用RP-HPLC法測(cè)定愈腸顆粒中小檗堿和異白茅苷的含量

楊帝順，顧 清，馬曉娟，章 玥，劉繼勇*

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200120;2.上海市閘北區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，上海 200070；3.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433)

愈腸顆粒是第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院治療急慢性結(jié)腸炎的特色院內(nèi)制劑，該方選擇薏苡仁、黨參、白豆蔻、黃柏、紅藤、烏藥、羌活、烏梅、赤石脂等9味中藥配伍而成，具健脾益氣、澀腸止瀉的功效。愈腸顆粒原有的質(zhì)控方法比較落后，僅對(duì)處方中黃柏藥材進(jìn)行薄層色譜定性鑒別，無(wú)定量指標(biāo)。因此，本研究根據(jù)處方的功效，選擇黃柏藥材中的小檗堿和烏梅藥材中的異白茅苷(亦名異歐前胡素)等有效成分作為定量指標(biāo)，采用RP-HPLC法測(cè)定愈腸顆粒中小檗堿和異白茅苷的含量，并對(duì)其方法學(xué)進(jìn)行考察，以期為愈腸顆粒的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供新的依據(jù)和方法。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 SPD-10AVP高效液相色譜儀、UV-2201紫外分光光度儀(日本島津制作所)；AG285十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；FA-2004萬(wàn)分之一電子天平(上海天平儀器廠)；DL-180A超聲波清洗器、DL-720A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)。

1.2 試劑和藥品 小檗堿對(duì)照品(純度>99.8%，批號(hào)110713-200911)；異白茅苷對(duì)照品 (純度>99.6%，批號(hào)110827-201109，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；愈腸顆粒(第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院制劑室自制,批號(hào) 201211023、201211112、201211131、201212117)；甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Tedia公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液的配制 (1)對(duì)照品溶液：精密稱取小檗堿對(duì)照品10 mg，異白茅苷對(duì)照品2 mg，分別置于100 ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻制成含小檗堿100 μg/ml、異白茅苷20 μg/ml的儲(chǔ)備液,置于4 ℃冰箱保存。(2)樣品溶液：精密稱取愈腸顆粒500.6 mg置100 ml容量瓶中，加入40 ml甲醇，稱定重量，超聲提取15 min，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取濾液，即得小檗堿樣品溶液。精密稱取愈腸顆粒502.2 mg置100 ml容量瓶中，加50 ml甲醇，余同愈腸顆粒。過(guò)濾，取濾液，用恒溫水浴鍋揮盡溶劑，加入50 ml蒸餾水溶解殘?jiān)?，用乙醚萃?次,每次30 ml。合并萃取液，用氮?dú)獯蹈扇軇?，用甲醇?fù)溶，移至10 ml容量瓶中用甲醇定容，溶液用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取濾液，即得異白茅苷樣品溶液[1,2]。

2.2 色譜條件和系統(tǒng)適用性 色譜柱： Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；小檗堿流動(dòng)相：乙腈-0.035 mol/L磷酸二氫鈉(40∶60),異白茅苷流動(dòng)相：乙腈-0.05mol/L乙酸(用三乙胺調(diào)節(jié)pH至5.0)(52∶48)；檢測(cè)波長(zhǎng)：小檗堿265 nm，異白茅苷310 nm；流速：1.0 ml/min。取上述小檗堿、異白茅苷對(duì)照品溶液和樣品溶液各20 μl，按上述色譜條件分別進(jìn)樣，得到色譜圖，見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，小檗堿與異白茅苷的出峰時(shí)間分別為8.5、31.2 min。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密量取小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 ml，異白茅苷對(duì)照品儲(chǔ)備液0.05、0.25、0.5、1、2.5、5、10 ml分別置于10 ml容量瓶中,用甲醇稀釋定容，得到系列濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 μg/ml的小檗堿對(duì)照品溶液以及濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/ml的異白茅苷對(duì)照品溶液。按2.2項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取上述對(duì)照品溶液20 μl進(jìn)樣，測(cè)定并記錄峰面積(A)。以小檗堿、異白茅苷的濃度(c)為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積(A)為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A小檗堿=80 910c+29 730,r=0.999 9 (n=7)；A異白茅苷=64 017c-1 896.2,r=0.999 9(n=7)。結(jié)果表明，小檗堿、異白茅苷分別在1.0～60.0 μg/ml、0.1～20.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 小檗堿和異白茅苷的HPLC譜圖

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 分別取低、中、高3種濃度(小檗堿1.0、10.0、60.0 μg/ml；異白茅苷5.0、10.0、20.0 μg/ml)的對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，兩次進(jìn)樣間隔4 h，連續(xù)測(cè)定3 d，記錄峰面積，計(jì)算得低、中、高濃度小檗堿的日內(nèi)RSD分別為1.31%、1.97%和0.7%(n=3)，異白茅苷的日內(nèi)RSD分別為0.59%、0.48%和1.31%(n=3)。低、中、高濃度小檗堿的日間RSD分別為1.66%、0.84%和0.38%(n=3)；異白茅苷的日間RSD分別為0.26%、0.34%和0.36%(n=3)。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批(批號(hào) 201211023)的樣品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10 h測(cè)定其峰面積，計(jì)算相應(yīng)的RSD，小檗堿的RSD為1.58%,異白茅苷的RSD為0.74%。表明樣品溶液在配制后10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取小檗堿濃度為10.0 μg/ml，異白茅苷濃度為10.0 μg/ml的對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄其峰面積，并計(jì)算RSD。小檗堿的RSD為1.42%(n=6)，異白茅苷的RSD為0.80%(n=6)，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取3份2.1(2)項(xiàng)下樣品溶液各2 ml分別置于10 ml容量瓶中，再分別精密加入5 μg/ml的小檗堿對(duì)照品溶液1、2、5 ml；分別加入2 μg/ml的異白茅苷對(duì)照品溶液0.5、1、2 ml于相應(yīng)的容量瓶中，用甲醇定容，配成低、中、高3種不同濃度的加樣待測(cè)樣品溶液，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到低、中、高濃度小檗堿和異白茅苷的回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率的測(cè)定結(jié)果

2.8 樣品含量測(cè)定 取批號(hào)為201211112、201211131、201212117的3批愈腸顆粒，按照2.1(2)項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到愈腸顆粒中小檗堿、異白茅苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 愈腸顆粒中小檗堿和異白茅苷的含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

愈腸顆粒原質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)采用薄層色譜法定性鑒別，無(wú)定量指標(biāo)。因此選取其中有效成分小檗堿、異白茅苷作為考察指標(biāo)，測(cè)定愈腸顆粒中小檗堿、異白茅苷的含量。取小檗堿和異白茅苷對(duì)照品溶液，用紫外分光光度儀進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,小檗堿和異白茅苷分別在265、350、365 nm和250、309、310 nm處有較大吸收。根據(jù)文獻(xiàn)[3-6]及預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇265和310 nm分別作為小檗堿和異白茅苷的檢測(cè)波長(zhǎng)。對(duì)流動(dòng)相為甲醇-水系統(tǒng)、甲醇-0.06%磷酸水溶液系統(tǒng)、甲醇-0.05 mol/L冰乙酸系統(tǒng)、乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)、乙腈-0.05 mol/L冰乙酸系統(tǒng)及乙腈-水等系統(tǒng)進(jìn)行了比較。經(jīng)過(guò)檢測(cè)，小檗堿和異白茅苷的最大吸收峰出現(xiàn)時(shí)間不同，并且兩者的極性相差較大，在同一流動(dòng)相中要用較長(zhǎng)時(shí)間才能分離，不便于生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。因此，選擇乙腈-0.05 mol/L乙酸(用三乙胺調(diào)節(jié)pH至5.0)(52∶48)系統(tǒng)、乙腈-0.035 mol/L的磷酸二氫鈉水溶液(40∶60)系統(tǒng)分別作為流動(dòng)相檢測(cè)異白茅苷和小檗堿[7,8]?？疾鞓悠返奶崛》椒ê吞崛∪軇r(shí)選擇甲醇作為溶劑，超聲提取。異白茅苷在樣品中含量較低，不易直接超聲提取，因此在超聲提取的基礎(chǔ)上蒸干溶劑再二次溶解萃取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在所采用的色譜條件下，甲醇作為提取溶劑并以超聲提取的方法，樣品分離完全、峰形較好，且操作簡(jiǎn)便。

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