GasBenchⅡ-IRMS測(cè)定葡萄酒水中δ18O方法研究

王道兵，鐘其頂，高紅波，程 濤，黃占斌

(1. 中國(guó)礦業(yè)大學(xué)(北京)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083；2. 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100027；3.全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京 100027)

葡萄酒品質(zhì)的優(yōu)劣取決于是否用優(yōu)質(zhì)的原料釀制而成，是否在工藝過(guò)程中添加了禁用的添加劑。由于我國(guó)的葡萄原料供給不充裕，同時(shí)受當(dāng)前檢測(cè)技術(shù)水平的限制，還不能通過(guò)數(shù)據(jù)客觀地反映這些指標(biāo)，因此近年來(lái)屢有發(fā)生以半汁葡萄酒假冒全汁葡萄酒，產(chǎn)品年份、產(chǎn)地、品種亂標(biāo)的現(xiàn)象，這嚴(yán)重違反了行業(yè)內(nèi)的公平競(jìng)爭(zhēng)，損害了行業(yè)利益，也給消費(fèi)者帶來(lái)了安全隱患。

穩(wěn)定同位素技術(shù)的發(fā)展對(duì)于開(kāi)展葡萄酒真實(shí)性鑒別具有重要意義[1-3]，尤其是葡萄酒水中氧同位素比值(δ18O)在產(chǎn)品摻水鑒別和產(chǎn)地溯源方面有很高的應(yīng)用價(jià)值[4-12]。國(guó)際葡萄與葡萄酒組織(O.I.V)已制定了測(cè)定葡萄酒水中δ18O的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法[13]，然而，目前測(cè)定葡萄酒水中δ18O的標(biāo)準(zhǔn)方法主要為離線二氧化碳-水平衡法，該分析方法不僅存在樣品量大、勞動(dòng)強(qiáng)度大、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求高等特點(diǎn)，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)進(jìn)樣、分析效率低，難以滿(mǎn)足大規(guī)模連續(xù)測(cè)定，因此使得水中δ18O在葡萄酒真實(shí)性鑒別中的應(yīng)用進(jìn)展緩慢。近年來(lái)，在線二氧化碳-水平衡系統(tǒng)得到快速發(fā)展，Paul等[14]研究了不同因素對(duì)GasBench-IRMS測(cè)定二氧化碳中δ18O穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性的影響，并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化；杜廣鵬等[15]驗(yàn)證了排空時(shí)間對(duì)二氧化碳中δ18O測(cè)定穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性的影響；孫青等[16]應(yīng)用GasBench II-IRMS分析天然水樣中δ18O，穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性均比較理想；張琳等[17]對(duì)離線水平衡-雙路進(jìn)樣法和GasBench II-IRMS法進(jìn)行了比較，2種方法測(cè)定水中δ18O的精密度和準(zhǔn)確度基本一致，均能得到較好的分析數(shù)據(jù)。

本研究通過(guò)優(yōu)化方法參數(shù)，建立GasBench-IRMS測(cè)定葡萄酒水中δ18O的方法，探討可大規(guī)模連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定葡萄酒水中δ18O的在線分析技術(shù)，以用于葡萄酒摻水的鑒別。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

GasBench II前處理裝置：GC PAL自動(dòng)進(jìn)樣器，PoraPlot Q色譜柱(25 m×0.32 mm)，恒溫樣品盤(pán)(溫度精度±0.1 ℃)，硼硅酸鹽反應(yīng)瓶(12 mL)，進(jìn)樣針和吹氣針；Delta V advantage檢測(cè)器：美國(guó)Thermo Finnigan公司產(chǎn)品，儀器控制軟件為ISODATE 3.0。

主要試劑：高純He、CO2標(biāo)準(zhǔn)氣、0.3%CO2和He混合氣，銅絲，活性碳粉末，乙醇(色譜純)。

GasBench II-IRMS分析CO2氣體中δ18O的精密度1σ<0.08‰，測(cè)定線性范圍為1～10 V(信號(hào)強(qiáng)度)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

設(shè)定恒溫樣品盤(pán)溫度為27 ℃，He壓力為80 kPa。在樣品瓶中加入銅絲、活性碳和樣品后，放入恒溫樣品盤(pán)中。固定進(jìn)樣針和吹氣針，設(shè)定自動(dòng)進(jìn)樣器程序，充入0.3%CO2和He混合氣10 min，帶走瓶中的空氣。設(shè)定樣品充氣與樣品分析之間的間隔，使氣體CO2與水中氧發(fā)生同位素交換[18]。質(zhì)譜儀測(cè)定平衡后CO2同位素比值。

1.3 數(shù)據(jù)校正

在樣品測(cè)定過(guò)程中插入質(zhì)控水樣和標(biāo)準(zhǔn)水樣，依據(jù)Stephen等[19]報(bào)道的VSMOW/SLAP校正法進(jìn)行校正。

2 結(jié)果與討論

2.1 影響因素分析

基于二氧化碳-水平衡法測(cè)定水中δ18O時(shí)，反應(yīng)瓶氣密性、反應(yīng)時(shí)間、樣品性質(zhì)等均可能影響測(cè)定結(jié)果的有效性(以GasBench II-IRMS的測(cè)定精度0.15‰為評(píng)判基準(zhǔn))。

2.1.1反應(yīng)瓶氣密性 二氧化碳與水進(jìn)行氧同位素交換時(shí)，即使采用振蕩方式促進(jìn)反應(yīng)，也需5 h才能達(dá)到同位素交換平衡[13]。GasBench II-IRMS的優(yōu)勢(shì)是可一次性測(cè)定大量樣品，然而由于GasBench II-IRMS是在靜置狀態(tài)下進(jìn)行交換反應(yīng)的，若此過(guò)程二氧化碳?xì)怏w滲漏則可能出現(xiàn)同位素動(dòng)力分餾，影響水中δ18O測(cè)定的準(zhǔn)確性。

有研究[11]表明，超過(guò)24 h時(shí)，瓶?jī)?nèi)CO2中δ18O呈偏重趨勢(shì)，即反應(yīng)瓶氣密性變化導(dǎo)致瓶?jī)?nèi)氣體滲漏繼而出現(xiàn)同位素分餾。本研究向26個(gè)反應(yīng)瓶中充入0.3%CO2和He混合氣，間隔2 h進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果示于圖1。

各瓶中CO2的δ18O測(cè)定值的平均值為-1.03‰，SD為0.04‰(優(yōu)于測(cè)定誤差0.15‰)。從圖1可以看出，52 h內(nèi)，CO2的δ18O測(cè)定值僅在一定范圍內(nèi)(-0.94‰～-1.10‰)波動(dòng)，沒(méi)有出現(xiàn)越來(lái)越偏正的情況，說(shuō)明本研究所用的反應(yīng)瓶能夠保證至少52 h內(nèi)不出現(xiàn)同位素分餾現(xiàn)象。

2.1.2樣品體積的影響 有研究[20]報(bào)道，樣品水量為0.2、0.5、1 mL時(shí)，樣品水中氫或氧的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)平衡物質(zhì)CO2物質(zhì)的量，平衡體系中CO2的初始同位素比值對(duì)分析結(jié)果沒(méi)有影響，即不同樣品體積對(duì)水中氫、氧同位素分析結(jié)果沒(méi)有明顯的干擾。然而孫青等[16]研究表明，測(cè)定值會(huì)隨樣品體積的增大而逐漸偏負(fù)，并且樣品水量較大時(shí)測(cè)量結(jié)果受體積的影響較小，而樣品水量較小時(shí)受體積的影響較大，詳細(xì)情況列于表1。

表1 樣品體積對(duì)葡萄酒水中δ18O測(cè)定的影響Table 1 Influence of sample volume on δ18O of water in wine

本研究針對(duì)葡萄酒樣品進(jìn)行分析，結(jié)果表明，體積在200 μL時(shí)測(cè)定值的波動(dòng)較大，而體積為500 μL時(shí)測(cè)定最穩(wěn)定。對(duì)比不同體積時(shí)的平均測(cè)定結(jié)果，雖然呈增大趨勢(shì)，但極差僅為0.16‰，與儀器測(cè)定誤差(0.15‰)相近。這說(shuō)明在葡萄酒分析中，樣品體積在200～1 000 μL變化時(shí)不影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，但體積過(guò)小或過(guò)大時(shí)穩(wěn)定性較差。

2.1.3平衡時(shí)間的選擇 分別在12、16、20、24、32、40、48、72 h時(shí)測(cè)定，CO2/He混合氣與水發(fā)生氧同位素交換，結(jié)果示于圖2。反應(yīng)時(shí)間在12～24 h時(shí)測(cè)得的氧同位素值比較偏負(fù)，且呈現(xiàn)逐漸偏正的趨勢(shì)，這表明，水與CO2還未完全達(dá)到同位素平衡；而反應(yīng)時(shí)間在24～72 h時(shí)測(cè)得的結(jié)果比較穩(wěn)定，這說(shuō)明當(dāng)平衡反應(yīng)進(jìn)行24 h后開(kāi)始測(cè)定是較適合的。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)葡萄酒水中δ18O的影響Fig.2 Influence of equilibrium time on δ18O of water in wine

2.1.4乙醇對(duì)葡萄酒水中δ18O測(cè)定的影響

在葡萄酒中乙醇含量為7%～16%，GasBench II-IRMS采氣時(shí)[11,17]，通過(guò)進(jìn)樣針用載氣將反應(yīng)瓶中的混合氣體(CO2、水蒸氣及其他)轉(zhuǎn)移至IRMS中進(jìn)行分析，若將乙醇帶入IRMS中，由于乙醇的相對(duì)分子質(zhì)量為46，勢(shì)必會(huì)影響水中δ18O的測(cè)定。

為驗(yàn)證乙醇對(duì)δ18O測(cè)定的影響，配制體積百分比分別為0、5%、10%、15%、20%的乙醇水溶液，測(cè)定其水中δ18O，結(jié)果列于表2。結(jié)果表明，乙醇濃度在0～20%范圍時(shí)，不影響水中δ18O測(cè)定的穩(wěn)定性及結(jié)果準(zhǔn)確性，因此GasBench II-IRMS法適合進(jìn)行葡萄酒水中δ18O測(cè)定。

表2 乙醇水溶液中水的δ18OTable 2 δ18O-value of water in ethanol-water solution

2.2 方法穩(wěn)定性

采用IRMS與GasBench II聯(lián)用，利用CO2-H2O平衡在線連續(xù)分析葡萄酒水中氧穩(wěn)定同位素組成，方法的恒溫樣品盤(pán)溫度為27 ℃，He壓力為80 kPa，向0.5 mL葡萄酒樣品中加入活性碳、銅絲后，與0.3%CO2和He混合氣平衡24～48 h，質(zhì)譜儀測(cè)定同位素交換平衡后CO2中δ18O，用標(biāo)準(zhǔn)水樣校正測(cè)定結(jié)果。

為驗(yàn)證方法的穩(wěn)定性，本研究按照GB 6379.2《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度)第2部分:確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法》的有關(guān)規(guī)定，對(duì)本研究測(cè)定葡萄酒水中δ18O的穩(wěn)定性進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果列于表3。

表3 葡萄酒水中δ18O的實(shí)驗(yàn)室協(xié)同實(shí)驗(yàn)Table 3 Repeatability and reproducibility of δ18O-value of water in wine

3 GasBench Ⅱ-IRMS 在葡萄酒摻水鑒別中的初步研究

為檢驗(yàn)本方法在葡萄酒摻水鑒別中的應(yīng)用效果，選擇葡萄酒和蒸餾水為研究對(duì)象，并將葡萄酒與蒸餾水按照2∶8、4∶6、6∶4、8∶2比例進(jìn)行配制，混勻，得到外源水摻入比例分別為0、20%、40%、60%、80%、100%的6個(gè)模擬樣品，并測(cè)定其水中δ18O，結(jié)果示于圖3a。各樣品的水中δ18O隨著外源水含量的增加而下降，且呈現(xiàn)良好的線性負(fù)相關(guān)關(guān)系(R2=0.998 8)，擬合方程為δ18O=-10.255x+1.028 3(x為外源水含量)。因此，針對(duì)該葡萄酒和外源水，可利用此關(guān)系檢測(cè)葡萄酒中是否摻水，并可進(jìn)一步推斷外源水的含量。然而需要注意的是，擬合方程中的斜率與截距并非常數(shù)，會(huì)因原葡萄酒、外源水的水中δ18O不同而變化，結(jié)果示于圖3b。

圖3 葡萄酒水中δ18O與外源水含量的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation between δ18O of water in spiked wine and exogenous water content

4 結(jié)論

本研究建立了GasBench II-IRMS測(cè)定葡萄酒水中氧同位素組成的在線分析方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，反應(yīng)瓶在52 h內(nèi)不會(huì)出現(xiàn)同位素分餾，葡萄酒樣品體積及乙醇均不會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，平衡24 h后可達(dá)到交換平衡，在24～48 h內(nèi)測(cè)定時(shí)的重復(fù)性與再現(xiàn)性結(jié)果均滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需求。相對(duì)于離線測(cè)定方法，該方法操作簡(jiǎn)便、分析速度快，適合葡萄酒行業(yè)和質(zhì)檢系統(tǒng)的大規(guī)模樣品測(cè)定。

通過(guò)模擬實(shí)驗(yàn)表明，葡萄酒水中δ18O與外源水含量線性相關(guān)，可用于葡萄酒中外源水含量的判別。

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