固定化硫酸鹽還原菌選擇性去除U(Ⅵ)的性能

唐振平，周 帥，王文濤，謝水波,2,*，高媛媛，馬華龍

(1.南華大學(xué) 污染控制與資源化技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué) 鈾礦冶生物技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001)

研究表明，在H2或乳酸鹽等電子供體存在下，硫酸鹽還原菌(SRB)可通過(guò)酶促作用直接還原/沉淀U(Ⅵ)，阻止U(Ⅵ)的遷移和擴(kuò)散[5-8]。而要實(shí)現(xiàn)SRB生物還原/沉淀U(Ⅵ)的產(chǎn)業(yè)化，固定化技術(shù)的應(yīng)用極為關(guān)鍵[5-7]。現(xiàn)有的報(bào)道多集中于游離態(tài)SRB還原U(Ⅵ)途徑和環(huán)境因子影響的探討[9-10]，但關(guān)于固定化SRB應(yīng)用的研究較少；重金屬離子和含氧陰離子等共存物對(duì)U(Ⅵ)還原過(guò)程的影響已有報(bào)道[1,10]，但對(duì)有機(jī)物的影響缺乏系統(tǒng)研究；利用SRB去除污染物時(shí)多針對(duì)U(Ⅵ)[5,6-9]、Zn及Cu[11-15]等單一目標(biāo)，有機(jī)或無(wú)機(jī)體系下U(Ⅵ)/重金屬的選擇性去除尚未見(jiàn)報(bào)道。

本工作擬利用聚乙烯醇和海藻酸鈉制備硫酸鹽還原菌微球，探討Zn2+和Cu2+等重金屬離子，乙酸鈉、草酸鈉和檸檬酸鈉等有機(jī)物對(duì)其還原廢水中U(Ⅵ)的影響，并考察其選擇性去除U(Ⅵ)的技術(shù)參數(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要試劑與儀器

聚乙烯醇、海藻酸鈉，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；U3O8，分析純，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心(北京)，標(biāo)準(zhǔn)鈾溶液采用GBW04201方法配制。

T6型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AA-6300型原子吸收分光光度計(jì)，日本島津公司；TG16型高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙英泰儀器有限責(zé)任公司；PHS-3C型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；79-1型恒溫磁力攪拌器，江蘇教育玻塑廠；HZQ-C型空氣浴恒溫振蕩器，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 SRB的分離與培養(yǎng)

自南華大學(xué)某下水道取黑色污泥，按5 g∶1 L將污泥接種入Postgate B液體培養(yǎng)基，置于35 ℃振蕩培養(yǎng)箱中富集培養(yǎng)約1周。待液體培養(yǎng)基變黑且發(fā)出臭雞蛋味后，采用平皿壓層厭氧法對(duì)富集的SRB進(jìn)行分離，即將瓊脂濃度為2%的Postgate E固體培養(yǎng)基倒入已滅菌且編號(hào)的培養(yǎng)皿(90 mm×15 mm)中，分別按10-1、10-2、10-3和10-4稀釋度吸取0.1 mL SRB富集液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)約3 d后，挑取內(nèi)含黑色SRB菌落的瓊脂塊，采用Postgate C液體培養(yǎng)基對(duì)分離得到的SRB擴(kuò)大培養(yǎng)約3 d。3次分離培養(yǎng)后的SRB菌體經(jīng)離心(8 000 r/min，10 min)、沖洗(2.5 mg/L NaHCO3緩沖液，100 mL)后，置于盛有100 mL 2.5 mg/L NaHCO3緩沖液的150 mL血清瓶中，于4 ℃冰箱內(nèi)保存。最終SRB菌懸液濃度約為35 g/L(以菌體干重計(jì))。

1.3 固定化SRB微球的制備

將“聚乙烯醇-硫酸鈉-硼酸法”[16]進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)后用于制備固定化SRB微球。分別稱取8 g聚乙烯醇和0.5 g海藻酸鈉于100 mL燒杯中，再加入無(wú)菌水75 mL，加熱至其完全溶解，冷卻至35 ℃。加入25 mL上述SRB菌懸液，攪拌約30 min至其混勻。混合液中聚乙烯醇、海藻酸鈉和SRB最終濃度分別為8、0.5、0.875 g/mL。用注射器將此混合液滴入盛有200 mL的CaCl2(2 g/mL)和飽和硼酸(6 g/mL)溶液(交聯(lián)劑Ⅰ)的燒杯中，成球后用磁力攪拌器輕微攪動(dòng)1.5 h。之后，將過(guò)濾后的微球轉(zhuǎn)移至0.5 mol/L硫酸鈉溶液(交聯(lián)劑Ⅱ)中，再用磁力攪拌器輕微攪動(dòng)2.5 h，傾去硫酸鈉溶液，即得到成型的固定化SRB微球。最后，用無(wú)菌水沖洗微球2～3次，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。保持其他條件不變，不添加SRB菌懸液，采用以上方法制備空白微球。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

圖1 厭氧培養(yǎng)裝置

在150 mL血清瓶中分別加入100 mL上述培養(yǎng)液，用0.1 mol/L的NaOH和0.01 mol/L的HCl調(diào)pH值至6.0，于35 ℃下振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣分析。培養(yǎng)過(guò)程中不添加酵母浸膏、維生素C等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以限制SRB生長(zhǎng)，消除U(Ⅵ)還原的干擾因素[17]；充高純氮?dú)夂投趸蓟旌蠚?V(N2)∶V(CO2)=4∶1)控制厭氧條件。

1) 固定化SRB還原U(Ⅵ)的單因素實(shí)驗(yàn)

初始pH值影響實(shí)驗(yàn)：pH值設(shè)為2.0～6.0，設(shè)置梯度為1.0。

微球投加量影響實(shí)驗(yàn)：通過(guò)微球投加量控制菌體量(每g微球約含0.071 g SRB，以干菌計(jì))，微球投加量設(shè)為3～7 g，設(shè)置梯度為1 g。

2) 共存污染物對(duì)固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響實(shí)驗(yàn)

Zn2+和Cu2+濃度對(duì)U(Ⅵ)還原的影響實(shí)驗(yàn)：分別加入25、50、100、120、140、150 mg/L Zn2+或Cu2+，以無(wú)外加重金屬離子試樣液為空白對(duì)照。

有機(jī)物對(duì)U(Ⅵ)還原的影響實(shí)驗(yàn)：分別加入10 mmol/L乙酸鈉、草酸鈉以及檸檬酸鈉3種有機(jī)物，以無(wú)外加有機(jī)物作為空白對(duì)照。

3) 固定化SRB選擇性去除U(Ⅵ)實(shí)驗(yàn)

間接選擇性去除U(Ⅵ)實(shí)驗(yàn)：分別加入50 mg/L Zn2+、50 mg/L Cu2+及10 mmol/L檸檬酸鈉。

1.5 分析方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 固定化SRB還原U(Ⅵ)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1) 初始pH值對(duì)固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響

初始pH值對(duì)U(Ⅵ)去除率的影響示于圖2。由圖2可看出，初始pH值為2.0時(shí)，96 h內(nèi)U(Ⅵ)去除率始終低于20%；隨著初始pH值的升高，固定化SRB對(duì)U(Ⅵ)的還原能力增強(qiáng)，當(dāng)初始pH值從2.0升至6.0時(shí)，實(shí)驗(yàn)96 h后U(Ⅵ)去除率從17.65%上升到94.76%。當(dāng)初始pH值為3.0～6.0時(shí)，U(Ⅵ)的生物還原過(guò)程主要發(fā)生在前24 h內(nèi)。

圖2 初始pH值對(duì)U(Ⅵ)去除的影響

本課題組[1]曾探討了初始鈾濃度20 mg/L、溫度35 ℃條件下pH值對(duì)游離態(tài)SRB還原U(Ⅵ)的影響。結(jié)果表明，當(dāng)pH值為2.0或3.0時(shí)，6 d后U(Ⅵ)去除率均低于10%；當(dāng)pH=6.0時(shí)，6 d后血清瓶中U(Ⅵ)幾乎全部被還原?？梢?jiàn)，在近中性環(huán)境中，SRB固定前后還原U(Ⅵ)的能力均較強(qiáng)；SRB經(jīng)固定化后對(duì)低pH值的緩沖作用有所增強(qiáng)。這主要是由于大量SRB菌體被包裹在微球內(nèi)部，削弱了強(qiáng)酸性環(huán)境對(duì)其還原酶體系生物學(xué)活性的抑制作用，同時(shí)降低了H+和U(Ⅵ)對(duì)SRB細(xì)胞壁上有限負(fù)電性活性部位的競(jìng)爭(zhēng)，從而維持了其對(duì)U(Ⅵ)的還原能力[1]。為維持U(Ⅵ)的高效還原，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇pH值為6.0。

2) 微球投加量對(duì)固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響

微球投加量對(duì)固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖3，空白微球在24 h內(nèi)對(duì)U(Ⅵ)的去除情況示于圖4。分析圖3可知，pH值為6.0時(shí)，U(Ⅵ)的去除主要在于微生物的活動(dòng)，且發(fā)生在前24 h內(nèi)。這是由于初始階段電子供體充足，微生物代謝活動(dòng)旺盛，U(Ⅵ)還原率增大顯著；24 h后隨電子供體的消耗，U(Ⅵ)還原率的增大趨于平緩。當(dāng)微球投加量為6 g/L(相當(dāng)于菌體投加量0.42 g/L)時(shí)，48 h內(nèi)U(Ⅵ)還原率高達(dá)94.57%。超過(guò)該值，U(Ⅵ)還原效率隨微球投加量的增加變化不大。這說(shuō)明，對(duì)于U(Ⅵ)濃度為15 mg/L的溶液，6 g/L微球投加量已足夠。此外，由圖4可看出，空白微球?qū)(Ⅵ)也有一定的吸附作用，這可能與微球的多孔結(jié)構(gòu)有關(guān)[18]。

圖3 微球投加量對(duì)U(Ⅵ)去除的影響

圖4 空白微球投加量對(duì)U(Ⅵ)去除的影響

2.2 共存污染物對(duì)固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響

1) 重金屬離子對(duì)固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響

圖5、6分別為不同Zn2+和Cu2+濃度下，固定化SRB還原U(Ⅵ)的情況。從圖5、6可知，當(dāng)初始Zn2+或Cu2+濃度在25～120 mg/L范圍時(shí)，U(Ⅵ)還原動(dòng)力學(xué)曲線與空白對(duì)照組差異較小，在96 h后U(Ⅵ)去除率可達(dá)94%左右，說(shuō)明Zn2+或Cu2+濃度在0～120 mg/L范圍內(nèi)對(duì)U(Ⅵ)的還原影響很小。當(dāng)初始Zn2+或Cu2+濃度升高至140 mg/L時(shí)，U(Ⅵ)還原受到不同程度的抑制，而當(dāng)其達(dá)到150 mg/L時(shí)，U(Ⅵ)濃度在初期稍有下降，隨后保持穩(wěn)定，表明U(Ⅵ)還原受到完全抑制。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，96 h后開(kāi)啟初始Zn2+或Cu2+濃度分別為25、50、100、120 mg/L和空白組血清瓶，均有較濃的臭雞蛋味氣體產(chǎn)生，且部分微球變黑。而初始Zn2+或Cu2+濃度為150 mg/L時(shí)，血清瓶中并未出現(xiàn)這兩種現(xiàn)象。由此推斷，Zn2+或Cu2+對(duì)SRB的毒閥值約為150 mg/L。Azabou等[11]和Jalali等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Zn2+或Cu2+濃度高于150 mg/L時(shí)，對(duì)SRB具有致死作用，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

圖5 Zn2+濃度對(duì)U(Ⅵ)去除的影響

圖6 Cu2+濃度對(duì)U(Ⅵ)去除的影響

重金屬對(duì)SRB還原U(Ⅵ)的影響主要表現(xiàn)在其對(duì)SRB的毒害作用。Garcia等[14]研究表明，pH=7.0，Cu2+濃度為25、50、100 mg/L時(shí)，接種SRB 21 d后，Cu2+去除率高達(dá)99%，且產(chǎn)生黑色沉淀；當(dāng)Cu2+濃度增至200 mg/L時(shí)，細(xì)菌未見(jiàn)生長(zhǎng)。Kieu等[13]在探討半連續(xù)攪拌槽反應(yīng)器中SRB對(duì)重金屬離子的去除效果時(shí)也得到了類似結(jié)論。Utgikar等[15]則報(bào)道，Zn2+和Cu2+對(duì)SRB的毒閥值分別為12 mg/L和20 mg/L。本課題組[1]早期在研究Zn2+和Cu2+對(duì)U(Ⅵ)還原的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)，Zn2+和Cu2+抑制閥濃度分別為15 mg/L和25 mg/L。究其原因主要在于，重金屬對(duì)SRB的毒閥值和抑制程度受環(huán)境影響(如細(xì)胞周圍的物化環(huán)境、SRB種系組成及生物反應(yīng)器構(gòu)建情況等)較大[13]。此外，大量研究[16,18]表明，微生物經(jīng)包埋固定可有效緩沖重金屬離子的沖擊作用，這也可能是本實(shí)驗(yàn)中Zn2+和Cu2+濃度毒閥值偏高的原因之一。

2) 有機(jī)物對(duì)固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響

實(shí)驗(yàn)中，分別以乙酸鈉、草酸鈉和檸檬酸鈉為研究對(duì)象，考察其對(duì)固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖7。由圖7可看出，草酸鈉和檸檬酸鈉對(duì)U(Ⅵ)的還原存在不同程度的抑制作用，乙酸鈉的影響較小。24 h內(nèi)，與空白對(duì)照組相比，乙酸鈉使U(Ⅵ)去除率升高約3%，而草酸鈉和檸檬酸鈉分別使U(Ⅵ)去除率降低約61%、76%。

圖7 有機(jī)物對(duì)U(Ⅵ)去除的影響

Ganesh等[19]通過(guò)在有機(jī)物存在條件下降解硫代硫酸鹽的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，有機(jī)物對(duì)U(Ⅵ)還原過(guò)程的影響差異不在于有機(jī)物對(duì)SRB產(chǎn)生的不同毒性。此外，在考察有機(jī)物對(duì)脫硫弧菌還原U(Ⅵ)的影響時(shí)還發(fā)現(xiàn)，乙酸鈉、草酸鈉和檸檬酸鈉等有機(jī)物濃度均未顯著降低，進(jìn)而說(shuō)明U(Ⅵ)還原趨勢(shì)的差異也不在于SRB對(duì)有機(jī)物的選擇性降解。結(jié)合上述分析及表1可知，有機(jī)物對(duì)固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響差異主要在于有機(jī)配體的不同絡(luò)合能力(檸檬酸鈉>草酸鈉>乙酸鈉)。由于多齒配體有機(jī)物可與U(Ⅵ)絡(luò)合，限制了U(Ⅵ)的還原[20]。

2.3 固定化SRB選擇性去除U(Ⅵ)實(shí)驗(yàn)

SRB除通過(guò)酶促作用直接還原U(Ⅵ)外，還可利用代謝產(chǎn)物間接沉淀重金屬[13,21]，兩種機(jī)制示于圖8。由于這兩種機(jī)制是互斥的，適當(dāng)優(yōu)化處理?xiàng)l件有可能實(shí)現(xiàn)鈾的選擇性沉淀，這對(duì)于修復(fù)鈾污染和回收鈾資源具有現(xiàn)實(shí)意義。

a——乳酸氧化過(guò)程；b——SRB通過(guò)酶促作用直接去除U(Ⅵ)的過(guò)程；c、d——SRB利用代謝產(chǎn)物沉淀去除重金屬的過(guò)程

1) 固定化SRB直接選擇性去除U(Ⅵ)實(shí)驗(yàn)

圖9 固定化SRB直接選擇性去除U(Ⅵ)

表1 有機(jī)配體類型及絡(luò)合特性[19]

2) 固定化SRB間接選擇性去除U(Ⅵ)實(shí)驗(yàn)

圖10 固定化SRB間接選擇性去除U(Ⅵ)

在檸檬酸鈉存在情況下，Zn2+、Cu2+及U(Ⅵ)的去除實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖10。從圖10可看出，在72 h內(nèi)，Zn2+和Cu2+的去除率分別達(dá)到97.54%、95.48%，而U(Ⅵ)的去除率僅為12.07%?？梢?jiàn)，通過(guò)引入檸檬酸鈉，有利于重金屬離子(Zn2+和Cu2+)的選擇性沉淀。究其原因，U(Ⅵ)可與有機(jī)物形成可溶性絡(luò)合物，而金屬硫化物不具備這一性質(zhì)[19]。結(jié)合前述分析可知，適當(dāng)添加有機(jī)物有利于選擇性沉淀重金屬。當(dāng)多齒配體有機(jī)官能團(tuán)通過(guò)生物或光降解后[25]，可利用直接法進(jìn)一步還原/沉淀去除U(Ⅵ)。

3 結(jié)論

1) 在U(Ⅵ)還原過(guò)程中，硫酸鹽還原菌經(jīng)聚乙烯醇和海藻酸鈉固定后對(duì)pH值的緩沖能力顯著增強(qiáng)。當(dāng)pH值為3.0～6.0時(shí)，固定硫酸鹽還原菌可高效、穩(wěn)定地還原/沉淀U(Ⅵ)。在U(Ⅵ)濃度為15 mg/L、微球投加量為6.0 g/L及溫度為35 ℃的條件下，反應(yīng)96 h后U(Ⅵ)去除率達(dá)到94.67%。

2) 當(dāng)Zn2+或Cu2+濃度低于100 mg/L時(shí)，U(Ⅵ)還原未受顯著影響；而當(dāng)Zn2+或Cu2+濃度增至150 mg/L時(shí)，U(Ⅵ)還原被完全抑制。

3) 乙酸鈉、草酸鈉和檸檬酸鈉3種有機(jī)物對(duì)固定化硫酸鹽還原菌還原U(Ⅵ)的影響存在較大差異。當(dāng)乙酸鈉等單齒配體有機(jī)物存在時(shí)，U(Ⅵ)可被完全還原，而多齒配體有機(jī)物(草酸鈉和檸檬酸鈉)存在時(shí)，會(huì)延緩甚至抑制U(Ⅵ)的還原。

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