干酪乳桿菌表面展示IBDV VP2蛋白

林紅麗，王嵩，王宇鵬，欒云艷，余麗蕓，侯喜林

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

雞傳染性法氏囊?。↖nfection Bursal Disease,IBD）是由傳染性法氏囊病毒（IBDV）引起雞的一種急性、高度接觸性傳染病，主要發(fā)生于3～6 周齡雛雞。不僅引起大批死亡還可導(dǎo)致免疫抑制[1]。目前市場上用于預(yù)防IBDV 的商品疫苗多為中等毒力疫苗。然而此類疫苗免疫時間往往不易掌握，免疫時期不對，就會對雞法氏囊造成損傷，造成機體免疫抑制[2-4]。鑒于此，研制一種安全有效的抗IBDV 疫苗已經(jīng)迫在眉睫。預(yù)防雞傳染性法氏囊病的基因工程亞單位疫苗以其安全、方便等優(yōu)點已經(jīng)成為目前國內(nèi)外研究的熱點。

近十幾年，乳酸菌表達系統(tǒng)得到充足的發(fā)展。乳酸菌除了可以調(diào)節(jié)機體胃腸道微生態(tài)平衡，抑制病菌之外[5]，它還可以作為外源基因表達遞送的載體。此外，干酪乳桿菌表達系統(tǒng)不需要誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)，即可成功表達外源蛋白，這樣既減少了誘導(dǎo)劑對菌體的侵害，又便于操作，是未來潛在的疫苗表達載體。而VP2 蛋白是IBDV 主要結(jié)構(gòu)蛋白和保護性抗原成分，與病毒中和性抗體的誘導(dǎo)和識別等生物學(xué)功能有關(guān)，它與另一主要結(jié)構(gòu)蛋白（VP3）一起構(gòu)成IBDV核衣殼的骨架。有研究證實VP2 蛋白主要暴露在核衣殼的外面，攜帶病毒主要的中和性抗原表位[6]。本研究將應(yīng)用pHCE1LB-pgsA（pLA）載體構(gòu)建干酪乳桿菌表達系統(tǒng)表達IBDV VP2 蛋白，為雞傳染性法氏囊病的基因工程亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細菌和表達載體

傳染性法氏囊病毒B87 株疫苗株購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司；干酪乳桿菌CICC6105（Lactobacillus casei CICC6105）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；大腸桿菌DH5α 菌株由實驗室保存；干酪乳桿菌表達載體pHCE1LB-pgsA（pLA）由實驗室保存；pMD18-T 載體購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 主要試劑

LA Taq DNA 聚合酶（125 U·μL-1）、限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、SalⅠ、T4DNA 連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司，雞源的抗IBDV 多抗血清由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室贈送，兔源抗pgsA 多抗血清由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)基因工程實驗室贈送；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗雞IgG 抗體、FITC 標(biāo)記的羊抗雞IgG 二抗、FITC 標(biāo)記的羊抗兔IgG 購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，預(yù)染蛋白質(zhì)Marker 購自Fermentas 公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)GeneBank 中發(fā)表的B87 株VP2 蛋白基因序列（序列號為DQ906921.1），應(yīng)用Blast 和Oligo 6.0設(shè)計一對帶有酶切位點的特異性引物（表1），在基因保守區(qū)上游和下游引物5′端設(shè)計保護性堿基，并加入BamHⅠ和SalⅠ酶切位點（黑色加粗堿基），預(yù)計擴增片段為1 345 bp。將目的片段克隆在T 載體上，構(gòu)建pMD-VP2，在大腸桿菌中增殖。然后將外源基因VP2 構(gòu)建在pLA 載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pLA-VP2，電轉(zhuǎn)到干酪乳桿菌中，鑒定正確的命名為pLA-VP2。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2 外源蛋白的表達及反應(yīng)原性的鑒定

取重組菌pLA-VP2，按2%接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜靜置培養(yǎng)。次日，按2%接種于含34 μgmL-1氯霉素的10 mL MRS 培養(yǎng)基中。取表達6 h 的菌液1 mL，進行SDS-PAGE 檢測目的蛋白（5%的濃縮膠，12%的分離膠）。

應(yīng)用半干式轉(zhuǎn)移電泳槽進行Western blot 檢測。取表達6 h 的重組菌和空載體菌的蛋白處理樣品進行12%的SDS-PAGE，剪一個尼龍膜和6 個3 mm 厚的濾紙，保持其大小與待轉(zhuǎn)凝膠大小相同。剪好的濾紙與尼龍膜以及待轉(zhuǎn)凝膠一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸潤15 min。然后依次在轉(zhuǎn)印槽的陽極板上從下到上放置3 張濾紙，然后是尼龍膜和凝膠，再放置3 張濾紙，最后蓋上陰極蓋，通電75 min。通電結(jié)束后凝膠中的蛋白質(zhì)就將轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。將轉(zhuǎn)移好的膜浸入5%脫脂乳中，在水平搖床上4 ℃條件下緩慢搖動，過夜封閉。次日，將封閉好的膜浸入PBST 中，在水平搖床緩慢搖動3 次，每次10 min；然后將膜浸入以1∶500 稀釋的抗IBDV 多抗血清中，室溫緩慢振搖2 h；用PBST 溶液洗膜3 次，每次10 min；然后將膜浸入以1∶5 000 稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗雞IgG 抗體中，室溫緩慢振搖1 h；PBST 洗滌膜3 次，最后用DAB 顯色試劑盒顯色，觀察結(jié)果。pgsA 多克隆抗體檢測重組蛋白方法同上。

1.2.3 流式細胞檢測表達效率

作為確定檢測樣品為陽性的閾值標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用對照組曲線同實驗組曲線交叉法，即以交叉點為界，分別計算出陽性組曲線覆蓋面積及對照組延伸到陽性組下的面積，以前者減去后者獲得的數(shù)據(jù)，即為陽性組所占比例。為了使免疫熒光的定量概念更加完整，在陽性百分比基礎(chǔ)上加入熒光強度（FI）指標(biāo)。此值除了以對照組及實驗組的曲線峰值的常規(guī)方法確定外，更準(zhǔn)確的是擬合曲線法估計熒光強度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

取MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h 的重組干酪乳桿菌pLA-VP2 和干酪乳桿菌pLA 各1 mL，經(jīng)300 目篩網(wǎng)過濾后，6 000 r·min-1離心5 min，收集菌體沉淀。用PBS 吹洗三次，調(diào)整細胞濃度為5×106個·mL-1，離心收集菌體，加入PBS（含5% BSA），4 ℃封閉過夜。6 000 r·min-1離心5 min，用PBS 再次吹洗三次，加雞源的IBDV 多抗血清和兔源的pgsA 多抗血清，4 ℃作用4 h。6 000 r·min-1離心5 min，用PBS吹洗三次，加入FITC 標(biāo)記羊抗雞的IgG 熒光二抗（1∶100 稀釋）和FITC 標(biāo)記羊抗兔的IgG 熒光二抗（1∶100 稀釋），4 ℃避光作用5 h。6 000 r·min-1離心5 min，用PBS 洗滌三次。取105個細胞，流式細胞儀檢測，根據(jù)正態(tài)曲線計算陽性率。

2 結(jié)果

2.1 IBDV VP2 基因擴增及克隆

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，通過設(shè)計的特異性引物進行PCR 擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見一條約1 345 bp 的特異性條帶（圖1），與預(yù)期DNA 片段大小一致。

圖1 RT-PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR product

重組pMD-VP2 質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/SalⅠ雙酶切，結(jié)果切出大小約為2 692 bp 和1 345 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）。重組質(zhì)粒pMD-VP2 測序后，應(yīng)用DNAStar 軟件將IBDVB87 株VP2 基因與GenBank中發(fā)表的序列號為DQ906921.1 的基因進行比對，其同源性達到99.4%。

2.2 pLA-VP2 重組質(zhì)粒PCR 鑒定結(jié)果

電轉(zhuǎn)后的干酪乳桿菌經(jīng)增殖后提取質(zhì)粒進行PCR 鑒定（圖3）。以干酪乳桿菌轉(zhuǎn)化子為模板，通過設(shè)計的IBDV VP2 基因特異性引物進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約1 345 bp 的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖2 重組質(zhì)粒pMD-VP2 的酶切鑒定Fig.2 Identification of pMD-VP2 by enzyme digestion

圖3 重組干酪乳桿菌轉(zhuǎn)化子pLA-VP2 PCR 鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of recombinant plasmid by PCR

2.3 重組蛋白的Western blot 檢測結(jié)果

取經(jīng)表達6 h 的重組菌經(jīng)SDS-PAGE 后，切膠，經(jīng)尼龍膜轉(zhuǎn)印后，分別與雞源抗IBDV 多抗血清（圖4 A），DAB 顯色試劑顯色后，在預(yù)期位置出現(xiàn)明顯的條帶（約90 kDa），與預(yù)計大小一致，而含空質(zhì)粒pLA對照未見條帶；再經(jīng)兔源的pgsA 多抗血清（圖4 B）作用，DAB 顯色試劑盒顯色后，在預(yù)位置出現(xiàn)約90 kDa 的明顯條帶，與預(yù)計大小一致，而含空質(zhì)粒pLA 對照出現(xiàn)約41 kDa 的明顯條帶；說明pgsA 標(biāo)簽蛋白成功表達并可被兔源抗pgsA 血清識別，雞源抗IBDV 血清可以特異性識別重組蛋白。

圖4 重組蛋白Western blot 檢測結(jié)果Fig.4 Western blot analysis of the recombinant protein

2.4 重組干酪乳桿菌流式細胞檢測結(jié)果

攜帶pLA-VP2 重組質(zhì)粒的干酪乳桿菌與只攜帶pLA 的干酪乳桿菌共同利用流式細胞儀檢測，以雞源抗IBDV 多抗血清作為一抗，以羊抗雞IgG/FITC作為二抗，利用流式細胞儀檢測熒光信號，繪制成直方圖（圖5）。結(jié)果：pLA 電轉(zhuǎn)的干酪乳桿菌表明的熒光信號顯著低于干酪乳桿菌表達pLA-VP2 的試驗組，表明干酪乳桿菌成功表達外源蛋白VP2。為確定檢測樣品陽性的百分比，應(yīng)用對照組曲線同試驗組曲線交叉法，即以交叉點為界，分別應(yīng)用正態(tài)分布函數(shù)計算出陽性組曲線覆蓋面積及對照組延伸到陽性組下的面積，以前者減去后者獲得的數(shù)據(jù)，即為陽性組所占比例。計算結(jié)果為陽性所占比例為80%，即重組干酪乳桿菌表達IBDV VP2 蛋白表達率為80%。

圖5 重組干酪乳桿菌的流式細胞檢測結(jié)果Fig.5 Fluorescence-activated cell sorter analysis of the recombinant protein

3 討論

IBDV 的基因工程亞單位疫苗是目前國內(nèi)外研究的熱點。在過去的30年里，已經(jīng)報道了多種重組的表達體系表達VP2 蛋白，IBDV 的衣殼蛋白VP2蛋白攜帶有病毒主要的中和性抗原表位[7]。目前已經(jīng)有多種不同的表達系統(tǒng)獲得應(yīng)用，如大腸桿菌、酵母菌、禽痘病毒、桿狀病毒、塞姆利基森林病毒等[8]，甚至是植物表達系統(tǒng)[9]。在一些研究中應(yīng)用重組的VP2蛋白進行免疫，一些甚至可以提供100%的保護。迄今為止，已有三種基于重組VP2 蛋白的表達系統(tǒng)制備亞單位疫苗在一些國家已經(jīng)投放市場，分別為桿狀病毒、大腸桿菌和畢赤酵母菌[10]。這些都充分證明了利用IBDV 的VP2 蛋白制備亞單位疫苗的可行性。

該研究構(gòu)建了pLA-VP2 重組質(zhì)粒，應(yīng)用干酪乳桿菌（Lactobacillus casei，LAB）表達雞傳染性法氏囊病毒B87 株VP2 蛋白，將VP2 蛋白展示在干酪乳桿菌表面。質(zhì)粒pLA 是一種穿梭質(zhì)粒，它既可以在大腸桿菌中復(fù)制，又可以在乳酸菌中復(fù)制。在位于HCE啟動子下游，第238～251 序列編碼一種名叫pgsA 的錨釘?shù)鞍?，它具有將外源基因錨釘在細胞表面的作用。pgsA 穿插在乳酸菌的細胞壁上，外源蛋白通過N端與pgsA 相連，從而錨釘在菌體表面。在研究中構(gòu)建的pLA-VP2 重組質(zhì)粒，就是利用干酪乳桿菌表達系統(tǒng)表達pgsA-VP2 融合蛋白，外源蛋白VP2 被pgsA 錨釘在菌體上，使得VP2 蛋白成功展示在菌體表面。

Western Blot 檢測重組蛋白VP2，結(jié)果顯示重組干酪乳桿菌表達的VP2 蛋白可以與IBDV 多抗血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，證明構(gòu)建的重組干酪乳桿菌表達的VP2 蛋白結(jié)構(gòu)與天然抗原結(jié)構(gòu)相似，具有較好的反應(yīng)原性。乳酸菌表達外源蛋白分兩種情況：分別為菌內(nèi)表達和菌體表面表達。蛋白如果在菌體內(nèi)部表達，抗體無法進入菌體內(nèi)部與蛋白結(jié)合，熒光無法標(biāo)記在蛋白上，經(jīng)過流式細胞儀時，熒光無法被檢測器捕捉；蛋白在菌體表面表達，經(jīng)熒光（FITC）標(biāo)記二抗處理過的干酪乳桿菌表面就會帶有熒光，即被流式細胞儀的散射光檢測器捕捉，產(chǎn)生熒光信號；此外pLA-VP2 重組菌熒光強度高于pLA 菌對照組，這些都充分證明了VP2 已成功展示在干酪乳桿菌表面。研究為IBDV 基因工程亞單位疫苗的研制又提供了一個可行性的表達系統(tǒng)。

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