氧化石墨烯/Fe3O4復(fù)合材料固定辣根過氧化物酶催化去除酚類廢水

唐和清,黃 佳,常 青

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，武漢430074)

辣根過氧化物酶(HRP)是以鐵卟啉為輔基的血紅素蛋白，在過氧化氫(H2O2)存在時(shí)能催化氧化酚類物質(zhì)產(chǎn)生苯氧自由基，自由基相互聚合，形成可通過沉淀或過濾除去的不溶性聚合物[1,2]，故被廣泛運(yùn)用于酚類廢水的去除.酚類化合物是一類原型質(zhì)毒物，與細(xì)胞原漿中的蛋白質(zhì)作用，使人和動(dòng)物中毒[3].在煤炭轉(zhuǎn)化、紡織、樹脂和塑料加工、洗滌劑、煉油、鋼鐵、木材、肥皂、洗滌劑、燃料和其他有機(jī)化學(xué)品等工業(yè)領(lǐng)域中酚類物質(zhì)被廣泛運(yùn)用[4].

HRP催化氧化酚類物質(zhì)的作用機(jī)理第一步是H2O2和靜態(tài)酶中的Fe(III)反應(yīng)生成化合物I(HRPI)，HRPI是一個(gè)高氧化態(tài)的催化中間體，包含一個(gè)含氧Fe(IV)中心和一個(gè)帶正電荷的卟啉.一分子還原性底物的加人，生成另一個(gè)含有含氧Fe(IV)中心的催化中間體HRPII.HRPI 和HRPII都是強(qiáng)氧化劑，氧化還原電勢(shì)接近+1V.第二步也有一分子還原性底物參加，使HRPII還原成靜態(tài)酶[5].在傳統(tǒng)的含酚廢水酶促處理中，大多使用的是溶液酶，易受廢水中其他污染物的影響，穩(wěn)定性差、易失活、不能繼續(xù)使用.固定化酶不僅可解決酶的回收、再利用等問題，還提高酶的穩(wěn)定性和酶對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，對(duì)于耐酸、耐堿、耐高溫等耐極端條件酶的開發(fā)具有重要意義[6].

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品、試劑和儀器

苯酚、2，4-二氧苯酚、七水硫酸亞鐵、六水氯化鐵、氨水、聚乙二醇、高錳酸鉀、4-氨基安替比林(4-AAP)、鐵氰化鉀、EDC (分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，HRP(R.Z≥3.1, 上海雪滿生物科技有限公司).

高效液相色譜儀(HPLC U-3000型,Thermo Scientific公司)， 傅立葉紅外光譜儀( Nicolet Nexus 470 型, Thermo Nicolet 公司)，振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(ADE 4HF, Dymek公司).

1.2 GO/Fe3O4復(fù)合材料的制備

由hummer法制備氧化石墨[7].量取30 mL已知濃度的氧化石墨超聲30 min，稱取0.466 g FeCl3·6H2O和0.48 g FeSO4·7H2O與之混合超聲10 min.逐滴滴入20 mL 2.5 mol·L-1的氨水溶液中，60 ℃超聲反應(yīng)60 min，多次洗滌后，50 ℃真空干燥箱中烘干備用.

1.3 HRP的固定

在18 mL pH=6 的磷酸緩沖液中加入0.2 g GO/Fe3O4和2 mg HRP放入100 mL錐形瓶中，超聲10 min后，加入EDC使其終濃度為2 mg·L-1，于150 r/min、30 ℃的搖床中反應(yīng)11 h(見圖1).反應(yīng)完成后用緩沖液反復(fù)洗滌排除未固定化的酶的干擾，定容后保存.

圖1 EDC將HRP固定在GO/Fe3O4上的示意圖Fig.1 Schematic illustration of HRP immobilized on GO/Fe3O4 by EDC

1.4 酶活的測(cè)定

在反應(yīng)器皿里加入100 μL的0.2 mol·L-1苯酚，100 μL的4.8 mol·L-1的4-AAP，200 μL 2.0 mmol·L-1H2O2，適量的pH為7.4磷酸緩沖溶液和酶溶液，終溶液體積為1.8 mL.在紫外可見分光光度計(jì)下檢測(cè)其在505 nm處的吸光度[8].

1.5 酚類物質(zhì)分析方法

用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定分析酚類物質(zhì)的濃度，檢測(cè)條件為UV檢測(cè)器，色譜柱為C-18 (規(guī)格5 μm, 150×4 mm).流動(dòng)相是甲醇和水體積比例為60∶40，流速0.8 mL·min-1，在270 nm 和288 nm雙波長(zhǎng)檢測(cè).

1.6 酚類物質(zhì)的去除

在100 mL的錐形瓶中加入固定化酶(酶活0.1 U)，酚類物質(zhì)(1 mmol·L-1)，H2O2(1.5 mmol·L-1)，聚乙二醇(按照與酚類物質(zhì)的質(zhì)量比為0.4添加)，pH=6.4的磷酸緩沖溶液(25 mmol·L-1)，反應(yīng)總體積40 mL，在25℃下反應(yīng)3 h.

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的表征

GO/Fe3O4復(fù)合材料的磁化曲線為"S"型曲線，結(jié)果見圖2.如圖2所示，所測(cè)的矯頑力(1.17 Oe)和剩磁(73.06×10-3emu·g-1)幾乎可忽略不計(jì)，證實(shí)為超順磁材料.飽和磁化強(qiáng)度Ms是25.96 emu·g-1.純的Fe3O4飽和磁化強(qiáng)度約為68.8 emu·g-1[9]，GO/Fe3O4中Fe3O4的質(zhì)量所占比例約為37.7%.HRP固定在具有磁性的GO/Fe3O4復(fù)合材料，可利用磁場(chǎng)作用將固定化酶與反應(yīng)溶液分離供下一次循環(huán)使用.

Appiled Field/(104 Oe)圖2 GO/Fe3O4復(fù)合材料多的磁化曲線Fig.2 Magnetization curve of GO/Fe3O4

GO/Fe3O4、GO/Fe3O4-HRP 和純的HRP的紅外光譜圖見圖3.由圖3可見，1586 cm-1處吸收峰是由于Fe3O4覆蓋在GO表面而形成了-COO的緣故，F(xiàn)e-O的伸縮振動(dòng)峰在560 cm-1，與之前的報(bào)道相似[10].當(dāng)酶固定后，1398 cm-1附近的-OH 的面內(nèi)變型振動(dòng)吸收峰基本消失(見圖3b).與GO/Fe3O4復(fù)合材料的譜圖相比，GO/Fe3O4-HRP在1102 cm-1處有一個(gè)新峰出現(xiàn)，純的HRP的譜圖中同樣具有這一個(gè)峰，歸屬于C-N 的伸縮振動(dòng)，故推斷HRP成功地固載在GO/Fe3O4復(fù)合材料表面.

五四時(shí)期，除了本土的封建主義意識(shí)形態(tài)，附著于各種思潮的西方意識(shí)形態(tài)也涌入中國(guó)，如功利主義（實(shí)用主義）、無政府主義、基爾特社會(huì)主義、新村主義，等等，宣揚(yáng)著各自對(duì)社會(huì)的見解和主張。在各種主義中，有的標(biāo)榜贊成“共產(chǎn)主義”或“社會(huì)主義”，但其內(nèi)容和實(shí)質(zhì)卻是偽社會(huì)主義或反馬克思主義的，一時(shí)讓人難辨真假，阻礙著馬克思主義的科學(xué)社會(huì)主義的傳播。馬克思主義與一些反馬克思主義的意識(shí)形態(tài)進(jìn)行了較長(zhǎng)時(shí)間的論戰(zhàn)，比較著名的是與功利主義（實(shí)用主義）、基爾特社會(huì)主義、無政府主義的論爭(zhēng)。

σ/cm-1a) GO/Fe3O4; b) GO/Fe3O4-HRP; c) 純HRP圖3 不同樣品的紅外光譜圖Fig.3 Fourier transform infrared spectra of different samples

2.2 酚類的去除

2.2.1 單獨(dú)的苯酚與2,4-二氯苯酚的去除

固定化酶去除苯酚和2,4-二氯苯酚廢水結(jié)果見圖4.如圖4所示，苯酚與2,4-二氯苯酚的去除率約為46%和99%.2,4-二氯苯酚在反應(yīng)開始10 min后就基本去除完成，隨時(shí)間延長(zhǎng)苯酚的去除率逐漸增加，直至120 min才基本保持不變.在反應(yīng)過程中苯氧自由基攻擊酶的活性位點(diǎn)使酶失活[11]，是由于生產(chǎn)的苯氧自由基對(duì)酶的毒性不同所致.

t/min1) 2,4-二氯苯酚; 2) 苯酚圖4 固定化酶去除苯酚與2,4-二氯苯酚Fig.4 Removal of phenol and 2,4-dichlorophenol by immobilized enzyme

2.2.2 苯酚與2,4-二氯苯酚混合溶液的去除

在HRP的作用下，H2O2將酚氧化生成高活性的苯氧自由基等中間物種，它們從酶的活性中心擴(kuò)散到溶液，與酚分子或其它苯氧自由基本身發(fā)生反應(yīng)，生成了一系列的聚合物.將相對(duì)較難被HRP氧化去除的酚類與相對(duì)較容易去除的酚類混合，由于去除途徑的增多會(huì)提高難以去除的酚類的去除效率[12].在實(shí)際酚類廢水的處理中，因廢水不只含有一種酚類物質(zhì)，去除混合溶液更有實(shí)際意義.實(shí)驗(yàn)將固定化酶用于處理苯酚(0.5 mmol·L-1)與2,4-二氯苯酚(0.5 mmol·L-1)水溶液的混合物，結(jié)果見圖5.如圖5所示，2, 4-二氯苯酚的去除率還保持99%，而苯酚的去除率從之前的46%提高到93%，故2, 4-二氯苯酚與苯酚混合后能促進(jìn)苯酚的去除.

t/min1) 2,4-二氯苯酚; 2) 苯酚圖5 固定化酶去除苯酚與2,4-二氯苯酚的混合物Fig.5 Removal of mixed solution of phenol and 2,4-dichlorophenol by immobilized enzyme

2.2.3 理化性質(zhì)對(duì)混合酚類去除的影響

配置不同pH值的磷酸緩沖溶液(25 mmol·L-1)，其他條件不變，考察pH對(duì)去除效率的影響，結(jié)果如圖6a所示.圖6a中，在pH值為5.4～6.4范圍內(nèi)，隨pH值的增加去除率增加；在pH值為6.4～9.4范圍內(nèi)，去除率隨pH值增加而減小.酶蛋白分子上有很多酸性、堿性氨基酸殘基，隨pH的變化處于不同的解離狀態(tài)會(huì)直接影響與底物的結(jié)合或者影響酶的空間結(jié)構(gòu)使酶失活，因此最適pH值為6.4.溫度對(duì)去除率的影響結(jié)果見圖6b. 圖6b中，隨著溫度的升高，苯酚的去除率與2,4-對(duì)氯酚的去除率都逐漸下降，溫度為60℃時(shí)苯酚與2,4-二氯苯酚的去除率分別只有29%和49%，因?yàn)槊傅幕钚允軠囟扔绊懞艽?，溫度過高時(shí)會(huì)變性，經(jīng)優(yōu)化后以25℃為最佳反應(yīng)溫度.

pH θ/℃圖6 pH與溫度對(duì)去除率的影響Fig.6 The influence of pH and temperature on the removal rate

2.2.4 固定化酶的循環(huán)利用

固定化酶的回收利用是評(píng)價(jià)酶固定化方法的一個(gè)重要指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)將制備的固定化酶用于混合的苯酚與2,4-二氯苯酚的催化去除，重復(fù)4次，每次3h，反應(yīng)完成后用水多次洗滌固定化酶以便下一次實(shí)驗(yàn).Zhang 等[13]證實(shí)自由酶在酚類物質(zhì)的催化去除反應(yīng)體系中迅速失活. 固定化酶循環(huán)使用去除混合酚溶液結(jié)果見圖7.由圖7可見，固定化酶在多次長(zhǎng)時(shí)間使用后活性仍然保持了原有活性的約50%，酶的固定顯著增加了HRP在酚類物質(zhì)催化去除中的應(yīng)用價(jià)值，使固定酶在實(shí)際廢水處理中的使用成為可能.

Cycles圖7 固定化酶循環(huán)使用去除混合酚溶液的活性Fig.7 Reusability of the immobilized enzyme in mixed solution of phenols removals

3 結(jié)論

(1)采用原位反相共沉淀的方法制備了GO/Fe3O4復(fù)合材料，以EDC為交聯(lián)劑運(yùn)用共價(jià)交聯(lián)的方法將HRP成功固定在GO/Fe3O4復(fù)合材料上.

(2)固定化酶用于去除單獨(dú)的苯酚與2,4-二氯苯酚和兩者的混合溶液，易于去除的2,4-二氯苯酚與苯酚混合后對(duì)苯酚的去除起到了促進(jìn)作用，提高了苯酚的去除率.

(3)固定化酶重復(fù)用于苯酚與2,4-二氯苯酚混合溶液的去除， 4次循環(huán)后固定化酶的活性保留超過50%.

參 考 文 獻(xiàn)

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