米格列奈鈣片健康人體藥動(dòng)學(xué)研究

惲蕓蕾，高守紅，樊成輝，繆海均(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200003)

米格列奈是繼瑞格列奈、那格列奈后第3個(gè)格列奈類藥物，是苯丙氨酸的衍生物。米格列奈的作用機(jī)制類似于磺酰脲，但用藥后的起效速度比磺酰脲快；而且該藥的作用持續(xù)時(shí)間不長，僅降低糖尿病患者用餐后血糖過高而避免持續(xù)降糖引發(fā)的血糖過低，其具有半衰期短、安全性高、體內(nèi)無蓄積等特點(diǎn)[1,2]。該藥通過關(guān)閉胰腺β細(xì)胞膜上的ATP依賴性K+通道，造成Ca2+內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加而使細(xì)胞內(nèi)含胰島素的囊泡脫粒，從而刺激胰島素的分泌。國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，米格列奈血藥濃度測定方法主要有LC-UV、LC-MS、HPLC和LC-MS/MS法[3-8]。本研究參考了相關(guān)文獻(xiàn)，建立了測定血漿中米格列奈鈣濃度的LC-MS/MS法，并用于健康受試者口服米格列奈鈣后體內(nèi)血藥濃度測定和藥動(dòng)學(xué)研究，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1儀器 Agilent 6410A型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，包括Agilent 1200 G1311A四元泵、G1322A真空脫氣機(jī)、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱。使用的儀器還有MassHunter軟件控制系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理器(美國Agilent公司)；XW-01定時(shí)可調(diào)速旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)和北利DT5-3低速臺(tái)式離心機(jī)；Sartorius BP211D(德國賽多利斯)。

1.2藥品與試劑 米格列奈片(上海秀龍中藥有限公司，規(guī)格：5 mg/粒)。內(nèi)標(biāo)為格列齊特(Sigma公司)。甲醇、乙腈(德國Merck公司，色譜純)，醋酸銨(美國天地公司，色譜純)，乙酸乙酯、正己烷(CALEDON公司，色譜純)，純凈水，鹽酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3色譜條件 色譜柱(迪馬公司)：Dikma Inertsil ODS-3，2.1 mm×50 mm，5 μm；流動(dòng)相：甲醇-10 mmol/L醋酸銨(65:35)，流速0.25 ml/min，進(jìn)樣量10 μl，分析時(shí)間2.5 min；柱溫40 ℃。

1.4質(zhì)譜檢測條件 采用ESI離子源、正離子檢測，選擇MRM工作方式進(jìn)行一/二級(jí)質(zhì)譜分析。質(zhì)譜檢測工作參數(shù)如下：干燥氣溫度 350 ℃，干燥氣流速10 L/min，霧化氣壓力 35 psi，毛細(xì)管電壓4 000 V，MS1溫度 100℃，MS2溫度 100 ℃，毛細(xì)管出口電壓125 V，碰撞能量16。

用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z316.2→m/z298.2(米格列奈)，m/z324.2 →m/z126.9(內(nèi)標(biāo)格列齊特)。

1.5血漿樣品處理 取血漿200 μl置于10 ml具塞玻璃離心管內(nèi)，加入20 μl內(nèi)標(biāo)溶液(200 ng/ml)混勻，加入1 mol/L HCl 100 μl酸化，渦旋混合30 s，加入3 ml乙酸乙酯正己烷(98:2)提取液，渦旋混合3 min，于3 500 r/min離心10 min，吸取上清液于45 ℃離心濃縮儀氮?dú)饬飨麓蹈?，殘?jiān)眉状?水(55:45)100 μl溶解，于12 000 r/min高速離心10 min，吸取上清液10 μl進(jìn)樣，以米格列奈和內(nèi)標(biāo)的峰面積比，內(nèi)標(biāo)法定量分析。

1.6受試者 30例健康受試者(男、女各15名)，年齡(23.93±1.60)歲、身高(169.27±9.71)cm、體重(60.13±8.89)kg、體重指數(shù)均在19～24，女性尿妊娠試驗(yàn)均陰性，血常規(guī)、尿常規(guī)、糞常規(guī)、肝腎功能和心電圖等檢查均正常，無心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)的明確病史或其他顯著疾病，無藥物與食物過敏史，無煙、酒嗜好或?yàn)E用藥(毒)品史，篩選前2周內(nèi)未服用過其他藥物，入選前3個(gè)月內(nèi)未參加過其他藥物的臨床試驗(yàn)且無獻(xiàn)血史。受試者在試驗(yàn)前均簽署知情同意書。本臨床試驗(yàn)方案經(jīng)上海長征醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審核批準(zhǔn)，在試驗(yàn)過程中受其指導(dǎo)。

1.7試驗(yàn)設(shè)計(jì) 30例健康受試者隨機(jī)分成3組，每組10人，于正式試驗(yàn)前1 d入?、衿谂R床試驗(yàn)病房，隔夜禁食12 h后，空腹給藥。按不同劑量組分別每人口服米格列奈鈣片5、10、20 mg，用 50 g葡萄糖粉溶于200 ml的溫水中送服。服藥2 h后可以飲水，4 h 和10 h 后統(tǒng)一進(jìn)食清淡的午餐及晚餐。于給藥前(0 h)和給藥后5、10、15、20、30和45 min，1、2、3、4、6、8和10 h由肘靜脈取血4 ml，肝素抗凝，血樣3 000 r/min離心10 min，分離血漿于另一具塞試管中，于-20°C 冰箱中冷凍保存至測定。詳細(xì)記錄服藥時(shí)間、采樣準(zhǔn)確時(shí)間，臨床醫(yī)生及研究者隨時(shí)觀察藥物不良反應(yīng)(事件)并記錄。從開始進(jìn)入試驗(yàn)至試驗(yàn)結(jié)束，要求受試者禁煙、酒、茶、咖啡等，服藥后避免長時(shí)間靜臥或劇烈運(yùn)動(dòng)。

1.8數(shù)據(jù)處理 采用統(tǒng)計(jì)矩法計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，Cmax和tmax均采用實(shí)測值；AUC采用梯形面積法計(jì)算；λz為末端相消除速率常數(shù)，用末端相濃度對數(shù)與時(shí)間回歸直線求得；t1/2=0.693/λz。

2 結(jié)果

2.1方法的專屬性 將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)樣，在ESI 電離方式下進(jìn)行產(chǎn)物離子全掃描分析(圖1-A、1-B)；分別選擇性對m/z316.2(米格列奈)和m/z324.2(內(nèi)標(biāo)格列齊特)進(jìn)行產(chǎn)物離子全掃描分析(圖1-C、1-D)；米格列奈和內(nèi)標(biāo)格列齊特生成的主要碎片離子分別為m/z298.2和m/z126.9，將以上碎片離子作為定量分析時(shí)監(jiān)測的產(chǎn)物離子。在本試驗(yàn)的色譜條件下，米格列奈的保留時(shí)間約1.8 min，內(nèi)標(biāo)格列齊特的保留時(shí)間約1.3 min。

觀察了來自6份不同受試者的空白血漿，樣品和內(nèi)標(biāo)峰形良好，血漿中的雜質(zhì)不干擾樣品和內(nèi)標(biāo)峰檢測，本法具有較高的專屬性?？瞻籽獫{、米格列奈和內(nèi)標(biāo)、空白血漿中添加米格列奈和內(nèi)標(biāo)以及受試者服藥后的血漿樣本色譜圖見圖2。

圖1 米格列奈LC-MS/MS質(zhì)譜圖

圖2 米格列奈LC-MS/MS色譜圖

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低定量濃度 精準(zhǔn)配制含米格列奈1.0、2.0、10.0、20.0、100.0、200.0、1 000.0、2 000.0和4 000.0 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品。按上述血漿樣品預(yù)處理步驟操作，每種濃度各平行制作5份樣品，并進(jìn)行LC-MS/MS分析。以米格列奈對照品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值對相應(yīng)的濃度(μg/L)進(jìn)行加權(quán)(1/c2)線性回歸，得加權(quán)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=26.399 4c+0.020 5，r2=0.996 1(n=5)，線性范圍1.0～4 000.0 ng/ml。配制濃度1.0 ng/ml的樣品6份，進(jìn)行最低定量限檢測，結(jié)果為0.900±0.068，RSD為7.6%，說明本法測定血漿中米格列奈的最低定量限為1.0 ng/ml。

2.3精密度與準(zhǔn)確度 分別配制成相當(dāng)于米格列奈濃度為2.0、20.0、200.0 和2 000.0 ng/ml的血漿質(zhì)控樣品，按血漿樣品處理依法操作，進(jìn)行精密度試驗(yàn)。結(jié)果表明，米格列奈的上述4個(gè)濃度批內(nèi)及批間變異均<15%，測定的準(zhǔn)確度在85%～115%。

2.4回收率試驗(yàn) 取空白血漿，配制成相當(dāng)于米格列奈血漿濃度為2.0、20.0、200.0和2 000.0 ng/ml的血漿質(zhì)控樣品，按血漿樣品處理依法操作，同時(shí)配制相當(dāng)于米格列奈濃度為2.0、20.0、200.0和2 000.0 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品，按同法操作,計(jì)算方法回收率。4個(gè)濃度米格列奈血漿樣品回收率>90%(95.04%～96.17%)、RSD<5%(0.2%～2.0%)，表明該法的準(zhǔn)確性符合生物樣品分析要求。

2.5穩(wěn)定性考察和質(zhì)控 本試驗(yàn)考察了米格列奈血漿樣品經(jīng)樣品處理后室溫放置的穩(wěn)定性、血漿樣品經(jīng)歷3次冷凍與解凍循環(huán)穩(wěn)定性和血漿樣品長期冷凍條件下的穩(wěn)定性。配制米格列奈濃度為2.0、20.0、200.0和2 000.0 ng/ml的血漿質(zhì)控樣品，按血漿樣品前步驟同法操作，每一濃度水平進(jìn)行3樣本分析，結(jié)果處理后的血漿樣品室溫放置24 h、經(jīng)3次凍融試驗(yàn)、放置-20℃冰箱冷凍保存30 d后的穩(wěn)定性均良好。

2.6米格列奈鈣健康人體藥-時(shí)曲線和藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 3組健康受試者分別單次口服米格列奈鈣片5、10、20 mg的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖3，主要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)詳見表1。

圖3 受試者單次口服米格列奈鈣片后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

表1單次給藥后米格列奈的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

劑量組(mg)Cmax(ng /ml)tmax(h)AUC0～10(ng · h /ml)AUC0～∞(ng · h /ml)t1/2(h)5799.5±189.80.38±0.161 051.3±276.41 059.4±278.21.80±0.42101 689.8±348.40.43±0.162 324.5±481.82 342.8±488.61.68±0.37203 032.9±755.60.54±0.265 028.8±1 283.65 073.9±1 315.91.56±0.19

2.7安全性評(píng)價(jià) 整個(gè)藥試期間，受試者無嚴(yán)重不良反應(yīng)(事件)發(fā)生；經(jīng)物理檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查及心電圖檢查，均未發(fā)生有臨床意義的異常改變。

3 討論

本研究建立的血漿米格列奈鈣濃度LC-MS/MS測定方法，樣品經(jīng)液-液萃取后進(jìn)樣，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性高和精密度好等特點(diǎn)，適用于臨床藥動(dòng)學(xué)的研究。

因米格列奈的降血糖作用較弱，故在禁食12 h后給藥試驗(yàn)中用200 ml含50 g葡萄糖的溫水送服米格列奈，以避免低血糖反應(yīng)的發(fā)生。

健康受試者口服米格列奈鈣片后，具有口服吸收迅速、體內(nèi)代謝較快的特點(diǎn)；其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Cmax與AUC與給藥劑量呈正相關(guān)；其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[7,8]。

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