貽貝多糖MA對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化兔的作用

毛峻琴，侯中海，陳大貴，張 文 ( .解放軍85醫(yī)院，上海 0005；.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 00433)

海洋軟體動(dòng)物貽貝(Mytilussp.)廣泛分布于我國(guó)遼寧、山東、浙江等省沿海地區(qū)，養(yǎng)殖范圍廣，生產(chǎn)數(shù)量大，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，也有一定的藥食價(jià)值，在《本草綱目》、《本草拾遺》及《日華子本草》中均有記載?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，貽貝具有促進(jìn)免疫[1]、抗腫瘤[2]、清除氧自由基[3]、調(diào)節(jié)血脂[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[5]等藥理作用。貽貝的清除氧自由基作用源于貽貝多肽[3]，調(diào)血脂活性則基于其多糖成分[6]，貽貝總多糖的主體成分是貽貝多糖MA[7]。筆者對(duì)貽貝多糖MA抗高血脂作用及其機(jī)制進(jìn)行了試驗(yàn)，同時(shí)觀察了MA的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭兔，雄性，體重2～2.3 kg，(上海甲干生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2010-0028)。

1.2高脂飼料 基礎(chǔ)飼料粉79.5%、蛋黃粉15%、豬油 5%、膽固醇0.5%(上海斯萊康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 貽貝多糖MA(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院海洋藥物教研室制備，批號(hào)：20110810-1)；血脂康(北京北大維信生物科技有限公司，批號(hào)：20110410)；普伐他汀片(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：1103042)。三酰甘油(TG)測(cè)試盒(批號(hào)：20100413),總膽固醇(TC)測(cè)試盒(批號(hào)：20100907)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL)測(cè)試盒(批號(hào)：20100702)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL)測(cè)試盒(批號(hào)：20100702),均為北京北化康泰臨床試劑有限公司產(chǎn)品?？傰ッ竅脂蛋白脂酶(LPL)/肝脂酶(HL)]測(cè)試盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品(批號(hào)：20111123)。兔羥甲基戊二酸單酰輔酶-A還原酶(HMG-CoAR)測(cè)試盒為上海裕平生物科技有限公司產(chǎn)品(批號(hào)：201111)。

1.4實(shí)驗(yàn)儀器 透射電子顯微鏡(日立H-600型)；Anke TDL-5離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；SCREEN MASTER 3000半自動(dòng)化分析儀(北京富利泰醫(yī)學(xué)科技有限公司)；CP225D型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1實(shí)驗(yàn)步驟 在適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，于兔耳緣靜脈取血，根據(jù)血脂水平將兔隨機(jī)分為7組，即空白對(duì)照組，模型組，陽(yáng)性對(duì)照血脂康組(0.12 g/kg)和普伐他汀組(4 mg/kg)，MA低、中、高劑量組(15、30、60 mg/kg)每組6只兔?？瞻讓?duì)照組兔喂普通顆粒飼料外，其余各組兔喂高脂飼料4周后，除空白對(duì)照組外，其他各組繼續(xù)喂上述高脂飼料并開始給藥。空白對(duì)照組及模型組均灌胃給予等量的0.5%CMC-Na溶液，其余各組給予藥物，1次/d，連續(xù)給藥4周。每周稱重1次，根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量。

1.5.2指標(biāo)檢測(cè) 在連續(xù)給藥4周后，所有實(shí)驗(yàn)兔均禁食、自由飲水12 h，并于末次給藥1 h后予3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)麻醉。 從腹主動(dòng)脈取血液5 ml用于測(cè)定血脂，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，按試劑盒說(shuō)明測(cè)定TG、TCH、LDL和HDL。 取小塊肝臟分別行病理檢查和透射電子顯微鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。取其余肝臟，冷凍后，制備10%肝組織勻漿，待測(cè)LPL、HL和HMG-CoAR。 取主動(dòng)脈，將動(dòng)脈血管剖開后，直接進(jìn)行油紅染色觀察。

2 結(jié)果

2.1MA對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化兔血脂水平的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組兔的血清TG、TC、LDL水平顯著升高(P<0.01)，HDL也有所升高。與模型組相比，MA組兔血清TG、TC、LDL明顯降低(P<0.05)，其降低程度與劑量呈一定依賴關(guān)系。陽(yáng)性對(duì)照血脂康和普伐他汀組均顯著降低血清TG、TC和LDL水平，HDL升高(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 MA對(duì)高脂血癥家兔血脂水平的影響

1)P<0.05，2)P<0.01，與模型組比較；3)P<0.05，4)P<0.01，與空白對(duì)照組比較

2.2MA對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化兔LPL、HL和HMG-CoAR活性的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組兔LPL、HL和HMG-CoAR活性水平明顯降低 (P<0.01)。與模型組比較，MA中、高劑量組明顯增加LPL活性(P<0.05，P<0.01)；MA低、中、高劑量組明顯增加HL活性(P<0.05，P<0.01)；MA對(duì)HMG-CoAR水平無(wú)顯著影響。血脂康和普伐他汀可明顯增加LPL和HL活性，降低HMG-CoAR活性。結(jié)果詳見表2。

2.3MA對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化兔肝臟的影響(圖1)

2.3.1肉眼觀察 空白對(duì)照組肝臟顏色紅潤(rùn)，質(zhì)軟，無(wú)異常變化；模型組肝臟體積增大，呈紅黃色，包膜緊張、邊緣圓鈍、切面油膩，屬典型肝細(xì)胞脂肪變性；MA組和陽(yáng)性藥物組(并稱給藥組)呈輕微紅黃色，質(zhì)地、體積均有明顯改善。

1)P<0.05，2)P<0.01，與模型組比較；3)P<0.05，4)P<0.01，與空白對(duì)照組比較

圖1 MA對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化兔肝臟的影響

2.3.2HE染色鏡下組織學(xué)觀察 空白對(duì)照組肝組織的形態(tài)學(xué)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見脂肪變性的肝細(xì)胞。模型組肝組織均出現(xiàn)了肝細(xì)胞脂肪變性，病變以中央靜脈周圍最為明顯，有成片的肝細(xì)胞呈泡沫樣脂肪變性，以及灶性分布的大脂滴脂肪變性，病變區(qū)域出現(xiàn)肝細(xì)胞融合現(xiàn)象，部分肝細(xì)胞發(fā)生溶解性壞死。給藥組可見肝小葉清晰、肝索明顯，肝細(xì)胞基本正常，少數(shù)肝細(xì)胞變大，胞漿內(nèi)有少量脂滴沉著。

2.3.3透射電鏡觀察 模型組兔肝臟有較多脂滴；與模型組比較，給藥組肝臟脂滴明顯減少。

2.4MA對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化兔主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響 用油紅脂肪染色的方法可使主動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)域脂肪呈鮮紅色，用于觀察動(dòng)脈粥樣硬化情況(圖2)。

圖2 MA對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化兔主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響

2.4.1肉眼觀察 空白對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，無(wú)紅染的粥樣硬化斑塊形成；模型組主動(dòng)脈內(nèi)有較多的紅染斑塊，各給藥組有少量的紅染斑塊。

2.4.2光鏡觀察 冰凍切片油紅染色結(jié)果顯示：空白對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)無(wú)紅色的脂質(zhì)沉積；模型組主動(dòng)脈內(nèi)有大量的紅色脂質(zhì)沉積；給藥組主動(dòng)脈內(nèi)紅色脂質(zhì)沉積少于模型組。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，一般認(rèn)為血漿TC、TG和LDL的水平與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生呈正相關(guān)，而血漿HDL水平與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，高脂血癥可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成和發(fā)展。課題組采用現(xiàn)代色譜學(xué)、現(xiàn)代波譜學(xué)等技術(shù)，以腹腔注射蛋黃乳液所致急性高脂小鼠為活性追蹤模型，首次對(duì)貽貝的生物活性成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究[7]，從中分離得到了一種新的、具有顯著調(diào)節(jié)血脂作用的單一多糖成分，命名為MA。MA是貽貝總多糖的主體成分，產(chǎn)率較高，占貽貝濕重的0.49%；易溶于水和二甲基亞砜，相對(duì)分子量為112 739 u。筆者進(jìn)一步采用實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠模型和人試食實(shí)驗(yàn)觀察了貽貝多糖的降脂作用，發(fā)現(xiàn)其能顯著降低TC、TG和LDL水平[6-8]。本實(shí)驗(yàn)利用喂養(yǎng)家兔高脂飼料方法建立的實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化兔模型，再次證實(shí)MA可顯著降低TC、TG和LDL水平，并發(fā)現(xiàn)MA可增強(qiáng)LPL、HL的活性。

LPL和HL都是脂蛋白代謝中的關(guān)鍵酶。TG被LPL水解后生成甘油和游離脂肪酸(FFA)供組織能量消耗或沉積于脂肪細(xì)胞，從而使血液中的TG和極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)的含量降低。HL存在于肝內(nèi)皮細(xì)胞表面，主要在LDL和HDL代謝中起重要作用[9,10]。細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成由HMG-CoAR催化完成，他汀類藥物是HMG-CoAR競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，使細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成減少，從而反饋上調(diào)肝細(xì)胞表面LDL受體表達(dá)，加速血漿中LDL、MDL及VLDL的清除，降低血脂水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MA可能通過(guò)增強(qiáng)LPL、HL的活性，降低TC、TG的水平，進(jìn)而參與了降脂酶發(fā)揮降脂功能。但MA對(duì)HMG-CoAR沒有顯著影響。

油紅屬于偶氮染料，是很強(qiáng)的脂溶劑和染脂劑，與三酰甘油結(jié)合呈小脂滴狀。當(dāng)組織切片置入染液時(shí)，染料則離開染液而溶于組織內(nèi)的脂質(zhì)中，使組織內(nèi)的脂滴呈橘紅色。因此，油紅染色法可顯示組織內(nèi)和動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)域的脂肪。油紅染色結(jié)果顯示，MA組血管內(nèi)膜較模型組完整、平坦，有少量紅染的斑塊，主動(dòng)脈內(nèi)紅色脂質(zhì)沉積顆粒少于模型組，表明MA抑制了動(dòng)脈粥樣硬化的形成。肝臟病理組織學(xué)和透射電子顯微鏡檢測(cè)顯示,MA組肝細(xì)胞基本正常，肝臟中脂質(zhì)沉積少于模型組，表明MA可抑制脂肪肝的形成。MA的安全性高。吳涓等[11]報(bào)道稱貽貝多糖膠囊急性毒性分級(jí)屬無(wú)毒級(jí)，無(wú)遺傳毒性；有進(jìn)一步研發(fā)成降脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化的保健食品和藥品的前景。

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