國產(chǎn)血竭總黃酮成分的純化及活性成分的含量測(cè)定

張明媛，宓鶴鳴,范國榮,陸 峰,亓云鵬 (.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海 200433；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院藥學(xué)部，福建 南平 353000)

國產(chǎn)血竭，亦稱龍血竭，為百合科植物劍葉龍血樹[Dranaenacochinchinensis(Lour.) S.C.Chen]的含脂木材經(jīng)提取得到的樹脂，被《本草綱目》譽(yù)為“活血圣藥”[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)中用于與血瘀證相關(guān)的冠心病、心絞痛、急性心肌梗死等疾病的治療[2-4]。研究表明，國產(chǎn)血竭總黃酮是其發(fā)揮活血化瘀作用的主要有效部位[5-7]，其中主要包含龍血素A、龍血素B、龍血素C等活性成分和其他雜質(zhì)。只有將其進(jìn)一步分離純化，并結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的指引，才有可能闡明國產(chǎn)血竭發(fā)揮活血化瘀作用的機(jī)制。大孔樹脂已被廣泛用于黃酮類成分等的提取和精制[8-12]，本研究采用D101型大孔樹脂對(duì)國產(chǎn)血竭總黃酮進(jìn)行分離純化，并采用高相液相色譜(HPLC)法測(cè)定國產(chǎn)血竭精制總黃酮中主要活性成分龍血素A、龍血素B的含量，從而為國產(chǎn)血竭黃酮類成分的分析及制備提供依據(jù)，并為研究國產(chǎn)血竭活血化瘀的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料和儀器

1.1藥材與試劑 國產(chǎn)血竭原料藥(產(chǎn)地：廣西)由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院宓鶴鳴教授提供并鑒定，龍血素A(批號(hào)111660-200402)、龍血素B(批號(hào)111558-200405)。對(duì)照品購自中國食品藥品檢定研究院，D101大孔樹脂由天津南開大學(xué)化工廠生產(chǎn)。其他試劑：乙腈(色譜純，上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司)，乙醇，乙酸乙酯，冰醋酸(分析純，上海試劑一廠)，去離子水(自制)。

1.2儀器 島津LC-10AT VP高效液相色譜儀，SPD-10A VP紫外檢測(cè)器，N2000色譜數(shù)據(jù)工作站(浙江大學(xué)智達(dá)公司)，電子天平(HA-202AM)，SENCO R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1國產(chǎn)血竭樣品溶液的制備 精確稱取國產(chǎn)血竭原料藥藥材40 g，加8倍量乙酸乙酯回流提取兩次，每次1 h，濾過，合并兩次產(chǎn)生的濾液，減壓濃縮成浸膏，60 ℃下減壓干燥，得31.03 g粗粉。稱取適量粗粉，加入95%乙醇至溶解，即得國產(chǎn)血竭樣品溶液。

2.2國產(chǎn)血竭總黃酮成分的純化 將預(yù)處理好的濕樹脂裝入玻璃層析柱，將2.1項(xiàng)中得到的國產(chǎn)血竭樣品溶液上柱，控制流速為1 ml/min。上樣完畢，靜態(tài)吸附1 h，之后依次用去離子水以及10%、30%、50%、70%和95%乙醇的順序洗脫，并采用HPLC法對(duì)收集得到的洗脫液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，龍血素A、龍血素B集中在70%和95%的乙醇洗脫液中，將該部分洗脫液合并，并于60 ℃下?lián)]干溶劑，即得國產(chǎn)血竭精制總黃酮。

2.3色譜條件及溶液制備 色譜柱：Shim-Pack VP-ODS (150 mm×4.6 mm，5 μm，江蘇漢邦科技有限公司)，流動(dòng)相為乙腈-1%冰醋酸=(34.5:65.5)，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長為280 nm，流速為1 ml/min，進(jìn)樣量為20 μl。

2.3.1對(duì)照品儲(chǔ)備液 分別精密稱取龍血素A、龍血素B對(duì)照品適量，置于10 ml量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成濃度分別為550 g/ml和1000 g/ml的龍血素A、龍血素B對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3.2供試品儲(chǔ)備液 稱取“2.2項(xiàng)”下制備得到的國產(chǎn)血竭精制總黃酮5.09 g置于10 ml量瓶中，用乙腈溶解并定容，得到濃度為509 mg/ml的供試品儲(chǔ)備液。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1專屬性考察 在“2.3項(xiàng)”色譜條件下，龍血素A、龍血素B對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間分別為32.040、34.773 min，理論塔板數(shù)均>6 000，兩者峰形良好且分離完全(分離度>1.5)，見圖1。

圖1 龍血素A、龍血素B對(duì)照品(a)及國產(chǎn)血竭總黃酮(b)的HPLC圖

2.4.2線性關(guān)系考察 精密量取龍血素A儲(chǔ)備液適量，分別配制成濃度為11.00、13.75，27.50、55.00、110.00、275.00 g/ml的溶液；精密量取龍血素B儲(chǔ)備液適量，分別配制成濃度為20.00、25.00、50.00、100.00、200.00、500.00 g/ml的溶液，在上述色譜條件下，分別測(cè)定待測(cè)組分的峰面積(Y)，并對(duì)濃度(C)進(jìn)行回歸分析，回歸方程為：龍血素A:Y=35 844C+44 726，r=0.999 9；龍血素B:Y=28 533C-41 085，r=0.999 9。結(jié)果表明龍血素A在11.00～275.00 g/ml，龍血素B在20.00～500.00 g/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3精密度實(shí)驗(yàn) 取上述龍血素A對(duì)照品溶液(110.00 g/ml)、龍血素B對(duì)照品溶液(200.00 g/ml)，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積，龍血素A、龍血素B色譜峰峰面積的日內(nèi)RSD分別為1.64%、1.40%；連續(xù)5 d重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)測(cè)定其峰面積，計(jì)算日間精密度(RSD)，龍血素A、龍血素B峰面積的日間RSD分別為1.47%、2.67%，說明本法精密度良好。

2.4.4加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已測(cè)得含量的國產(chǎn)血竭精制總黃酮供試品溶液適量，分別精密加入龍血素A、龍血素B對(duì)照品溶液適量，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，龍血素A、龍血素B的平均回收率分別為100.59%、98.90%，RSD分別為2.04%、2.88%(表1)。

2.4.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 稱取國產(chǎn)血竭精制總黃酮干燥粉末適量，精密稱定。加入少量乙腈超聲溶解，定容，搖勻，配制成濃度為5.10 mg/ml的溶液。分別于0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 h測(cè)定，龍血素A、龍血素B峰面積RSD分別為2.40%、2.61%，說明樣品溶液在7.5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6國產(chǎn)血竭精制總黃酮中龍血素A、龍血素B的含量測(cè)定 精確稱取5份國產(chǎn)血竭精制總黃酮粉末，配制成濃度約為5.10 mg/ml的溶液，按“2.3項(xiàng)”下的色譜條件測(cè)定上述溶液，分別記錄龍血素A、龍血素B的峰面積，并計(jì)算國產(chǎn)血竭精制總黃酮中龍血素A、龍血素B的含量。結(jié)果表明，龍血素A、龍血素B在國產(chǎn)血竭精制總黃酮中的平均含量分別為26.93 和25.53 mg/g (表2)。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表2 國產(chǎn)血竭精制總黃酮中龍血素A、龍血素B的含量

3 討論

3.1國產(chǎn)血竭樣品溶液的處理方法 由于大孔樹脂洗脫液從水相開始洗脫至有機(jī)相，故上樣溶液一般用水溶解。我們?cè)x用去離子水溶解國產(chǎn)血竭總黃酮粗粉，但溶解效果不佳，制備產(chǎn)率低，在洗脫過程中還會(huì)發(fā)生晶體析出堵塞閥門。根據(jù)樂薇[8]的文獻(xiàn)，筆者在pH=11.2的條件下調(diào)節(jié)上柱總黃酮濃度至3.64×10-3g/ml，溶解效果良好，但此條件需大量總黃酮樣品溶液，不適用于實(shí)際操作。本實(shí)驗(yàn)最終采用95%乙醇溶解國產(chǎn)血竭總黃酮粗粉，雖然在首次洗脫時(shí)會(huì)損失部分產(chǎn)物，但其產(chǎn)率仍較用水溶解總黃酮粗粉的產(chǎn)率高，操作也更為簡(jiǎn)便。

3.2色譜條件的選擇 文獻(xiàn)[13，14]選用270 nm或280 nm作為龍血素A、龍血素B含量測(cè)定的檢測(cè)波長，筆者發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)血竭總黃酮在280 nm處有較強(qiáng)吸收，故確定280 nm作為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長。有的文獻(xiàn)采用35%乙腈作為流動(dòng)相，但筆者發(fā)現(xiàn)在該條件下龍血素A、龍血素B峰不能很好分離，且存在拖尾現(xiàn)象；經(jīng)過摸索，筆者采用乙腈-1%冰醋酸(34.5:65.5)為流動(dòng)相，可使龍血素A、B兩峰得到較好分離，也抑制了拖尾峰的出現(xiàn)。

4 結(jié)語

大孔樹脂分離純化國產(chǎn)血竭中的黃酮類成分，操作簡(jiǎn)便，產(chǎn)率較高；同時(shí)建立了國產(chǎn)血竭精制總黃酮中龍血素A、B的HPLC測(cè)定方法。通過對(duì)傳統(tǒng)名貴藥材國產(chǎn)血竭的深入研究，同時(shí)為進(jìn)一步闡明國產(chǎn)血竭活血化瘀的作用機(jī)制提供重要依據(jù)。

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