高效液相色譜法測(cè)定精制銀翹解毒片中連翹苷的含量

吳 娟

高效液相色譜法測(cè)定精制銀翹解毒片中連翹苷的含量

吳 娟

目的 建立測(cè)定精制銀翹解毒片中連翹苷含量的方法。方法 采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定，使用C18柱（Diamonsil ODS，200.0 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫箱35 ℃，以乙腈-水（24:76）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；流速為1 ml/min。結(jié)果 采用HPLC測(cè)定連翹苷含量，連翹苷在0.0967～0.9670 μg范圍具有良好的線(xiàn)性關(guān)系；連翹苷平均回收率為99.1%。結(jié)論 高效液相色譜法靈敏度高，重復(fù)性好，所建立的連翹苷含量測(cè)定方法能有效控制銀翹解毒片的質(zhì)量。

精制銀翹解毒片；連翹苷；高效液相色譜法；含量測(cè)定

精制銀翹解毒片收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第三冊(cè)，由金銀花、連翹、對(duì)乙酰氨基酚等組成，具有清熱散風(fēng)、解表退熱功能，用于流行性感冒、發(fā)冷發(fā)熱、四肢酸懶、頭疼咳嗽、咽喉腫痛、溫毒發(fā)斑、臉腮赤腫。原標(biāo)準(zhǔn)采用了紫外分光光度法只測(cè)定了對(duì)乙酰氨基酚的含量，鑒別也只有對(duì)乙酰氨基酚的薄層鑒別，對(duì)處方中其他中藥無(wú)任何控制指標(biāo)，而金銀花的有效成分綠原酸在測(cè)定波長(zhǎng)249 nm也有紫外吸收，必然影響對(duì)乙酰氨基酚含量測(cè)定的準(zhǔn)確度[1-3]。通過(guò)測(cè)定不同廠家的制劑發(fā)現(xiàn)，個(gè)別廠家的精制銀翹解毒片根本無(wú)法檢測(cè)到連翹苷。通過(guò)高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定精制銀翹解毒片中的對(duì)乙酰氨基酚和綠原酸含量頗多，本文采用HPLC法測(cè)定精制銀翹解毒片中的連翹苷含量可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 連翹苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào)110821-200610）；精制銀翹解毒片（太極集團(tuán)四川綿陽(yáng)制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z51020282，批號(hào)：55120004）；缺連翹的陰性樣品自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 乙腈（色譜純）；甲醇（分析純）；乙醇（分析純）；中性氧化鋁。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent Technologies 1260 高效液相色譜儀（Agilent Technologies 1260紫外檢測(cè)器、四元泵、二極管陣列檢測(cè)器1260Infinity、自動(dòng)進(jìn)樣器）；Diamonsil C18柱（Diamonsil ODS，200.0 mm ×4.6 mm，5 μm）；AY120電子天平（SHIMADZH）；CH-250型超聲清洗機(jī)（北京創(chuàng)新德超電子研究所）。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 參考《中華人民共和國(guó)藥典》一部（2010年版），單味藥連翹的有效成分連翹苷含量測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm[4-5]，測(cè)定連翹的指標(biāo)性成分連翹苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，在試驗(yàn)過(guò)程中，連翹苷的檢測(cè)波長(zhǎng)在230 nm時(shí)吸收值較277 nm大且無(wú)干擾，所以在精制銀翹解毒片中連翹苷含量測(cè)定選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。

2.2 色譜條件 Diamonsil C18柱（Diamonsil ODS，200.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈:水（24:76）；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；流速1.0 ml/min；柱溫：35 ℃。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約2.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 ml甲醇，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理10 min，放置室溫，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取濾液25 ml置蒸發(fā)皿中蒸至微干，加入0.5 g中性氧化鋁拌勻，加在中性氧化鋁柱（100～200目，1 g，內(nèi)徑1.0～1.5 cm）上，用70%乙醇80 ml洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘?jiān)?0%甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取連翹苷0.00967 g，置20 ml量瓶中，加甲醇溶液并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液，精密量取上述貯備液1 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取連翹苷對(duì)照品溶液、供試品溶液和缺連翹的陰性空白溶液注入液相色譜儀，記錄色譜（圖1～3），從圖中可見(jiàn)，連翹苷在該條件下，保留時(shí)間為20.8 min，陰性空白色譜圖在連翹苷位置處無(wú)干擾峰，連翹苷和其他相近的峰完全分離（分離度＞1.5），即本試驗(yàn)條件下連翹苷與其他組分分離完全，理論塔板數(shù)以連翹苷計(jì)算為3000。

圖1 連翹苷對(duì)照品

圖2 精制銀翹解毒片樣品

圖3 精制銀翹解毒片連翹空白樣品

2.6 提取時(shí)間的確定 考察甲醇為溶劑，比較不同超聲提取時(shí)間，結(jié)果提取10 min、20 min、30 min連翹苷含量無(wú)明顯差異，故從工作效率考慮選取超聲提取10 min（表1）。

表1 不同超聲時(shí)間連翹苷的提取結(jié)果

2.7 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取連翹苷對(duì)照品溶液（0.04835 mg/ml）2 μl、5 μl、10 μl、15 μl、20 μl進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，連翹苷進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程：y（連翹苷）=2073.3x+9.0691，R2=0.9999；連翹苷進(jìn)樣量在0.0967～0.9670 μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好線(xiàn)性關(guān)系（圖4）。

圖4 連翹苷線(xiàn)性關(guān)系

2.8 精密度試驗(yàn) 精密吸取連翹苷對(duì)照溶液（0.04835 mg/ml）10 μl，分別進(jìn)樣5次，連翹苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.68%，結(jié)果表明精密度良好（表2）。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μl，連翹苷峰面積RSD為0.66%，說(shuō)明溶液在24 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定（表3）。

2.10 復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次供試品6份（55120004），按2.3項(xiàng)下操作制得供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析并記錄峰面積，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好，見(jiàn)表4。

表2 精密度試驗(yàn)(n=5)

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)(n=6)

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)(n=6)

2.11 回收率試驗(yàn) 取6份已知含量的同一批樣品（55120004）各約1 g，精密稱(chēng)定，置50 ml容量瓶中，加入適量對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)制備供試液，按2.2色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為99.1%，RSD為0.71%，見(jiàn)表5。

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.12 樣品含量測(cè)定 依法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液10 μl，注入高效液相色譜儀，按上述方法測(cè)定，樣品（55120004）含連翹苷為每片0.1565 mg，精制銀翹解毒片平均片重為0.2680 g。

3 討論

3.1 連翹主要含有連翹苷、連翹脂、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸等多種成分，參考有關(guān)資料，鑒別連翹多選擇連翹苷作為本品含量測(cè)定的控制指標(biāo)。測(cè)定連翹苷的含量，所采用的方法有紫外分光光度法、薄層掃描法等，但以上方法誤差較大，而采用HPLC法測(cè)定連翹苷含量，色譜條件如上文所述，連翹苷與其他組分分離度好，重復(fù)性，精密度，回收率高。故選用HPLC測(cè)定連翹所含的有效成分連翹苷。

3.2 確定色譜條件時(shí)，用不同的色譜柱和不同品牌的高效液相色譜儀要達(dá)到良好的分離效果所使用的流動(dòng)相比例不同，但比例波動(dòng)不會(huì)很大。在實(shí)際工作中，參照藥典進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)也可根據(jù)色譜圖分離度的好壞對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行調(diào)節(jié)。

3.3 有文獻(xiàn)表明，用HPLC測(cè)定連翹中的連翹苷含量曾有不經(jīng)過(guò)過(guò)氧化鋁柱的過(guò)程，此法在進(jìn)行藥品檢驗(yàn)過(guò)程中雖然簡(jiǎn)化了檢測(cè)過(guò)程，節(jié)省了工作時(shí)間，但藥品對(duì)色譜柱的損害較大，明顯縮短了色譜柱的使用壽命。所以，此方法不可取。

3.4 在試驗(yàn)過(guò)程中，曾采用40、60、80 ml 70%乙醇洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在氧化鋁柱中，40 ml 70%的乙醇便可洗脫完畢，但在實(shí)際操作過(guò)程中，蒸發(fā)皿蒸至漸干后用氧化鋁拌干過(guò)程中有大量的物質(zhì)殘留于蒸發(fā)皿內(nèi)，需用洗脫液溶解過(guò)柱，按照少量多次的原則進(jìn)行清洗，要保證洗脫完全，則洗脫液應(yīng)控制在80 ml左右。

參與文獻(xiàn)

[1] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑(第三冊(cè))[M].北京: 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì),2001:198-198.

[2] 中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:159-159.

[3] 俞崇靈.連翹抗菌成分的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1960,8(6):241-244.

[4] 蘇永林,陳卓,姚靜.高效液相法測(cè)定桑菊感冒合劑中連翹苷的含量[J].河南中醫(yī),2012,32(7):920-921.

[5] 李會(huì).勤清喉咽合劑中連翹苷的含量測(cè)定[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2011, 17(3):51-52.

Content determination of forsythin in JinzhiYinQiaojiedu tablets by HPLC

Wu Juan

Objective To establish a method for content determination of forsythin in Yinqiaojiedu tablets.Methods Using HPLC,usingC18column( Diamonsil ODS,200.0 mm×4.6 mm,5 μm),35 ℃ column temperature box,using acetonitrile and water(24:76) as mobile phase,the detection wavelength was 230nm;the flow rate was 1 ml/min.Results Using high performance liquid chromatographydetermination of phillyrin in Forsythia rule,has a good linear relationship in the range of 0.0967～0.9670 μg phillyrin;the average recovery rate was 99.1%.Conclusion The HPLC method has high sensitivity,good reproducibility,can be used for the quality control of Yinqiao Jiedu tabletmethod for determination of phillyrin the.

YinQiaojiedu tablets;Forsythin;HPLC;Content determination

R927.2

A

1673-5846(2014)08-0017-03

畢節(jié)市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州畢節(jié) 551700