“拔伸松動(dòng)手法”對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎兔白細(xì)胞介素1β和腫瘤壞死因子α的影響

王春林 向勇 田啟東 胡鸞 趙志勇 邵長(zhǎng)麗 董有康 趙永康 林云

·論著·

“拔伸松動(dòng)手法”對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎兔白細(xì)胞介素1β和腫瘤壞死因子α的影響

王春林 向勇 田啟東 胡鸞 趙志勇 邵長(zhǎng)麗 董有康 趙永康 林云

目的研究拔伸松動(dòng)手法對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎兔膝關(guān)節(jié)液中白細(xì)胞介素1β(interleukin 1 beta, IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)的影響。方法采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，即為拔伸松動(dòng)手法組、注射透明質(zhì)酸鈉組、模型組，正常組。拔伸松動(dòng)手法組手法治療，每天一次，治療十天后休息一天，共治療6周；注射透明質(zhì)酸鈉組注射治療，每周一次，共治療6周；模型組正常喂養(yǎng)、正常組給正常喂養(yǎng)。結(jié)果治療后各組關(guān)節(jié)液中IL-1β濃度平均數(shù)值為模型組>正常組>注射透明質(zhì)酸鈉組>拔伸松動(dòng)手法組；TNF-α濃度平均數(shù)值為模型組>拔伸松動(dòng)手法組>注射透明質(zhì)酸鈉組>正常組。用方差分析及LSD-t進(jìn)行兩兩比較分析顯示，拔伸松動(dòng)手法組、正常組、注射透明質(zhì)酸鈉組兩個(gè)指標(biāo)與模型組比較均為P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；拔伸松動(dòng)手法組、注射透明質(zhì)酸鈉組、正常組之間兩兩比較比較，兩個(gè)指標(biāo)均為P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論拔伸松動(dòng)手法和注射透明質(zhì)酸鈉，均能降低膝骨性關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α的濃度，但兩種方法之間不能認(rèn)為有差異。拔伸松動(dòng)手法可能通過降低膝骨性關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)液中的IL-1β、TNF-α濃度，從而抑制膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞，對(duì)軟骨損傷的修復(fù)有利。

拔伸松動(dòng)手法； 膝骨性關(guān)節(jié)炎； 白細(xì)胞介素1β； 腫瘤壞死因子α

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis, OA)的發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其發(fā)病與一氧化氮、骨內(nèi)高壓、氧自由基、炎癥介質(zhì)、關(guān)節(jié)載荷紊亂、自身免疫反應(yīng)等有關(guān)。近年來(lái)，細(xì)胞因子對(duì)OA的影響已引起廣泛關(guān)注，尤其是細(xì)胞因子中的白細(xì)胞介素(interleukin 1 beta, IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)，被認(rèn)為是骨關(guān)節(jié)炎病理過程中促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞的兩種最重要的細(xì)胞因子。本研究旨在研究拔伸松動(dòng)手法對(duì)以家兔下肢關(guān)節(jié)機(jī)械制動(dòng)造模方法[1]制作的兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)液中的IL-1β、TNF-α的影響，從細(xì)胞分子水平方面探索拔伸松動(dòng)手法治療兔膝骨性關(guān)節(jié)炎的機(jī)理，為該手法治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年白兔40只，體重1.8～2.5 kg，雌雄不限，重量分布均一。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，即拔伸松動(dòng)手法組、注射透明質(zhì)酸鈉組、模型組，正常組。4組經(jīng)治療和觀察6周后，拔伸松動(dòng)手法組與注射透明質(zhì)酸鈉組各有2只實(shí)驗(yàn)兔死亡，與隨機(jī)選取的模型組與正常組各8只實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2 治療方法

拔伸松動(dòng)手法組，以拔伸松動(dòng)手法治療兔右膝，專人操作，手法、操作步驟及時(shí)間固定。手法為按揉法、拔伸松動(dòng)法；取穴膝眼、血海、鶴頂、陽(yáng)陵泉、陰陵泉、足三里、委中，家兔的取穴方法按《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[2]嚴(yán)格取穴。先按揉以上所取諸穴，20秒/穴，再施以拔伸松動(dòng)手法：(1) 拔伸法施以患膝10秒后放松；(2) 徐徐拔伸患膝，在拔伸下分別以小魚際固定于膝關(guān)節(jié)下緣之內(nèi)側(cè)和外側(cè)，向?qū)?cè)推按5次(外側(cè)向內(nèi)側(cè)，內(nèi)側(cè)向外側(cè))；(3) 五指提拿髕骨10次，順時(shí)針和逆時(shí)針活動(dòng)髕骨5次，再上下左右推動(dòng)髕骨；(4) 屈伸患膝關(guān)節(jié)30次；(5) 拔伸患膝10秒，在拔伸過程中作膝關(guān)節(jié)小幅度內(nèi)旋和外旋運(yùn)動(dòng)。手法治療每天一次，治療十天后休息一天，共治療6周。

注射透明質(zhì)酸鈉組，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸鈉(山東正大福瑞達(dá)公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H10960136，產(chǎn)品批號(hào)：2012-01-09)。規(guī)格2 ml∶20 mg，按0.15 ml/kg，每周注射1次，共治療6周。

模型組，正常組僅給飼料，喂養(yǎng)6周。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)

測(cè)定膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α含量。采用IL-1β及TNF-α試劑盒。檢測(cè)按照IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒酶標(biāo)儀說(shuō)明書操作。膝關(guān)節(jié)液采集施行膝關(guān)節(jié)穿刺，證實(shí)刺入關(guān)節(jié)腔后，注入0.9%的生理鹽水0.5 ml，反復(fù)回抽、注入3次后，再盡量抽出腔內(nèi)液體?；厥樟?.4～0.6 ml，平均0.5 ml。采集的膝關(guān)節(jié)沖洗液按說(shuō)明采用雙抗體夾心(ELISA)法測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

4組白兔試驗(yàn)后膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α濃度數(shù)據(jù)詳見表1。

表1 白兔試驗(yàn)后膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α濃度

其中各組IL-1β濃度平均數(shù)值為模型組>正常組>注射透明質(zhì)酸鈉組>拔伸松動(dòng)手法組，統(tǒng)計(jì)學(xué)上通過方差分析，F(xiàn)=8.833，P=0.000，P<0.05，表明四組兔膝關(guān)節(jié)液中IL-1β濃度不全相等。用LSD-t進(jìn)行兩兩比較分析，得出正常組與模型組比較P=0.001，拔伸松動(dòng)手法組與模型組比較P=0.000，注射透明質(zhì)酸組與模型組比較P=0.001，表明拔伸松動(dòng)手法組、正常組、注射透明質(zhì)酸組與模型組差異皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。拔伸松動(dòng)手法組與正常組比較P=0.289，拔伸松動(dòng)手法組與注射透明質(zhì)酸組比較P=0.575，正常組與注射透明質(zhì)酸組比較P=0.668，表明這三組之間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

各組TNF-α濃度平均數(shù)值為模型組>拔伸松動(dòng)手法組>注射透明質(zhì)酸鈉組>正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)上通過方差分析，F(xiàn)=11.488，P=0.000，P<0.05，表明四組兔膝關(guān)節(jié)液中TNF-α濃度不全相等。用LSD-t進(jìn)行兩兩比較分析，得出正常組與模型組比較P=0.000，拔伸松動(dòng)手法組與模型組比較P=0.001，注射透明質(zhì)酸組與模型組比較P=0.000，表明拔伸松動(dòng)手法組、正常組、注射透明質(zhì)酸組與模型組差異皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。拔伸松動(dòng)手法組與正常組比較P=0.151，拔伸松動(dòng)手法組與注射透明質(zhì)酸組比較P=0.230，正常組與注射透明質(zhì)酸組比較P=0.891，表明這三組之間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

說(shuō)明通過拔伸松動(dòng)手法治療和注射透明質(zhì)酸鈉治療，都能降低膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液中的IL-1β、TNF-α濃度，且兩組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明拔伸松動(dòng)手法也是一種治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的有效治療手段。

3 討論

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是由于關(guān)節(jié)滑膜退變，軟骨破壞引起的以膝關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和活動(dòng)受限為特征的慢性骨關(guān)節(jié)病，其中關(guān)節(jié)軟骨退變是OA發(fā)病的最直接原因，研究表明膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病主要與生物力學(xué)因素、生物化學(xué)因素、遺傳因素、炎癥性因素等有關(guān)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α是參與骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程的重要介質(zhì)，是炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)劑，是調(diào)節(jié)炎癥的始動(dòng)因素，是骨關(guān)節(jié)炎病理過程中促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞的兩種最重要的細(xì)胞因子[3-4]。Hung等[5]將重組人IL-1β注入兔膝關(guān)節(jié)，發(fā)現(xiàn)滑膜內(nèi)有大量白細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞增生，滑膜肥厚，并有關(guān)節(jié)軟骨蛋白多糖合成下降。TNF-α在關(guān)節(jié)炎(包括OA)的發(fā)生過程中對(duì)關(guān)節(jié)軟骨起著重要的破壞作用。TNF-α和IL-1的生物學(xué)作用相似，但其生物學(xué)活性比IL-1約低100倍，在OA的發(fā)病中與IL-lβ起著協(xié)同作用，動(dòng)物模型研究也表明關(guān)節(jié)軟骨的破壞主要是由IL-1β激發(fā)的，并且在早期和TNF-α是密切相關(guān)的[6-7]。

中醫(yī)藥治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其中推拿手法治療本病的研究已取得可喜的進(jìn)展。近年來(lái)的研究證實(shí)：手法的作用和關(guān)節(jié)被動(dòng)運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)滑液向關(guān)節(jié)軟骨的浸透和擴(kuò)散，改善組織的營(yíng)養(yǎng)代謝，有助于改善關(guān)節(jié)周圍的血液循環(huán)，降低骨內(nèi)壓，促進(jìn)關(guān)節(jié)周圍組織的自身修復(fù)，改善關(guān)節(jié)軟骨的營(yíng)養(yǎng)和關(guān)節(jié)的潤(rùn)滑, 并能減輕軟骨的退變，還可增加股四頭肌之肌力，改善關(guān)節(jié)的活動(dòng)度[8-9]。拔伸松動(dòng)法為云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院推拿科治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的經(jīng)驗(yàn)手法，該手法將理筋手法與關(guān)節(jié)松動(dòng)手法有機(jī)結(jié)合，包括拔伸下側(cè)向推按法、髕骨松動(dòng)法、拔伸下微旋法和屈伸法四步，臨床研究中發(fā)現(xiàn)：該手法能明顯改善膝骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)活動(dòng)度，緩解疼痛[10]。課題組在前期的實(shí)驗(yàn)研究中亦發(fā)現(xiàn)，拔伸松動(dòng)法能明顯改善兔膝骨性關(guān)節(jié)模型的關(guān)節(jié)活動(dòng)度，修復(fù)退變的軟骨組織[11]。

本課題將關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸鈉設(shè)為對(duì)照組，研究結(jié)果表明：治療后拔伸松動(dòng)手法組關(guān)節(jié)液中的IL-1β、TNF-α濃度與正常兔膝關(guān)節(jié)液中的濃度無(wú)顯著差異，較模型組中兔膝關(guān)節(jié)液中的濃度低；拔伸松動(dòng)手法組和注射透明質(zhì)酸鈉組，均能降低膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液中的IL-1β、TNF-α濃度，兩組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明拔伸松動(dòng)手法可能通過降低兔膝骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中的IL-1β、TNF-α濃度，達(dá)到抑制膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞的目的，對(duì)軟骨損傷的修復(fù)有利。

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(本文編輯：黃凡)

InfluenceonIL-1β,andTNF-αinthekneesofrabbitswithosteoarthritisbymassagemanipulationofstretch-pull-loose

WANGChun-lin,XIANGDong,TIANQi-dong,etal.

Thedepartmentofmassage,theFirstAffiliatedHospitalofYunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Kunming650021,China

WANGChun-lin,E-mail: 2478026881@qq.com

ObjectiveTo study the influence on interleukin 1 beta (IL-1β) tumor necrosis factor alpha (TNF-α) in the knees of rabbits with osteoarthritis by massage manipulation of stretch-pull-loose.MethodsRabbits are randomly divided into four groups-stretch-pull-loose manipulation group (SMG), the sodium hyaluronate injected group (SHG), the model group (MG) and the normal group (NG). Rabbits from SMG

the manipulation of stretch-pull-loose, once daily with a day of break every ten days, for 6 weeks. Rabbits from SHG received sodium hyaluronate injection, once weekly, for 6 weeks. Rabbits from MG and NG were given regular chow.ResultsAfter the intervention, the average level of IL-1β in joint fluid showed MG> NG > SHG> SMG; and the average level of IL-1β in joint fluid exhibited MG>SMG>SHG>NG. Pairwise comparison among each group was drawn with the method of variance analysis and LSD - t, which. shows the two parameters observed in SMG, SHG and MG were statistically different from those in NG (P<0.05)., Further, they were observed to be with no statistically significant differences among SMG, SHG and MG.ConclusionBoth stretch-pull-loose manipulation and sodium hyaluronate intervention serve to reduce the level of IL-1β and TNF-α in the knees of rabbits with osteoarthritis, while no difference can be observed between the two therapies.The mechanism of stretch-pull-loose manipulation’s effectiveness in repairing cartilage injuries in osteoarthritis, as is speculated, is by lowering the level of IL-1β and TNF-α in knees, which inhibit the degradation of cartilage and the destruction of bone matrix.

Stretch-pull-loose manipulation； Knee of rabbits with osteoarthritis； IL-1β； TNF-α

云南省自然科學(xué)基金(2009ZC152M)

650021 昆明，云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院推拿科(王春林、向勇、田啟東、胡鸞、趙志勇、董有康、趙永康)，檢驗(yàn)科(林云)；云南中醫(yī)學(xué)院針灸推拿康復(fù)學(xué)院推拿臨床教研室(邵長(zhǎng)麗)

王春林(1968- )，本科，教授，主任醫(yī)師。研究方向：脊柱推拿、膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的中醫(yī)藥治療。E-mail: 2478026881@qq.com

R244.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.02.002

2013-08-02)