水提法提取海藻多糖及其對(duì)α-淀粉酶的抑制活性研究

王文武，閔玉濤，陶 敬，馬慶一

(1.中州大學(xué) 化工食品學(xué)院，鄭州 450044 ；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院,鄭州 450002)

海藻為海產(chǎn)藻類(lèi)植物的通稱，在我國(guó)資源十分豐富。海藻中含有豐富的多糖，占其干重的50%以上。海藻多糖具有抗輻射、抗腫瘤、抗氧化及抗病毒等[1-4]多種生物活性，近年來(lái)的研究[5-6]表明，海藻多糖具有較好的降糖效果，其降糖機(jī)理是抑制α-葡萄糖苷酶的活性，延緩血糖生成。

本文采用水提法提取海藻多糖，以胰α-淀粉酶為靶酶，4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)作為底物，采用體外消化模型，研究海藻多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制作用，探索其降糖機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑

海藻：購(gòu)自鄭州市中藥城，去雜后于40℃干燥，粉碎至40目備用；4-硝基苯-α- D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)；胰α-淀粉酶。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海藻多糖的提取方法

取100g海藻粉末，加1000mL水，膠體磨處理5min，80℃下水浴提取10h，趁熱抽濾，收集濾液。在濾渣中加入5倍體積的水提取5h，趁熱抽濾，合并濾液。濾液離心后減壓濃縮(水浴40℃)至原體積的四分之一，加3倍體積乙醇沉淀24h，離心收集沉淀，得水提海藻多糖。

1.2.2 海藻多糖的跟蹤檢測(cè)

1.2.2.1 定性檢測(cè)

α-萘酚試驗(yàn)(Molisch紫環(huán)反應(yīng))：取檢品的水溶液1mL，加5%萘酚試液數(shù)滴振搖后，沿管壁滴入5～6滴濃硫酸，使之分成兩液層，待2～3 min后，如果兩層液面出現(xiàn)紫紅色環(huán)，證明有糖、多糖或甙類(lèi)。

1.2.2.2 粗多糖得率的計(jì)算

取3套稱量瓶，于105℃烘至恒重。分別取海藻多糖水溶液1mL，移入有編號(hào)的稱量瓶中，于105 ℃烘至恒重，做3組平行試驗(yàn)。計(jì)算得率。

1.2.3 海藻多糖的初步純化

1.2.3.1 脫色

活性炭脫色法：海藻多糖粗提物水溶液加熱至70～80℃，加入活性炭與硅藻土 (11)，放置過(guò)夜脫色，然后離心抽濾，取濾液。

雙氧水脫色法：海藻多糖粗提物水溶液加熱至50℃，緩慢加入30%的雙氧水至淺黃色，保溫2h，殘留的雙氧水用亞硫酸鈉還原。

1.2.3.2 除蛋白

1.2.4 海藻多糖抑制淀粉酶效果的測(cè)定

將PNPG、緩沖溶液和海藻多糖水溶液于室溫下在比色皿中恒定5min，加入胰淀粉酶立即震蕩，計(jì)時(shí)，于400nm下測(cè)定吸光度，每分鐘讀取一次吸光值，同時(shí)做PNPG的空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以減去底物自身水解產(chǎn)生的誤差。

表1 測(cè)定反應(yīng)體系

注：PNPG濃度為0.5mmol/L，胰α-淀粉酶濃度為5mg/mL，緩沖溶液pH為6.81，多糖濃度根據(jù)試驗(yàn)要求而定。

反應(yīng)體系見(jiàn)表1，以反應(yīng)15min時(shí)的吸光度值為基準(zhǔn)計(jì)算各組分的抑制率，抑制率計(jì)算公式：

1.2.5 海藻多糖的抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

測(cè)定不同濃度水提多糖對(duì)酶活性的影響。 多糖濃度分別為5mg/mL，10mg/mL，12mg/mL，反應(yīng)體系同表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 海藻多糖的提取

2.1.1 海藻多糖的提取率

多糖的提取率為7.8%，提取液顏色較深，具有一定的粘度。水提多糖的過(guò)程較慢，但成本低，提取率高。水提所得的是極性強(qiáng)、分子量大的多糖。

2.1.2 不同提取時(shí)間對(duì)多糖提取的影響

80℃下分別提取2h，5h，10h，18h的多糖，提取效果見(jiàn)表2。

表2 不同提取時(shí)間對(duì)水提多糖質(zhì)地的影響

水提法提取多糖，用膠體磨做前處理后，海藻粉的水溶液較粘稠，不同提取時(shí)間對(duì)海藻粉水溶液的粘稠度影響也不同。多糖的提取率與提取時(shí)間有關(guān)，適當(dāng)延長(zhǎng)提取時(shí)間可使多糖提取充分。80℃，pH7.0，提取10h，海藻多糖得率可達(dá)7.8%。但18h的提取率反而下降，這主要是由于隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，溶液越來(lái)越粘稠，無(wú)法正常抽濾，導(dǎo)致多糖損失。本實(shí)驗(yàn)采用熱水浸提海藻多糖，操作簡(jiǎn)便快速，所用試劑易得且成本低，多糖得率高，符合實(shí)驗(yàn)研究和大規(guī)模生產(chǎn)的需要。

2.2 海藻多糖的脫色

多糖中若存在過(guò)多的色素，不僅影響多糖的色澤，而且會(huì)降低多糖的純度?；钚蕴棵撋Ч麤](méi)有雙氧水脫色效果明顯，但它是靠吸附作用脫色，抽濾后濾液中沒(méi)有殘留。而雙氧水會(huì)有部分殘留，影響多糖的性質(zhì)測(cè)定，還需加入還原劑中和，操作繁瑣，故采用活性炭脫色法。

2.3 海藻多糖降糖活性的研究

根據(jù)底物濃度為0.5mmol/mL，反應(yīng)時(shí)間15min時(shí)，不同濃度的水提多糖與酶作用結(jié)果的吸光度值計(jì)算出濃度，作抑制率-抑制劑濃度圖，如圖1所示。

圖1 水提多糖抑制劑濃度與抑制率關(guān)系圖

由圖1可知， 隨著多糖用量的增加，其抑制活性也不斷增加，當(dāng)達(dá)到10.000mg/mL時(shí)，其抑制活性不再增加。同法得出其IC50=2.850mg/mL。

3 結(jié)論

(1)熱水浸提海藻多糖操作簡(jiǎn)便快速，所用試劑易得且成本低，多糖提取率為7.8%。

(2)與多糖濃度為12mg/mL時(shí)對(duì)淀粉酶的抑制率相比較，水提多糖的抑制率為59.38%， IC50為2.850mg/mL。

參考文獻(xiàn)：

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