麥冬酒制前后對內(nèi)皮細(xì)胞缺氧保護(hù)作用的比較研究

焦艷 李喆 劉清新 于永軍

·論著·

麥冬酒制前后對內(nèi)皮細(xì)胞缺氧保護(hù)作用的比較研究

焦艷 李喆 劉清新 于永軍

目的研究中藥麥冬及其酒制炮制品對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(EAHY926) 缺氧損傷的保護(hù)作用。方法體外培養(yǎng)EAHY926，采用通入缺氧氣體建立缺氧損傷模型。用麥冬提取液干預(yù)后，采用MTT比色法測定細(xì)胞活力、黃嘌呤氧化酶法測定細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶活性、硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛含量、硝酸還原酶法測定一氧化氮含量。結(jié)果組間比較采用單因素方差分析，兩兩之間用SNK檢驗(yàn)。與模型組相比，川麥冬生品提取液組、酒制川麥冬提取液組、杭麥冬生品提取液組、酒制杭麥冬提取液組均能顯著提高細(xì)胞活力(P<0.05)，并且均顯著提高缺氧后細(xì)胞超氧化物歧化酶活性(P<0.05)及降低丙二醛、一氧化氮的含量(P<0.05)；酒制川麥冬提取液組和酒制杭麥冬提取液組效果最佳，與空白對照組比有非常顯著性差異(P<0.01)。結(jié)論麥冬酒制后更能顯著拮抗缺氧對EAHY926的損傷。

麥冬； 酒制； 內(nèi)皮細(xì)胞； 缺氧保護(hù)

麥冬為常用中藥，《中華人民共和國藥典》2010版(一部)收載其來源為百合科植物麥冬Ophiopogonjaponicus(L.f)Ker-Gawl.的干燥塊根。主產(chǎn)地為四川(川麥冬)和浙江(杭麥冬)。心腦血管病的發(fā)生、發(fā)展和變化與中醫(yī)血瘀證緊密相關(guān)[1]。血瘀證是臨床常見的一種中醫(yī)證型，其病理改變基礎(chǔ)與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷密切相關(guān)[2]。麥冬是常用滋陰中藥，能活血化瘀。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究，麥冬提取液對內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，對心腦缺血缺氧具有保護(hù)作用。常用酒制品入藥，但還未見麥冬炮制前后的作用比較。本研究從細(xì)胞層面，研究麥冬酒制后對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的抗缺氧活性的變化，為麥冬的開發(fā)研究提供理論依據(jù)，對其在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用也將有重要的意義。

1 材料

1.1 藥材

所用藥材生品川麥冬、杭麥冬購于滄州同仁堂藥店，經(jīng)過本校藥學(xué)系天然藥物教研室于永軍副教授鑒定為正品，其中酒制品麥冬為于永軍老師按麥冬：黃酒(1∶5)制備得到。

1.2 藥物提取

分別取川麥冬、杭麥冬及其它們的酒制炮制品，采用水提法進(jìn)行提取，加水量為藥材的3倍，提取時間為1.5小時，浸膏進(jìn)行低溫干燥，得到的粉末(過三號篩)約5.0 g，精密稱定，置50 ml容量瓶中，加70%D-Hank’s試液至刻度，冷浸24小時，期間振搖數(shù)次，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得樣品溶液。

1.3 主要試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO，USA)(每升含10%小牛血清、L-谷氨酰胺0.33 mg、青霉素100 U、鏈霉素100 U、pH 7.4)；胰蛋白酶(MERCK,USA)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar，Denmark)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(NAPCO，USA)；一氧化氮(NO)測試盒(批號20121102)，丙二醛(molondialdehtde,MDA)試劑盒(批號20121218)，超氧物歧化酶(superoxide dismutuse,SOD)試劑盒(批號20121122)，均購自南京建成生物工程研究所。四氮唑藍(lán)(MTT)購自美國Sigma公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(EAHY926)株(購自天津后勤學(xué)院)接種于無菌培養(yǎng)瓶中，加入適量高糖達(dá)爾伯克(氏)必需基本培養(yǎng)基(H-DMEM)培養(yǎng)液(含10%的小牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml)，于5% CO2、37℃ 飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～5天傳代1次。傳代時用0.25%胰酶消化，用培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液，接種傳代。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

(1)正常對照組：細(xì)胞在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)；(2)缺氧模型組：細(xì)胞在通入缺氧氣體30分鐘后缺氧2小時；(3)川麥冬生品提取液組；(4)酒制川麥冬提取液組；(5)杭麥冬生品提取液組；(6)酒制杭麥冬提取液組。每組均設(shè)復(fù)孔6個。

1.6 培養(yǎng)方法

將生長良好的內(nèi)皮細(xì)胞EAHY926用0.25%胰酶消化后，輕輕吹打，以含10%的小牛血清H-DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml，取4 ml分別接種于各培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞貼壁，呈單層融合后(約12小時)，棄去上清液，更換為無血清H-DMEM培養(yǎng)液4 ml，饑餓細(xì)胞。棄去原培養(yǎng)液，其他各組均更換為無血清H-DMEM培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞。12小時后各中藥組分別加入中藥提取液，空白組與模型組以無血清H-DMEM培養(yǎng)液補(bǔ)足。

1.7 觀察項(xiàng)目

1.7.1 MTT比色法檢測細(xì)胞生長活力 將生長良好的EAHY926用0.25%胰酶消化后，輕輕吹打，以含10%的小牛血清H-DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×104/ml，以每孔1000～10000個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200 μl。放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時，使細(xì)胞貼壁呈單層融合。棄去上清液，更換為無血清H-DMEM饑餓細(xì)胞12小時。棄去上清液，除空白組，其余各組通入N2：CO2=95：5的缺氧氣體30分鐘進(jìn)行造模。恒溫箱缺氧培養(yǎng)2小時后取出，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，4小時后吸棄上清液，每孔加入二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)200 μl溶解結(jié)晶物，振蕩10分鐘后在酶標(biāo)儀490 nm處測定各孔的吸光度值(OD值)。

1.7.2 NO、MDA含量和SOD活性的測定 缺氧處理后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次。加入300 μl細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 分鐘 后，高速冷凍離心機(jī)離心10分鐘，取100 μl細(xì)胞上清液按試劑盒說明書操作，用硫代巴比妥酸顯色法、硝酸還原酶法和黃嘌呤氧化酶法分別測定細(xì)胞MDA、NO含量和SOD活性。

表1 麥冬液各組對缺氧損傷的MDA、NO 含量、SOD 活性及細(xì)胞活力的影響

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 對細(xì)胞活力的影響

缺氧后，使用MTT檢測，模型組吸光度值低于空白組(P<0.05)；與模型組相比，川麥冬生品提取液組、酒制川麥冬提取液組、杭麥冬生品提取液組、酒制杭麥冬提取液組吸光度值均大于模型組(P<0.05)，均能顯著提高細(xì)胞活力，酒制川麥冬提取液組和酒制杭麥冬提取液組效果最佳(見表1)。

2.2 對MDA、NO含量、SOD活性的影響

缺氧后，模型組MDA 和NO 含量較空白組均顯著性升高(P<0.05) ，SOD 活性較空白組顯著性降低(P<0.05)。各組提取液干預(yù)后，麥冬提取液各組均能顯著提高SOD 活性(P<0.05)；酒制川麥冬提取液組、酒制杭麥冬提取液組能顯著降低MDA和NO含量(P<0.01) (見表1)。

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁組織和血液間的通透性屏障，許多因素都可損傷內(nèi)皮細(xì)胞，造成內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙，由此而導(dǎo)致血栓形成、動脈粥樣硬化、高血壓等心腦血管疾病的發(fā)生。內(nèi)皮細(xì)胞損傷是血管損傷的初始階段，因此保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能是預(yù)防血管性疾病發(fā)生的關(guān)鍵[3]。

中藥麥冬味甘，微苦、性微寒，歸心、肺、胃經(jīng)，具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心的功效。植物化學(xué)成分研究表明，麥冬中含有甾體皂苷、高異黃酮、多糖等多種化學(xué)成分，具有抗心肌缺血、抗缺氧、增加免疫活性、降低血糖、平喘和抗過敏等藥理作用[4]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究，麥冬及其提取物的藥理作用主要表現(xiàn)為對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，減少內(nèi)毒素對其誘導(dǎo)的凋亡作用[5]，其有效部位，可對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷進(jìn)行保護(hù)[6]。

麥冬酒制的目的主要是有利于有效成分如甾體皂苷、黃酮、糖、甾醇、微量元素和氨基酸等成分的煎出，適合不同的治療作用。麥冬炮制方法對上述藥理作用和化學(xué)成分有直接的影響[7]。

經(jīng)本實(shí)驗(yàn)研究表明，麥冬的水溶性提取液具有保護(hù)缺氧所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用，能有效增加心肌營養(yǎng)血流量[8]，且麥冬酒制后效果更佳，入藥時可優(yōu)先選用酒制麥冬。本研究為麥冬的藥理活性研究提供了實(shí)驗(yàn)方向和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對臨床治療心腦血管疾病具有重要的指導(dǎo)意義。

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(本文編輯： 蒲曉田)

ComparativestudyofprotectiveeffectofRadixOphiopogonisprocessedProtectiveeffectofRadixOphiopogonisonhypoxiabeforeandafterbeingprocessedbywine-acomparativestudy

JIAOYan，LIZhe，LIUQing-xin，etal.

CangzhouMedicalCollegeofPharmacy，Cangzhou061001，China

JIAOYan,E-mail:jykycg@163.com

ObjectiveTo study the Chinese medicine Radix Ophiopogonis and the protective role of its wine-processed products on hypoxia of human umbilical vein endothelial cells (EAHY926).MethodsIn vitro culture of EAHY926 was performed, which was exposed to hypoxic gas to establish models with hypoic injury. After intervention by Radix extract, MTT colorimetry was used to determine cell viability, the xanthine oxidase method was adopted to detect the activity of superoxide dismutases (SOD) in cells, the thibabituric acid developing method was adopted to assay malondialdehyde (MDA) , and the nitrate reductase method was used to detect the content of nitric oxide (NO).ResultsData collected was treated with one-way ANOVA, SNK test to make pairwise comparison. Compared with the model group, Ophiopogon japonicus extract raw chemicals group, wine extract Ophiopogon group, Hang Radix Ophiopogonis extract raw chemicals group, wine Hangzhou Radix Ophiopogonis extract group could significantly improve cell viability (P<0.05), with respect to SOD activity during cell hypoxia (P<0.05) and decrease MDA and NO levels (P<0.05); wine extract Ophiopogon group and wine Hangzhou Radix Ophiopogonis extract group showed the sharpest increase among the groups , as exhibited significant difference compared with control group(P<0.01).ConclusionWine-processed Radix Ophiopogonis was significantly effective in antagonizing the damage on EAHY926 caused by hypoxia.

Radix Ophiopogonis; Wine-processed proudct; Endothelial cells; Hypoxia protection

滄州市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃(1213145ZD)

061001 河北省滄州市滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系

焦艷(1983-)，女，碩士，講師。研究方向：藥物分析與檢驗(yàn)技術(shù)。E-mail:jykycg@163.com

R284

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.02.009

2013-10-30)