聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)大豆SRAP標(biāo)記

王 芳，李曉靜，周延清

(1．中州大學(xué) a.實(shí)驗(yàn)管理中心 b.化工食品學(xué)院，鄭州450044；2．河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453007)

隨著生物工程及基因工程技術(shù)的發(fā)展，基于PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的分子標(biāo)記技術(shù)也得到了迅速發(fā)展。目前在大豆種質(zhì)資源研究方面應(yīng)用的PCR分子標(biāo)記主要有RAPD、ISSR、AFLP、RFLP等。這些標(biāo)記雖然各有特點(diǎn)，但是效果[1]均不理想。2001年由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li和Quiros[2]博士提出相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence-Related Amplified Polymorphism，SRAP)分子標(biāo)記，該標(biāo)記是一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，因其具有簡(jiǎn)便、中等產(chǎn)量、高共顯性、重復(fù)性、易于分離條帶及測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)，目前在很多植物中都得到了廣泛的應(yīng)用[3-4]，但在大豆研究[5]中未見報(bào)道。

聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術(shù)是一種檢測(cè)靈敏度和分辨率都很高的電泳技術(shù)，從聚丙烯酰胺凝膠中得到的DNA 純度很高，特別適合于像SRAP這樣的小DNA 片段的分析(5～500bp)，是分子生物學(xué)、生物工程及基因工程研究方面不可缺少的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。因其具有設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，操作比較方便，時(shí)間短，樣品量少等特點(diǎn)[6]，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于DNA的分析實(shí)驗(yàn)中。本文以大豆為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行了大豆的SRAP-PCR擴(kuò)增，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染，建立了一種簡(jiǎn)便快捷的適合于大豆SRAP標(biāo)記的PAGE銀染檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為豆科大豆屬的133種大豆，品種由河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院梁鳳珍、王樹峰和周口農(nóng)業(yè)科學(xué)院苑寶軍研究員提供(見表1)。SRAP引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(見表2)。

1.2 DNA提取及檢測(cè)

將大豆下胚軸研磨成粉末，每個(gè)品種取3 g大豆粉末用CTAB法[7]提取總DNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定所提DNA的濃度，并稀釋為10 ng/μL的工作液，保存在4 ℃冰箱中備用。

1.3 SRAP-PCR反應(yīng)體系

參考Li和Quiros的SRAP擴(kuò)增程序[2]稍加修改，反應(yīng)體系總體積為25 μL，每管中還含有1×PCR buffer和滅菌水。進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，建立反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，然后前5個(gè)循環(huán)為94 ℃變性l min，35 ℃ 退火l min，72 ℃延伸1 min，后35個(gè)循環(huán)僅將退火溫度升為50 ℃，最后72 ℃延伸7 min[8]。

1.4 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳[9-10]

1.4.1 聚丙烯胺凝膠的配制

10 %過(guò)硫酸胺(APS)：1 g過(guò)硫酸胺溶于10 mL雙蒸水，4 ℃保存。6%丙烯酰胺凝膠母液：29 g丙烯酰胺，5.8 g甲叉雙丙烯酰胺，加雙蒸水至500 mL，溶解后過(guò)濾，4 ℃保存。10 TBE(pH8.0)：108 gTris堿，55 g硼酸，40 mL 0.5 mol/L EDTA。

表1 用于SRAP分析的大豆品種名稱

表2 用于大豆研究中SRAP引物

1.4.2 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟

首先用洗滌劑將兩塊玻璃徹底清洗干凈，晾干。用2 mL左右的95 %乙醇涂于玻璃板上，擦拭干凈，可處理1～2次。裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側(cè)及底部用1%的瓊脂糖封邊。將裝好的玻璃電泳板傾斜45～60°。其次，在70 mL丙烯酰胺凝膠母液中加入400 μL APS和40 μL TEMED，配制成凝膠液混勻，緩慢將凝膠液注入兩玻璃板空隙中，直至灌滿至模具的頂部。將梳子小心地插入，以免梳齒下或梳齒旁產(chǎn)生氣泡，梳頂部應(yīng)該比短玻璃板頂部稍高些。室溫聚合1 h后，將玻璃板插入電泳槽中，固定，倒入0.1×TBE緩沖液。小心取出梳子，加樣，上樣量為6 μL PCR產(chǎn)物。最后，撕取膠帶小心拔出梳子。在下槽加入400 mL左右1倍TBE后，將凝膠模具裝上電泳裝置。上槽加入500 mL 1倍TBE。上樣過(guò)程盡可能迅速，爭(zhēng)取在30 min內(nèi)完成。上樣完畢繼續(xù)在140 V恒壓下電泳約4 h，當(dāng)二甲苯青距底部約1/3處終止電泳[5]。

1.5 染色

1.5.1 染液的配制

固定液：加100 mL無(wú)水乙醇和5 mL冰醋酸至1790 mL雙蒸水中。染色液：加入100 mL無(wú)水乙醇和5 mL冰醋酸至1790 mL雙蒸水中，再加入2 g AgNO3。顯色液：將30 g NaOH溶于1L雙蒸水中，在4～10 ℃下冷卻。在使用前幾分鐘，加入3 mL甲醛。停顯液：加200 mL的冰醋酸至1800 mL的雙蒸水中[5]。

1.5.2 染色的操作步驟

固定和染色：將凝膠放入準(zhǔn)備好的裝有固定液的塑料盒中，靜置10 min以上。將顯色液放于冰浴中進(jìn)行冷卻，染色將要結(jié)束時(shí)，在清洗塑料盒中加入雙蒸水。將6 mL 37%甲醛加入冷卻好的顯色液中，混勻，將2 L配好的顯色液倒入顯影塑料盒中。

漂洗和顯色：將凝膠從染色液中取出，在清洗盒中迅速漂洗一遍，時(shí)間嚴(yán)格控制在5～10s。將凝膠放入顯色液中，輕輕搖動(dòng)至第一條帶出現(xiàn)，倒掉已上色的顯色液，更換另一半顯色液，繼續(xù)輕輕搖動(dòng)。一般上部顯色，應(yīng)對(duì)帶弱的部分尤其是下部著重進(jìn)行顯色，至直條帶清晰可見。輕輕搖動(dòng)2 min后，再將玻璃板用雙蒸水漂洗3 min。

停顯和晾干：將凝膠從顯色液中取出，在清洗盒中迅速漂洗一遍，放入10 %的停顯液中，然后拍照或掃描保存[5]。

2 結(jié)果

2.1 引物篩選結(jié)果

對(duì)大豆品種進(jìn)行引物篩選(見圖1)，結(jié)果從288對(duì)隨機(jī)引物組合中篩選出條帶較多、信號(hào)強(qiáng)、背景清晰的12對(duì)引物組合(見表3)用于進(jìn)一步分析研究。

圖1 SRAP部分引物的篩選(編號(hào)為引物序號(hào))

2.2 大豆的SRAP-PCR擴(kuò)增

用篩選出來(lái)的引物組合me16em17和me12em5對(duì)大豆SRAP的產(chǎn)物進(jìn)行了擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)，并用銀染法進(jìn)行染色(見圖2、圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于大豆SRAP分子標(biāo)記來(lái)說(shuō)，采用聚丙烯凝膠電泳及銀染法染色，取得了比較理想的電泳條帶及染色效果。由此可見，此種方法檢測(cè)大豆SRAP標(biāo)記，具有檢測(cè)靈敏度高、凝膠背景淺、操作簡(jiǎn)便、條帶清晰等特點(diǎn)，是適合大豆SRAP研究的檢測(cè)方法。

表3 用于SRAP研究的引物組合及擴(kuò)增結(jié)果

圖2 引物me16em17 SRAP的PAGE擴(kuò)增圖譜

圖3 引物me12em5 SRAP的PAGE擴(kuò)增圖譜

3 結(jié)論與討論

SRAP分子標(biāo)記因其具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、產(chǎn)率高、便于克隆目標(biāo)片段的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水稻、萵苣、馬鈴薯、白菜、大蒜、油菜、蘋果、生菜、櫻桃、柑橘、芹菜等作物的種質(zhì)資源的鑒定評(píng)價(jià)、遺傳圖譜的構(gòu)建、重要性狀基因標(biāo)記、基因組DNA與cDNA指紋分析、比較基因組學(xué)遺傳多樣性分析和圖位克隆等[11]方面。聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率很高，長(zhǎng)度僅相差0.2 %的DNA分子片段即可分開，所能裝載的DNA量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了瓊脂糖凝膠電泳。多達(dá)10 g的DNA可以加樣聚丙烯酰胺凝膠的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品槽而不會(huì)顯著影響其分辨力。從聚丙烯酰胺凝膠中回收的DNA純度非常高，以至于可以用于要求最高的實(shí)驗(yàn)中。聚丙烯酰胺凝膠電泳的很多優(yōu)點(diǎn)也多用于同工酶的酶譜分析[12]。但是對(duì)聚丙烯凝膠電泳結(jié)果影響的因素很多，不同的試驗(yàn)處理對(duì)結(jié)果有不同的影響，影響大的甚至不能進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的分析。因此，需要對(duì)聚丙烯酰胺凝膠電泳各個(gè)參數(shù)進(jìn)行不斷優(yōu)化。例如聚丙烯酰胺凝膠的濃度、染色過(guò)程及電泳時(shí)間等[13]都是其中重要的參數(shù)。

在用聚丙烯酰胺檢測(cè)SRAP-PCR產(chǎn)物時(shí)，前人多采用4%～10%之間的濃度進(jìn)行檢測(cè)。張素勤[14]在檢測(cè)辣椒SRAP產(chǎn)物時(shí)應(yīng)用10 %的凝膠濃度，許曉燕[15]等利用AFLP和SRAP標(biāo)記分析毛木耳的遺傳多樣性時(shí)用8 %的聚丙烯凝膠，何鳳發(fā)[16]用9 %的凝膠濃度對(duì)馬鈴薯進(jìn)行了遺傳資源多樣性的分析，王華忠[10]用6 %的變性凝膠電泳檢測(cè)。本文通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)建立了適合大豆SRAP聚丙烯酰胺凝膠電泳及染色方法，即聚丙烯酰胺凝膠的濃度為6%、電泳電壓為140 V， SRAP標(biāo)記產(chǎn)物多態(tài)性條帶清晰、明亮、穩(wěn)定，為大豆SRAP進(jìn)一步的研究工作提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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