葡萄籽原花青素B2磷脂復(fù)合物的制備研究

苗智如，徐超斗，陸 帥，蔣國軍 (.杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科,浙江 杭州 00;.總后衛(wèi)生部藥品儀器檢驗(yàn)所,北京 0007;.蕭山醫(yī)院藥劑科，浙江 蕭山 0)

原花青素是多種植物中富含的植物多酚類化合物，由于其獨(dú)特的生理保健功能，近年來倍受關(guān)注[1-7]。原花青素來源廣泛，在許多天然植物，如葡萄籽、沙棘、黑加侖等中廣泛存在。國外關(guān)于原花青素的生物活性研究較多，由于其極強(qiáng)的抗氧化活性，使原花青素成為近年來在抗癌、抗炎、抗氧化、抗輻射、抗突變、抗過敏、保護(hù)心血管以及護(hù)膚美容抗衰老等方面研究的熱點(diǎn)，它同時(shí)也是極具潛力的一種治療藥物。原花青素是一種由單體(主要是兒茶素、表兒茶素等)、低聚原花青素(單體的二、三、四聚合物體)和高聚原花青素(五聚體以上)組成的化合物。其中二聚體在各類原花青素中分布最廣、抗氧化活性最強(qiáng)，是最重要的一類。二聚體因2個(gè)單體的構(gòu)象或縮合鍵位不同，有多種異構(gòu)體，現(xiàn)已鑒定出8種異構(gòu)體，在這8種異構(gòu)體中原花青素B2是活性最強(qiáng)的一個(gè)二聚體。它的結(jié)構(gòu)式如下：

由于原花青素水溶性強(qiáng)，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)性能差，難以透過胃腸壁而被吸收進(jìn)入體循環(huán)；而且它在胃腸道中性質(zhì)不穩(wěn)定、易被降解，導(dǎo)致生物利用度很低。因而影響了原花青素B2口服制劑療效的發(fā)揮，限制了其在臨床上的使用。

磷脂復(fù)合物(phytosome)系指在非質(zhì)子傳遞體系溶劑中，藥物與磷脂以一定配比關(guān)系結(jié)合而形成的復(fù)合物，由藥物與磷脂[7-12]在非質(zhì)子溶劑中通過范德華力或氫鍵結(jié)合而成。天然活性成分與磷脂結(jié)合形成復(fù)合物后，常常表現(xiàn)出與原化合物顯著不同的理化性質(zhì)和生物特性，可以顯著提高水溶性藥物的脂溶性和穩(wěn)定性，改善其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)性能，進(jìn)而提高藥物的生物利用度；同時(shí)具有延緩釋藥，降低體內(nèi)消除速率等優(yōu)點(diǎn)。因此，磷脂復(fù)合物被認(rèn)為是改善中藥水溶性成分口服生物利用度的一種有效手段。

本研究擬制備葡萄籽原花青素磷脂復(fù)合物，并考察其中活性成分原花青素B2制成磷脂復(fù)合物后的脂水分配系數(shù)變化，為研究高生物利用度的葡萄籽原花青素制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

葡萄籽提取物為天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司產(chǎn)品，卵磷脂為上海太偉藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。UV1102型紫外分光光度計(jì)為上海天美科學(xué)儀器公司產(chǎn)品，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為上海申科儀器公司產(chǎn)品，XW-80型渦旋混合器為上海第一醫(yī)學(xué)儀器廠產(chǎn)品，TGL-16G型臺(tái)式高速離心機(jī)為上海醫(yī)用分析儀器廠產(chǎn)品，其他均為實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。

2 方法和結(jié)果

2.1原花青素磷脂復(fù)合物的制備 將原花青素與磷脂以不同比例加入合適的溶劑中，在不同溫度下攪拌至澄明，揮除有機(jī)溶劑，殘余物低溫減壓干燥后獲得原花青素磷脂復(fù)合物。

利用氯仿檢查磷脂復(fù)合物的形成。因?yàn)樵ㄇ嗨夭蝗苡诼确?，而被磷脂包裹的磷脂?fù)合物可溶于此溶劑。由此判斷所得到的復(fù)合物為原花青素磷脂復(fù)合物。

研究結(jié)果表明，優(yōu)化的制備原花青素磷脂復(fù)合物的方法為：取原花青素10 g與大豆磷脂40 g，置于50 L的混合溶劑[乙醇-四氫呋喃(1:9)]中，40 ℃溶解攪拌，持續(xù)攪拌2 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去四氫呋喃，即得產(chǎn)物。優(yōu)化工藝的復(fù)合率可達(dá)97%。

2.2原花青素B2及其磷脂復(fù)合物的水中飽和溶解度的測(cè)定 以20 ml水為溶劑，分別加入過量的原花青素B2和原花青素B2磷脂復(fù)合物攪拌。分別于1、2、2.5、3 h時(shí)各取2 ml離心(3 000 r/min)10 min。取上層清液過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液1 ml于10 ml容量瓶，稀釋至定容，然后在265 nm處測(cè)紫外吸收度，重復(fù)測(cè)3次。

將過量的原花青素B2及其磷脂復(fù)合物分布溶解于水中，3 h后達(dá)到溶解平衡。測(cè)得各自的飽和溶解度，見表1。原花青素B2磷脂復(fù)合物能顯著提高藥物的水溶性，至原來的2.6倍。

表1 原花青素B2及其磷脂復(fù)合物在水中的飽和溶解度(μg/ml)

2.3原花青素B2及其磷脂復(fù)合物在正辛醇中飽和溶解度的測(cè)定 分別以20 ml的水和正辛醇作為溶劑，加入過量的原花青素B2攪拌。分別于1、2、2.5、3 h時(shí)各取2 ml離心(3 000 r/min)10 min。取上層清液過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液1 ml于10 ml量瓶，稀釋至定容，然后在265 nm處測(cè)紫外吸收度，重復(fù)測(cè)3次。

將過量的原花青素B2及其磷脂復(fù)合物分別溶解于正辛醇中，3 h后達(dá)到溶解平衡。測(cè)得各自的飽和溶解度，見表2。原花青素B2磷脂復(fù)合物能顯著提高藥物的脂溶性，達(dá)19倍之多。

表2 原花青素B2及其磷脂復(fù)合物在正辛醇中的飽和溶解度(μg/ml)

2.4原花青素B2及其磷脂復(fù)合物的油水分配系數(shù)的測(cè)定 制備含藥量為200 μg/ml的原花青素B2及其復(fù)合物的正辛醇溶液。各取10 ml置于pH值為1.0、3.6、4.5、6.0、7.4的10 ml蒸餾水中，室溫下攪拌3 h后，將上下兩層溶液分開，稀釋至適宜濃度，在265 nm處測(cè)紫外吸收度，并按照對(duì)照品溶液的紫外吸收換算成濃度。最后將各pH值處的正辛醇濃度與水溶液濃度相比較，得出油水分配系數(shù)。

制備原花青素B2的飽和溶液；配制相當(dāng)于原花青素B2200 mg/ml濃度的磷脂復(fù)合物的正辛醇溶液。精密移取10 ml各樣品的正辛醇溶液及10 ml不同pH值的蒸餾水于50 ml圓底燒瓶中，震搖3 h后，按上述方法測(cè)定。結(jié)果見表3和表4。

表3 原花青素B2的油水分配系數(shù)(μg/ml)

表4 原花青素B2磷脂復(fù)合物的油水分配系數(shù)(μg/ml)

藥物的水油分配系數(shù)與藥物在生物膜中的分配有關(guān)，水油分配系數(shù)在一定范圍內(nèi)的增大，會(huì)使藥物進(jìn)入生物膜的量增大，有利于藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而增加進(jìn)入體內(nèi)的藥物量，提高生物利用度。實(shí)驗(yàn)表明，原花青素B2磷脂復(fù)合物的油水分配系數(shù)與原花青素B2相比明顯增大，預(yù)示其體內(nèi)吸收有可能提高。

2.5原花青素磷脂復(fù)合物性質(zhì)測(cè)定 取原花青素與大豆磷脂，置于50 L的混合溶劑[乙醇-四氫呋喃(1:9)]中，40 ℃溶解攪拌，持續(xù)攪拌2 h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去四氫呋喃。將干燥原花青素磷脂復(fù)合物提取物與殘?jiān)鬯?，制得原花青素磷脂?fù)合物。成型工藝過程中，原花青素磷脂復(fù)合物的相對(duì)臨界濕度、流動(dòng)性及黏性等對(duì)制劑成型有較大影響，因此對(duì)其進(jìn)行了考察。

2.5.1相對(duì)臨界濕度測(cè)定 精密稱取原花青素磷脂復(fù)合物2～3 g，平鋪于干燥扁形稱量瓶中，分別置于已知濕度(用不同濃度的硫酸控制濕度)的干燥器內(nèi)，敞口放置24 h，再稱定重量，計(jì)算吸水率，結(jié)果樣品相對(duì)濕度在42%以內(nèi)，引濕性較小。

2.5.2休止角測(cè)定 取原花青素磷脂復(fù)合物，用漏斗法測(cè)定休止角(環(huán)境相對(duì)濕度32%)，測(cè)定3次。結(jié)果表明，原花青素磷脂復(fù)合物休止角平均為45°。

2.5.3黏性 取原花青素磷脂復(fù)合物，分別用水、40%、70%、90%、95%及無水乙醇制粒，以考察其黏性。結(jié)果用水、40%、70%、90%乙醇均無法制粒，用95%乙醇可制粒，但黏性較大，難通過篩網(wǎng)，用無水乙醇較易制粒，說明原花青素磷脂復(fù)合物黏性強(qiáng)，對(duì)制粒有較大影響。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原花青素磷脂復(fù)合物流動(dòng)性尚可，但黏性強(qiáng)，相對(duì)臨界濕度小，引濕性較強(qiáng)。

2.6成型工藝研究

2.6.1減少物料吸濕性的輔料種類和用量的考察 通過對(duì)本品原花青素磷脂復(fù)合物的性質(zhì)考察，粉末具有很強(qiáng)的吸濕性，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，如果不加入一定量的輔料減少物料的吸濕性，制成膠囊后內(nèi)容物很容易吸潮結(jié)塊。所以考察加入不同物料以降低物料的吸濕性。制成混料，填充膠囊，放入恒溫、恒濕箱中進(jìn)行加速實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。

表5 原花青素磷脂復(fù)合物輔料選擇與用量及混合結(jié)果

從表5數(shù)據(jù)可以看出，加入一定量的微粉硅膠對(duì)物料的吸濕性具有很大影響；當(dāng)微粉硅膠的量達(dá)到原花青素磷脂復(fù)合物混料的7.5%以后，按照影響因素考察的方法，原花青素磷脂復(fù)合物在第10天都不會(huì)出現(xiàn)成團(tuán)現(xiàn)象。由此確定加入7.5%的微粉硅膠。

2.6.2膠囊型號(hào)和膠囊服用量的確定 原花青素磷脂復(fù)合物中加入7.5%的微粉硅膠能起到較好的防潮效果，為確定膠囊型號(hào)，分別取0、1、2號(hào)膠囊進(jìn)行裝填試驗(yàn)。為使膠囊填沖順利進(jìn)行，加入原花青素磷脂復(fù)合物量0.4%的硬脂酸鎂為潤滑劑。將干燥粉末和以上輔料混合均勻，進(jìn)行膠囊填充，結(jié)果見表6。

表6 原花青素磷脂復(fù)合物膠囊型號(hào)和膠囊服用量

當(dāng)使用1號(hào)和2號(hào)膠囊時(shí)，每次服用的膠囊數(shù)量都大于4粒；為方便患者服用，減少每次服用膠囊粒數(shù)，所以膠囊型號(hào)定為0號(hào)，每粒膠囊裝填0.42 g，不足部分用填充劑補(bǔ)充。

2.6.3填充劑的選擇 加入常用填充劑：淀粉、預(yù)膠化淀粉和糊精與輔料混合后，均不易吸潮，再比較混合物料的流動(dòng)性和膠囊的裝量差異，以確定填充劑的種類。方法：取73.9 g原花青素磷脂復(fù)合物粉末，加入5.54 g微粉硅膠，0.30 g硬脂酸鎂，再分別加入10.26 g不同種類的填充劑(淀粉，預(yù)膠化淀粉，糊精)，使總量為90 g。測(cè)定所得混合料的休止角，同時(shí)將部分混合料進(jìn)行膠囊填充，規(guī)格為0.45 g，測(cè)定其裝量差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7，結(jié)果表明預(yù)膠化淀粉在休止角和膠囊的裝量差異方面要明顯好于淀粉和糊精。故采用預(yù)膠化淀粉作為本品的填充劑。

表7 原花青素磷脂復(fù)合物填充劑選擇試驗(yàn)

2.6.4潤滑劑的確定 膠囊填充設(shè)備為活塞桿擠壓式填沖機(jī)，按加入原花青素磷脂復(fù)合物7.5%的微粉硅膠、0.4%硬脂酸鎂與預(yù)膠化淀粉處方進(jìn)行中試填沖時(shí)，發(fā)現(xiàn)有少量的膠囊出現(xiàn)擠壓劃破囊殼的情況。因此，適當(dāng)加大了硬脂酸鎂的用量，達(dá)到原花青素磷脂復(fù)合物量的0.6%，可順利進(jìn)行填沖，以適應(yīng)大批量生產(chǎn)。

3 討論

本研究制備了葡萄籽原花青素磷脂復(fù)合物，并考察了原花青素B2的水中飽和溶解度的測(cè)定、正辛醇中飽和溶解度的測(cè)定、油水分配系數(shù)的測(cè)定，表明葡萄籽原花青素制成磷脂復(fù)合物有望提高體內(nèi)吸收率。在成型工藝中，對(duì)原花青素磷脂復(fù)合物的相對(duì)臨界濕度、流動(dòng)性及黏性等進(jìn)行考察，并考察了制備原花青素磷脂復(fù)合物膠囊劑的輔料，為葡萄籽原花青素的制劑技術(shù)升級(jí)奠定基礎(chǔ)。

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