCCLM3細(xì)胞凋亡Fig 2 NC alone and in comhination with sorafenih induced MHCCLM3 cell apoptosisA：Flow cytometry of MHCCLM3；B：Apoptosis results of MHCCLM3.（1）vs.Control，P＜0.01；（2）vs.NC，P＜0.01；（3）vs.So，P＜0.01.

NC單藥或聯(lián)合索拉非尼對(duì)裸鼠腫瘤的抑制作用NC組腫瘤大小為（0.75±0.14）cm3（P＜0.05），索拉非尼組為（0.50±0.11）cm3（P＜0.01），聯(lián)合組為（0.45±0.09）cm3（P＜0.01），均顯著低于對(duì)照組（1.26±0.13）cm3（圖3）；NC或索拉非尼單藥組肺轉(zhuǎn)移率分別為50.0%和66.7%，對(duì)腫瘤肺轉(zhuǎn)移抑制作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.182，P=0.455）。聯(lián)合用藥在未明顯增加藥物不良反應(yīng)的基礎(chǔ)上，肺轉(zhuǎn)移率為16.7%，對(duì)肺轉(zhuǎn)移具有顯著的抑制作用（P=0.015，表1）。

圖3 NC單藥或聯(lián)合索拉非尼抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)及肺轉(zhuǎn)移率Fig 3 NC alone and in comhination with sorafenih inhihited tumor volume and incidence of lung metastasisvs.Control，（1）P＜0.05，（2）P＜0.01；（3）vs.NC，P＜0.05.

表1 裸鼠肝癌原位移植模型結(jié)果Tah 1 Summary of orthotopic xenograft liver tumor moddel in nude mice

NC單藥或聯(lián)合索拉非尼對(duì)肝細(xì)胞癌MMP-9和p-ERK表達(dá)的影響ELISA和Western blot結(jié)果顯示，在肝癌細(xì)胞及小鼠肝癌組織中，MMP-9和p-ERK在對(duì)照組中的表達(dá)量最高，其在NC單藥和索拉非尼單藥組的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下調(diào)，聯(lián)合用藥組的表達(dá)量最低；而MMP-9抑制劑TIMP-1的表達(dá)則正好相反，在對(duì)照組中的表達(dá)量最低，在兩藥聯(lián)合組中表達(dá)量最高（圖4B、D、E）。各組ERK未見(jiàn)明顯變化。在m RNA水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果一致，在用藥組與對(duì)照組及聯(lián)合用藥組與單藥組間，MMP-9 mRNA表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖4A）；然而，在體內(nèi)試驗(yàn)中，聯(lián)合用藥組與單藥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4C）。

圖4 NC單藥或聯(lián)合索拉非尼抑制MMP-9和p-ERK在體內(nèi)、外的表達(dá)Fig 4 NC alone and in comhination with sorafenih decreased MMP-9 and p-ERK expressionin vitroandin vivoA：MMP-9 mRNA of MHCCLM3in vitro；B：MMP-9 ELISA resultsin vitro；C：MMP-9 mRNA in liver tumor model；D：MMP-9 ELISA results in tumor model；E：Western blot resultsin vitroandin vivo.A：（1）vs.Control，（2）vs.NC，（3）vs.So，P＜0.05；B and D：（1）vs.Control，P＜0.05，（2）vs.Control，P＜0.01，（3）vs.NC+So，P＜0.01，（4）vs.NC，P＜0.05；C：（1）vs.Control，P＜0.05.

討 論

近幾年，腫瘤治療雖然取得長(zhǎng)足進(jìn)步，諸如手術(shù)、介入及肝移植等方法的采用，但肝癌總體5年生存率仍僅為15%[7-8]。化學(xué)治療因其自身優(yōu)點(diǎn)受到越來(lái)越多的重視，因此對(duì)抗腫瘤效果好且不良反應(yīng)小的藥物的需求不斷增加。目前，研究人員將注意力集中在天然藥物上。天然產(chǎn)物已經(jīng)成為抗癌藥物的重要來(lái)源，約70%抗癌藥物提取自天然產(chǎn)物[9]。

NC克服了姜黃素水溶性差的缺點(diǎn)，增強(qiáng)了其治療效果，并可改善四氯化碳引起的肝損傷和肝硬化[10]。本研究結(jié)果顯示，小劑量NC能夠顯著抑制MHCCLM3細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。這一結(jié)果與高劑量姜黃素對(duì)肝癌細(xì)胞HEP3B，SK-Hep-1和SNU449抑制能力相似[11]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用可產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用，我們推測(cè)NC可與其他經(jīng)典肝癌治療藥物聯(lián)合應(yīng)用。因此，本研究選擇索拉非尼與NC聯(lián)合應(yīng)用。結(jié)果顯示，相比單藥，NC與索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用能更好地抑制MHCCLM3細(xì)胞的體外侵襲能力。在裸鼠原位肝癌模型中，我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥可協(xié)同抑制腫瘤生長(zhǎng)。由于肝癌肺轉(zhuǎn)移占肝外轉(zhuǎn)移的50%以上，我們重點(diǎn)檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)肝癌肺轉(zhuǎn)移的作用[12-13]。結(jié)果顯示，肺轉(zhuǎn)移率顯著降至16.7%。

為探討兩種藥物協(xié)同抗肝細(xì)胞癌的作用機(jī)制，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示NC和索拉非尼聯(lián)合使用時(shí)，細(xì)胞凋亡比單獨(dú)使用NC或索拉非尼時(shí)更顯著。腫瘤細(xì)胞分泌的MMP-9是最為主要的基質(zhì)金屬蛋白酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[14-15]。體內(nèi)、體外試驗(yàn)結(jié)果表明，聯(lián)合用藥可通過(guò)下調(diào)ERK1/2磷酸化水平，下調(diào)MMP-9表達(dá)，最終達(dá)到協(xié)同增強(qiáng)抗腫瘤效果的作用。此外，聯(lián)合用藥克服了單一藥物治療療效不足的缺點(diǎn)。近期，Liang等[16]報(bào)道EF24（與姜黃素分子結(jié)果類似）可逆轉(zhuǎn)索拉非尼耐藥。這一發(fā)現(xiàn)提示，NC與索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用可有效治療肝細(xì)胞癌，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

[1] Singh S.From exotic spice to modern drug？ [J].Cell，2007，130（5）：765-768.

[2] Sharma RA，Mc Lelland HR，Hill KA，et al.Pharmacodynamic and pharmacokinetic study of oral curcuma extract in patients with colorectal cancer[J].Clin Cancer Res，2001，7（7）：1894-1900.

[3] Bisht S，F(xiàn)eldmann G，Soni S，et al.Polymeric nanoparticleencapsulated curcumin（“nanocurcumin”）：a novel strategy for human cancer therapy[J].J Nanobiotechnology，2007，5：3.

[4] Ghosh D，Choudhury ST，Ghosh S，et al.Nanocapsulated curcumin：oral chemopreventive formulation against diethylnitrosamine induced hepatocellular carcinoma in rat[J].Chem Biol Interact，2012，195（3）：206-214.

[5] Cheng AL，Kang YK，Chen Z，et al.Efficacy and safety of sorafenib in patients in the Asia-Pacific region with advanced hepatocellular carcinoma：a phase Ⅲrandomised，double-blind，placebo-controlled trial[J].Lancet Oncol，2009，10（1）：25-34.

[6] 李濤，薛瓊，周健煒，等.綠膿桿菌制劑抑制肝細(xì)胞肝癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華肝膽外科雜志，2009，15（11）：848-850.

[7] Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin，2012，62（1）：10-29.

[8] Rahbari NN， Mehrabi A， Mollberg NM，et al.Hepatocellular carcinoma：current management and perspectives for the future[J].Ann Surg，2011，253（3）：453-469.

[9] Newman DJ，Cragg GM，Holbeck S，et al.Natural products and derivatives as leads to cell cycle pathway targets in cancer chemotherapy[J].Curr Cancer Drug Targets，2002，2（4），279-308.

[10] Bisht S，Khan MA，Bekhit M，et al.A polymeric nanoparticle formulation of curcumin （NanoCurcTM）ameliorates CCl4-induced hepatic injury and fibrosis through reduction of pro-inflammatory cytokines and stellate cell activation[J].Lab Invest，2011，91（9）：1383-1395.

[11] Ning L，Wentworth L，Chen H，et al.Down-regulation of Notch1 signaling inhibits tumor growth in human hepatocellular carcinoma[J].Am J Transl Res，2009，1（4）：358-366.

[12] Ikai I，Itai Y，Okita K，et al.Report of the 15th follow-up survey of primary liver cancer[J].Hepatol Res，2004，28（1）：21-29.

[13] Natsuizaka M，Omura T，Akaike T，et al.Clinical features of hepatocellular carcinoma with extrahepatic metastases[J].J Gastroenterol Hepatol，2005，20（11）：1781-1787.

[14] Littlepage LE，Sternlicht MD，Rougier N，et al.Matrix metalloproteinases contribute distinct roles in neuroendocrine prostate carcino-genesis，metastasis，and angiogenesis progression[J].Cancer Res，2010，70（6）：2224-2234.

[15] Yang P，Yuan W，He J，et al.Overexpression of Eph A2，MMP-9，and MVD-CD34 in hepatocellular carcinoma：Implications for tumor progression and prognosis[J].Hepatol Res，2009，39（12）：1169-1177.

[16] Liang Y，Zheng T，Song R，et al.Hypoxia-mediated sorafenib resistance can be overcome by EF24 through Von Hippel-Lindau tumor suppressor-dependent HIF-1α inhibition in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology，2013，57（5）：1847-1857.

Synergistic antitumor effects of polymeric nanoparticle formulation of curcumin（NanoCurcTM）comhined with sorafenih in human hepatocellular carcinoma（HCC）

HU Bo，SUN Chao，SUN Ding，SUN Yun-fan，XU Yang△
（Liver Cancer Institute，Zhongshan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai200032，China）

hepatocellular carcinoma （HCC）； NanoCurcTM（NC）； sorafenib； matrix metalloproteinase-9（MMP-9）

R 735.7

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.02.001

2013-12-12；編輯：張秀峰）

國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2013ZX10002011-004）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81372317，81071661）；上海浦江人才計(jì)劃（13PJD007）

△Corresponding author E-mail：drxuyang@gmail.com

【Ahstract】 OhJectiveTo investigate the effect of polymeric nanoparticle formulation of curcumin（NanoCurcTM，NC）alone and in combination with sorafenib usingin vitroandin vivomodels of human hepatocellular carcinoma（HCC）.MethodsThe activity of NCalone and in combination with sorafenib on HCC cell lines（MHCCLM3）was determined by CCK8，wound-healing and modified Boyden chamber assays.Apoptosis of cells was detected by flow cytometry.Primary HCC tumor growth and metastasis were examinedin vivousing orthotopic HCC xenografts in nude mice.RT-PCR，Western blot and ELISA were used to determine the expressions of matrix metalloproteinase-9 （MMP-9），tissue inhibitor of metalloproteinase-1（TIMP-1），extracellular sinal-regulated kinase 1/2（ERK1/2）and phosphorylated ERK 1/2（p-ERK1/2）.ResultsNC combined with sorafenib significantly inhibited the proliferation and invasion of MHCCLM3 cellsin vitro（P＜0.01），also drastically suppressed primary tumor growth and lung metastasesin vivo（P＜0.01）.Lung metastatic rate was 50.0%and 66.7%when NC and sorafenib wasused alone separately，and descended to 16.7%when NC and sorafenib were combined.NC combined with sorafenib could synergistically down-regulate the expression of MMP-9 via inhibiting p-ERK1/2 expression.ConclusionsCombination of NC and sorafenib showed synergistic inhibition effects on tumor growth and metastases by inducing cell apoptosis and inhibiting the expression of MMP-9.

*This work was supported hy the National Key Sci-Tech ProJect（2013ZX10002011-004），National Natural Science Foundation of China（81372317 and 81071661），and PuJiang Scholars Fund of Shanghai（13PJD007）.