抗腫瘤多肽蜂毒素的固相合成

李文娟，李任武，吳茂誠，王傅喆，秦麗萍，李 柏，胡宏崗 (.煙臺大學藥學院，山東 煙臺 264005；2.第二軍醫(yī)大學，a.藥學院有機化學教研室，b.長海醫(yī)院中醫(yī)系，上海 200433)

蜂毒作為一味傳統(tǒng)中藥用于治療疾病由來已久，對自身免疫性疾病亦有較好的療效。蜂毒素作為蜂毒主要組成成分越來越受到人們的重視。近年來，有關蜂毒及其蜂毒素抗腫瘤的機制研究取得了新進展[1, 2]。國外早有研究報道認為，蜂毒素能夠影響多種細胞信號通路，可能是一種新型抗腫瘤先導化合物[3, 4]。蜂毒素由26個氨基酸殘基構(gòu)成, 氨基酸殘基組成為: Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2, 相對分子質(zhì)量為2 846 u。國內(nèi)外有關蜂毒素的全合成途徑未曾有文獻報道，本實驗室首次通過固相逐步合成法對直鏈二十六肽蜂毒素的合成工藝進行研究。

1 儀器和試劑

1.1儀器 恒溫磁力攪拌器(上海志威電器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(LOOYE ZX98-1);水浴鍋(LOOYE ZX98-1) ;2ZX-4型旋片真空泵(上海豫康科教儀器設備有限公司) ;低溫冷卻循環(huán)泵(上海豫康科教儀器設備有限公司);循環(huán)水式多用真空泵SHB-IIIA(上海豫康科教儀器設備有限公司); ZF7B三用紫外分析儀(上海康化生化儀器制造廠)。

1.2試劑 Fmoc-氨基酸、Wang樹脂、N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、1-羥基苯并三氮唑( HOBt )、三氟乙酸( TFA)、N,N-二異丙基乙基胺( DIPEA )、三氟乙醇(TFE)均 購自上海吉爾生化有限公司；茚三酮、哌啶、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷( DCM)、N-甲基吡咯烷酮( NMP )均為市售分析純試劑；乙腈為色譜純(J﹠K)。

2 合成實驗

2.1蜂毒素的固相逐步合成 蜂毒素的化學合成采用Fmoc固相合成法，由羧基端向氨基端方向合成。合成工藝如下：將0.5 g Wang 樹脂(0.8 mmol/g)、Fmoc-氨基酸、DIPEA(0.6 mmol)、DCM(20 ml)加入到多肽固相合成反應器中, 振蕩反應2 h，隨后用10 ml 哌啶:DMF(1:4)脫除氨基保護基Fmoc。隨后，依次將樹脂和下一氨基酸的活化酯進行反應，使用的活化試劑為HOBt/DCC(1.2 mmol/ 1.2 mmol)，反應溶劑為NMP(10ml)、DCM(10 ml)，室溫下震蕩反應?？s合過程中采用茚三酮定性顯色監(jiān)測反應進程。使用切割試劑(TFA-DCM=(19:1)(V/V) 將目標多肽從樹脂上裂解下來，同時除去側(cè)鏈保護基。溶液經(jīng)濃縮后即得到蜂毒素粗品。

2.2蜂毒素的分析純化

2.2.1蜂毒素粗品的純化 蜂毒素粗品通過反相制備液相進行純化。色譜條件：島津公司LC-6A制備液相色譜儀。色譜柱：ODS C18柱(20 mm×250 mm, 5 μm)。流動相A為0.1% TFA/水，流動相B為0.1%TFA/乙腈，梯度洗脫：20%B(25 min)→80%B(5 min)→100%B(5 min)，流速10 ml/min，檢測波長220 nm, 進樣量200 μl。凍干后得到的純品為白色固體粉末，收率為32%。HR-Q-TOF-MS：m/q[M+4H+] /4 712.450 5。

2.2.2蜂毒素粗品的HPLC純度測定 蜂毒素粗品經(jīng)純化后，分析終產(chǎn)物的純度。色譜條件：SPD-M20A型高效液相色譜儀(日本島津公司) 。色譜柱: ODS C18柱( 4.6 mm×150 mm, 5 μm, 100 A, Hypersil)。流動相A為0.1% TFA/水，流動相B為0.1%TFA/乙腈，梯度洗脫20%B(25 min)→80%B(5 min)→100%B(5 min), 流速1 ml/min，檢測波長220 nm, 進樣量20 μl。經(jīng)測定，本法所制備蜂毒素的純度>97 %(圖1)。

圖1 蜂毒素RP-HPLC純度檢測

3 結(jié)果與討論

3.1樹脂的選擇 固相合成主要基于：所要合成肽鏈的未端氨基酸的羥基以共價鍵的結(jié)構(gòu)同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上氨基酸作為氨基組分，經(jīng)過脫去氨基保護基，并同過量的活化羥基組分反應接長肽鏈。重復操作(縮合→洗滌→去保護→中和、洗滌→下一輪縮合)，達到所要合成的肽鏈長度；最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。將固相合成與其他技術(shù)分開來的唯一特征是固相載體。固相載體并不是萬能的，需根據(jù)實際情況選擇使用。本實驗在蜂毒素的合成中采用了Wang樹脂。該樹脂滿足了以下條件：首先，肽鏈和樹脂的反應位點最終可以形成蜂毒素中的酰胺結(jié)構(gòu)；其次，Wang樹脂對合成過程中的物理和化學條件穩(wěn)定，而且可以在不斷增長的肽鏈和試劑之間快速、不受阻礙地接觸。

3.2縮合劑的使用 常用的氨基酸縮合體系有DCC-HOBt、DIC-HOBt、HATU-DIPEA、HBTU-DIPEA、PyBOP-DIPEA等。本實驗中，筆者選擇DCC-HOBt體系進行氨基酸縮合，主要基于以下兩點理由：首先，DCC是一種廉價的縮合劑，易溶于有機溶劑，可使氨基酸在短時間內(nèi)完成縮合；其次，DCC縮合的副產(chǎn)物DCU不溶于反應溶劑，易通過過濾除去。

3.3側(cè)鏈保護基的除去 本研究選擇了不同比例的TFA-DCM溶液(25%、50%、75%和90%)對樹脂上的蜂毒素進行游離和保護基的脫除，最終確定了90%TFA-DCM溶液的樹脂游離和保護基脫除體系。在此條件下，不僅能將多肽直接從樹脂上切下，并同時將側(cè)鏈保護基完全脫除。

4 結(jié)論

研究蜂毒素固相合成方法，它以Wang樹脂為固相載體；HOBt/DCC 為縮合劑； NMP/DCM為反應溶劑；肽鏈從樹脂上切下后采用90%TFA除去側(cè)鏈保護基。該條件下合成的蜂毒素, 收率達32%，通過RP-HPLC分析其純度>97%，能夠滿足藥理學實驗研究所需。本合成方法具有可行性, 操作簡便、總收率高等特點，適用于各種長鏈多肽的合成。

【參考文獻】

[1] Huh JE, Kang JW, Nam D,etal. Melittin suppresses VEGF-A-induced tumor growth by blocking VEGFR-2 and the COX-2-mediated MAPK signaling pathway[J]. J Nat Prod,2012, 75(11), 1922-1929.

[2] 高啟龍, 李寒冰, 姚亞民, 等. 蜂毒素(Mel)對裸鼠骨肉瘤的抑制作用與影響腫瘤血管生成、細胞增殖和凋亡的關系[J]. 復旦學報：醫(yī)學版, 2012, 39 (03): 283-288.

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[4] Liu S, Yu M, He Y,etal. Melittin prevents liver cancer cell metastasis through inhibition of the Rac1-dependent pathway[J]. Hepatology, 2008, 47(6), 1964-1973.