溫控型胰島素液體緩釋肛門栓體外釋放研究

楊文慧，肖秋生，姜宗文，張 肅，宋海艷， 王殿榮 (.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林 延吉000；.解放軍08醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 00；.浩特陶海牧場(chǎng)獸醫(yī)站，內(nèi)蒙古 海拉爾 0000)

胰島素是目前用于治療糖尿病最常用的藥物，臨床上主要用于治療1型糖尿病(即胰島素依賴型糖尿病)，在患者口服降糖藥無(wú)效、過(guò)敏或病情加重條件下可作為治療2型糖尿病(即非胰島素依賴型糖尿病)而選擇的藥物[1]。因?yàn)橐葝u素的特殊性質(zhì)不宜口服給藥只能注射給藥，給患者帶來(lái)了較大的不便和痛苦。

本試驗(yàn)研究采用溫控型胰島素液體緩釋肛門栓給藥新劑型，劑型以液體的形式進(jìn)入直腸后，在生理溫度下迅速由液體變?yōu)榘牍腆w凝膠態(tài)，固定在給藥部位，可以有效地避免肝臟首過(guò)效應(yīng)，提高藥物的生物利用度[2]。筆者采用高效液相色譜法建立溫控型胰島素液體緩釋肛門栓的含量測(cè)定的方法，并對(duì)其體外釋放機(jī)制進(jìn)行研究，以改善糖尿病患者的治療方式和治療效果。

1 儀器與試藥

LC-10AVT高效液相色譜儀，SPD-10AV紫外檢測(cè)器(日本島津)，N-2000雙道色譜工作站(浙江大學(xué)智能信息工程研究所)，AT-130柱溫箱(天津市鑫州科技有限公司)，pHs-3C精密酸度計(jì)(上海虹益儀器儀表有限公司)，微量電子天平CP225D(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，電磁攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)，THZ-82水浴恒溫振蕩器(金壇市華城創(chuàng)威實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

胰島素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：5048708，27 u/mg，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，胰島素原料藥(批號(hào)：1112A05，1203A10，1207A09，徐州萬(wàn)邦金橋制藥有限公司)，泊洛沙姆407(批號(hào)：20111101，南京威爾化工有限公司)，泊洛沙姆188(批號(hào)：20110506，南京威爾化工有限公司)，殼聚糖(批號(hào)：20110316，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，尼泊金乙酯(天津市華東試劑廠，批號(hào)：20111117)。甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

牛腸、羊腸購(gòu)于內(nèi)蒙古呼倫貝爾。

2 方法與結(jié)果

2.1方法 溫控型胰島素液體緩釋肛門栓處方制備：本試驗(yàn)的凝膠基質(zhì)選用的是泊洛沙姆407和泊洛沙姆188，秤取泊洛沙姆407 7.5 g，泊洛沙姆188 12.5 g，加入適量的水溶解，邊加邊攪拌，放置過(guò)夜；秤取殼聚糖200 mg，胰島素175 mg，用適量2%的醋酸溶解，加入到泊洛沙姆溶液中，邊加水邊攪拌，加入0.05%尼泊金乙酯，將混合液放置于冰箱中10～12 h，使其充分水化，除去氣泡，調(diào)節(jié)pH值，再加入適量的水，使其成50 g溶液。

2.2含量測(cè)定

2.2.1色譜條件 Welch ultimate C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：0.2 mol/L硫酸鹽緩沖液(取無(wú)水硫酸鈉28.4 g，加水溶解后，加磷酸2.7 ml，乙醇胺調(diào)pH至2.3加水至1 000 ml)-乙腈(74:26)；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；柱溫：40 ℃；流速：1 ml/min，進(jìn)樣量20 μl[3]。

2.2.2系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密取胰島素對(duì)照品適量，加0.01 mol/ml鹽酸溶液制成每1ml約含40 U的對(duì)照品溶液，室溫放置24 h后，取20 μl注入高效液相色譜儀內(nèi)，記錄色譜圖(胰島素峰相對(duì)保留時(shí)間約為7.732 min)，理論塔板數(shù)為6 610，見(jiàn)圖1。

2.2.3線性關(guān)系考察 精密稱取胰島素對(duì)照品13.8 mg，用0.01 mol/L鹽酸溶液制成濃度為40.0 U/ml的儲(chǔ)備液。分別精密量取上述儲(chǔ)備液液，加入0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋濃度分別為1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0 U/ml的一系列溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件取20 μl注入高效液相色譜儀，記錄峰面積；以胰島素濃度(U/ml)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=2×105X+690 136，r=0.999 1。結(jié)果表明：胰島素在1.0～40.0 U/ml范圍內(nèi)與其峰面積呈較良好的線性關(guān)系。

圖1 溫控型胰島素液體緩釋肛門栓胰島素對(duì)照品

2.2.4精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液(40 U/ml)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取20 μl進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得胰島素主峰面積的RSD為0.32%，表明儀器精密度良好。

2.2.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(40 U/ml)，室溫放置，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取20 μl進(jìn)樣，分別在24、36、48 h進(jìn)樣分析，結(jié)果RSD為0.84%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(40 U/ml)6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定峰面積，結(jié)果測(cè)得胰島素峰面積的RSD為1.08%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.7加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品溶液1 ml共9份，置10 ml容量瓶中，分別加入3種不同濃度胰島素對(duì)照品溶液，加0.01 mol/L的鹽酸稀釋到刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件取20 μl注入色譜儀，計(jì)算回收率，平均回收率(n=9)98.81%，RSD為1.15%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

2.2.8樣品含量測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)的樣品1 ml加入0.01 mol/L的鹽酸稀釋至10 ml，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件及供試品溶液制備的方法，每個(gè)批號(hào)的樣品連續(xù)進(jìn)樣3次，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3批溫控型胰島素原位凝膠肛門液體栓含量

3 體外藥物釋放的考察

3.1無(wú)膜溶出法 采用無(wú)膜溶出模型研究溫控型胰島素液體緩釋肛門栓的溶蝕動(dòng)力學(xué)，同時(shí)考察藥物的體外釋藥機(jī)制[4]。稱取20 g胰島素原位凝膠液體栓劑加入到已知重量的100 ml燒杯中，置于(36±0.5)℃的水浴恒溫振蕩器中，預(yù)熱20 min使溶液完全形成凝膠。加入生理鹽水(36 ℃)2 ml作為釋放介質(zhì)，小心操作注意保持凝膠的表面完整，在恒溫水浴振蕩器(100 r/min)中振蕩20 min[5]，然后將釋放介質(zhì)傾倒出來(lái)，用濾紙把燒杯外及凝膠表面擦干，并迅速稱重記錄，再加入生理鹽水2 ml，再放入到水浴恒溫振蕩器中振蕩20 min，依照上法反復(fù)操作8次[6]。相鄰時(shí)間點(diǎn)的樣品的重量之差為凝膠溶蝕量[7]。以凝膠累積溶蝕百分率對(duì)時(shí)間作圖，得到凝膠溶蝕曲線，見(jiàn)圖2。上述試驗(yàn)重復(fù)3次，RSD為0.35%。

圖2 溫控型胰島素液體緩釋肛門栓凝膠溶蝕曲線

將以上得到的釋放介質(zhì)用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取20 μl注入HPLC分析，測(cè)定藥物濃度，上述試驗(yàn)重復(fù)3次，RSD為0.20%。以藥物累積釋放率對(duì)時(shí)間作圖，得到藥物釋放曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 溫控型胰島素液體緩釋肛門栓累積釋放率曲線

結(jié)果表明，藥物的溶蝕方程為A=0.4587t+8.487 3(r=0.992 9)；藥物的體外釋放方程為Q=0.495 4t-2.611 8(r=0.997 7)?？芍獪乜匦鸵葝u素液體緩釋肛門栓在無(wú)膜釋放模型中藥物是通過(guò)溶蝕作用進(jìn)入人體的。

3.2牛腸黏膜釋放研究 牛腸黏膜的制備：將剛宰殺的牛腸取出，切開牛腸，用鑷子將覆蓋在牛腸黏膜上的脂肪剔除，小心的將腸膜剝離出來(lái)，用生理鹽水清洗干凈，平整的放在錫箔紙上包好，于-15℃冷凍保存。

采用Franz擴(kuò)散池(自制裝置)，供給室與接受池的容積均為7.5 ml，擴(kuò)散面積為0.97 cm2，接受池內(nèi)加入36 ℃的生理鹽水，將牛腸黏膜的黏膜層向上固定在供給室與接受池之間，置于溫度為(36±0.5)℃的恒溫水浴振蕩器中平衡20 min，取溫控型胰島素原位凝膠肛門液體栓200 μl均勻覆蓋在牛腸黏膜上。分別在15、30、45、60、90、120、180、240、300、360 min從接收池取樣200 μl，每次取樣后補(bǔ)加等量的36℃的釋放介質(zhì)，將以上得到的樣品用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)供HPLC分析，測(cè)定藥物濃度，計(jì)算累積釋放量，以累計(jì)釋放率對(duì)時(shí)間作圖[8]，見(jiàn)圖4。上述試驗(yàn)重復(fù)3次，RSD為0.79%。

圖4 溫控型胰島素液體緩釋肛門栓

得出的數(shù)據(jù)分別用Higchui方程、Ritger-Peppas方程、Hixson-Crowell方程進(jìn)行擬合結(jié)果列于見(jiàn)表3。結(jié)果表明：牛腸黏膜的最佳曲線擬合：(1-Q)1/3=0.001 6t+2.927 4(r= 0.975 6)，符合Hixson-Crowell方程。在使用牛腸黏膜進(jìn)行體外釋放研究時(shí)藥物是通過(guò)溶蝕方式釋放的。

表3 溫控型胰島素液體緩釋肛門栓牛腸黏膜體外釋放曲線擬合

3.3羊腸黏膜釋放研究 羊腸黏膜的制備：將剛宰殺的羊取出腸管并切開，用鑷子將覆蓋在羊腸黏膜上的脂肪剔除，小心的將腸膜剝離，用生理鹽水清洗干凈，平整的放在錫箔紙上包好，于-15 ℃冷凍保存。

采用Franz擴(kuò)散池(自制裝置)，供給室與接受池的容積均為7.5 ml，擴(kuò)散面積為0.97 cm2，接受池

內(nèi)加入36 ℃的生理鹽水，將羊腸黏膜的黏膜層向上固定在供給室與接受池之間，置于溫度為(36±0.5) ℃的恒溫水浴振蕩器中平衡20 min，取溫控型胰島素原位凝膠肛門液體栓200 μl均勻覆蓋在羊腸黏膜上。分別在15、30、45、60、90、120、180、240、300、360 min從接收池取樣200 μl，每次取樣后補(bǔ)加等量的36 ℃的釋放介質(zhì)，將以上得到的樣品用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)供HPLC分析，測(cè)定藥物濃度，計(jì)算累積釋放量，以累計(jì)釋放率對(duì)時(shí)間作圖，見(jiàn)圖5。上述試驗(yàn)重復(fù)3次，RSD為0.55%。

圖5 溫控型胰島素液體緩釋肛門栓

得出的數(shù)據(jù)分別用Higchui方程、Ritger-Peppas方程、Hixson-Crowell方程進(jìn)行擬合見(jiàn)表4。結(jié)果表明：羊腸黏膜釋放的最佳曲線擬合：lnQ=0.878 3lnt-4.931 1 (r=0.970 5)，符合Ritger-Peppas方程，在使用羊腸黏膜進(jìn)行體外釋放研究時(shí)藥物是通過(guò)擴(kuò)散與溶蝕相結(jié)合的方式釋放的。

表4 溫控型胰島素液體緩釋肛門栓羊腸黏膜體外釋放曲線擬合

4 討論

通常直腸缺乏規(guī)律性的蠕動(dòng)，直腸內(nèi)的液體的量在2～3 ml，pH值7.3左右[9]。本試驗(yàn)自制了簡(jiǎn)易的模擬裝置，模擬凝膠在直腸環(huán)境下逐漸溶蝕和擴(kuò)散的過(guò)程，研究凝膠在人體內(nèi)的釋放。 試驗(yàn)還證實(shí)，通過(guò)計(jì)算藥物累積釋放率可以得出本凝膠有一定的緩釋作用。

本試驗(yàn)利用無(wú)膜釋放試驗(yàn)考察溫控型胰島素液體緩釋肛門栓的溶蝕過(guò)程，藥物是通過(guò)擴(kuò)散作用進(jìn)入人體的，并不是因?yàn)槟z的溶蝕作用；采用生物膜(牛腸黏膜和羊腸黏膜)釋放是為了模擬人腸黏膜對(duì)藥物的吸收情況，采用多種回歸方法進(jìn)行擬合，Higchui方程是反映擴(kuò)散機(jī)制的，Ritger-Peppas方程是驗(yàn)證機(jī)制的，Hixson-Crowell方程是反映溶蝕機(jī)制的，擬合后可知凝膠中的藥物主要是通過(guò)溶蝕和擴(kuò)散方式釋放的。溫控型胰島素液體緩釋肛門栓的藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)還有待進(jìn)一步研究。

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