鱷嘴花正丁醇提取物對小鼠Heps肝癌的抑制作用

劉旭，郭文潔，黃丹民，2，高靜

（1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.馬來西亞百年生命科技有限公司，吉隆坡57000）

鱷嘴花正丁醇提取物對小鼠Heps肝癌的抑制作用

劉旭1，郭文潔1，黃丹民1，2，高靜1

（1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.馬來西亞百年生命科技有限公司，吉隆坡57000）

目的：研究鱷嘴花正丁醇提取物［Clinacanthusnutans（Burm.f.）Lindau n-butanol extracts，CN-N］對荷瘤小鼠的體內(nèi)抑瘤作用及延長生存時間作用。方法：肝癌細胞接種至ICR小鼠右側(cè)腋下，建立Heps小鼠肝癌模型，隨機分成4組，對照組、環(huán)磷酰胺組、CN-N低劑量組（3 mg·kg－1·d－1）、CN-N高劑量組（10 mg·kg－1·d－1），每組10只，觀察CN-N對荷瘤小鼠的抑瘤率、體質(zhì)量、脾臟及胸腺指數(shù)、生存時間的影響。蛋白質(zhì)印跡法檢測增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表達，TUNEL法檢測細胞凋亡情況。結(jié)果：與對照組比較，CN-N低劑量組和高劑量組腫瘤質(zhì)量明顯降低（t分別為2.261，3.140，P均＜0.05），荷瘤小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），PCNA表達均明顯減少；CN-N高劑量組生命延長率為54.8%，較對照組明顯延長荷瘤小鼠生存期（t＝3.416，P＝0.003 1）。結(jié)論：鱷嘴花正丁醇提取物具有良好的抗腫瘤作用，高劑量CN-N能提高荷瘤小鼠的生存期。

鱷嘴花；正丁醇提取物；抗腫瘤；細胞凋亡

肝癌是全世界最普遍最致命的惡性腫瘤之一，且治療手段非常有限［1］。目前，肝癌的治療方法主要為外科手術(shù)切除及肝移植，但只適用于10%～25%的患者［2］，因為大部分患者被確診時已是肝癌晚期［3］。治療肝癌的一線藥物主要有有5-氟尿嘧啶、長春新堿、環(huán)磷酰胺、順鉑和阿霉素等，但大多是非選擇性的細胞毒藥物，毒副作用強［4］。大部分肝癌患者因條件限制無法接受有效治療，因此，研發(fā)高效低毒的抗肝癌新藥極為必要。

鱷嘴花［Clinacanthus nutans（Burm.f.）Lindau］屬于爵床科鱷嘴花屬，是泰國傳統(tǒng)藥物中廣泛應(yīng)用的藥用植物，分布于中南半島、馬來半島以及我國的廣西、廣東、云南、海南等地。在馬來西亞，泰國等地，鱷嘴花作為一種傳統(tǒng)的藥材用于治療蛇叮咬，精神緊張，糖尿病，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，肝炎以及抗病毒等。鱷嘴花氯仿提取物對腫瘤細胞有顯著的抑制作用［5］，但鱷嘴花正丁醇提取物（Clinacanthus nutans（Burm.f.）Lindau n-butanol extracts，CN-N）是否有抗腫瘤作用，未有公開報道。本研究旨在建立小鼠Heps肝癌實體瘤模型，探討CN-N的抗腫瘤效果并初步研究其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用小鼠肝腹腔積液瘤Heps細胞由江蘇省腫瘤醫(yī)院提供，小鼠腹腔積液傳代；注射用環(huán)磷酰胺購自通化茂祥制藥有限公司（產(chǎn)品批號130601）；TUNEL試劑盒購自南京諾維贊生物科技有限公司；β-肌動蛋白、PCNA抗體購自Santa Cruz公司。

環(huán)磷酰胺用生理鹽水配成2 mg·mL－1的溶液，備用；鱷嘴花由馬來西亞百年生命科技有限公司提供。鱷嘴花全株干品粉末1.5 kg，于5 L 95%乙醇浸泡2周，抽濾取濾液，料渣烘干，95%乙醇提取2次，料液比分別為1∶5，1∶3，時間分別為2.5、2 h，抽濾取濾液。料渣烘干，用60%乙醇提取2次，料液比分別為1∶5，1∶3，時間分別為2.5、2 h，抽濾取濾液。合并所有濾液，濃縮得浸膏。冷凍干燥得干粉，正丁醇提取，冷凍干燥得干粉，配成所需濃度，備用。

1.2 動物分組及處理

ICR小鼠94只，SCXK（蘇）2013-0011，4～5周齡，體質(zhì)量18～22 g，由江蘇大學(xué)動物中心提供；建立腫瘤皮下移植瘤模型［6］：在腹腔積液瘤模型鼠腹腔內(nèi)培養(yǎng)Heps腹腔積液瘤株，7 d后，將腹腔積液瘤模型鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡5 min，腹腔穿刺取腹腔積液，計數(shù)并用生理鹽水稀釋至細胞密度為2 ×107個／mL；取0.2 mL Heps（4×106個／只）瘤細胞懸液接種于ICR小鼠右側(cè)腋下，48 h后，游標(biāo)卡尺測量瘤體的長徑和寬徑，計算腫瘤體積。

將造模成功的小鼠根據(jù)腫瘤體積平均分成4組，每組11只，分別為對照組，環(huán)磷酰胺組，CN-N低劑量組，CN-N高劑量組；分別給予生理鹽水，20 mg／kg環(huán)磷酰胺，3、10 mg／kg CN-N。環(huán)磷酰胺組于腹腔注射給藥，其余組灌胃給藥，每只小鼠的注射量均為0.2 mL，1次／d，連續(xù)11 d。每天觀察小鼠的生長、體質(zhì)量、飲食和活動度；游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑（a）和寬徑（b），計算腫瘤體積，V＝1／2·a·b2。

11 d后頸椎脫臼處死小鼠，剝離腫瘤，稱重。取小鼠脾臟、胸腺并稱重。計算公式：抑瘤率（%）＝（對照組平均瘤重－給藥組平均瘤重）／對照組平均瘤重×100%；脾臟指數(shù)＝脾臟質(zhì)量（g）／體質(zhì)量（g）；胸腺指數(shù)＝胸腺質(zhì)量（g）／體質(zhì)量（g）。

1.3 生命延長實驗

實驗方法同上，將造模成功的50只ICR小鼠根據(jù)腫瘤體積平均分成5組，每組10只，分別為對照組，環(huán)磷酰胺組，CN-N1組，CN-N2組，CN-N3組；分別給予生理鹽水，20mg／kg環(huán)磷酰胺，1、3、10mg／kg CN-N，方法同“1.2”。記錄小鼠死亡天數(shù)，繪制存活曲線，計算延長率，延長率＝（給藥組平均存活時間－對照組平均存活時間）／對照組平均存活時間。

1.4 腫瘤組織形態(tài)學(xué)觀察

取腫瘤組織，4%低聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片。蘇木精 伊紅（HE）染色，普通光鏡下觀察腫瘤組織壞死，血管充血等情況。

1.5 TUNEL法檢測肝癌細胞凋亡

實驗方法參照TUNEL試劑盒說明書進行。

我國政府必須加快完善社會保障體系，逐步提高中央和地方財政對社會保障的支出比重；統(tǒng)籌推進國家基本養(yǎng)老保險、企業(yè)補充養(yǎng)老保險和個人儲蓄性養(yǎng)老保險體系改革；完善失業(yè)保險制度，擴大覆蓋面；積極穩(wěn)妥地推進城鎮(zhèn)醫(yī)療保障制度改革；推進農(nóng)村社會保障工作并對老弱病殘、鰥寡孤獨等實行社會救濟，建立新型農(nóng)村合作醫(yī)療和醫(yī)療救助制度。建立包括養(yǎng)老、醫(yī)療、失業(yè)、工傷和生育保險在內(nèi)的社會保障體系，使全體人民學(xué)有所教、勞有所得、病有所醫(yī)、老有所養(yǎng)、住有所居，推動以改善民生為重點的和諧社會建設(shè)，使改革發(fā)展的成果惠及更多的勞動者。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測PCNA的表達

取“1.2”中對照組，CN-N低劑量組（3 mg／kg），CN-N高劑量組（10 mg／kg）腫瘤組織，每組隨機抽取3個樣，提取蛋白，BCA法測定蛋白含量。進行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，封閉后分別加入β-肌動蛋白、PCNA，4℃孵育過夜，洗膜以后加入對應(yīng)二抗，室溫搖床孵育2 h后，TBST洗3次，每次10 min。ECL發(fā)光劑顯示陽性條帶，在Typhoon分子成像系統(tǒng)上記錄結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CN-N對Heps肝癌生長的作用

給藥第11天時存活小鼠的腫瘤形態(tài)見圖1。肉眼觀，與對照組相比，其他3組腫瘤體積減小。給藥到第11天時，環(huán)磷酰胺組小鼠死亡3只。環(huán)磷酰胺組，CN-N低劑量組，CN-N高劑量組3組抑瘤率分別為73.4%，41.0%，61.7%，與對照組比較，腫瘤質(zhì)量明顯降低（F＝9.069，P＝0.001）。與CN-N低劑量組比較，CN-N高劑量組腫瘤質(zhì)量更低（t＝2.695，P＝0.013 6）。從第3天開始，給藥組腫瘤體積增速放緩。從第4天開始，藥物顯著抑制腫瘤生長，表明CN-N有明顯的抑制腫瘤生長的作用，且高劑量效果更佳。見圖1。

圖1 鱷嘴花正丁醇提取物對小鼠腫瘤生長的作用

2.2 CN-N對小鼠體質(zhì)量及免疫器官指數(shù)的影響

與對照組比較，CN-N低劑量組和高劑量組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明CN-N對小鼠體質(zhì)量沒有明顯抑制作用。見圖2。

與對照組比較，環(huán)磷酰胺組荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)明顯降低（t＝3.914，P＝0.000 9），CN-N低劑量組和高劑量組荷瘤小鼠脾臟指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝0.3012，1.366，P均＞0.05），初步表明CN-N對荷瘤小鼠脾臟可能沒有明顯的毒副作用。見表1。

與對照組比較，環(huán)磷酰胺組胸腺指數(shù)明顯降低（t＝4.549，P＝0.000 2），CN-N低劑量組和高劑量組荷瘤小鼠胸腺指數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝0.685 1，0.5055，P均＞0.05），初步表明CN-N對荷瘤小鼠胸腺可能沒有明顯的毒副作用。見表1。

圖2 鱷嘴花正丁醇提取物對荷瘤小鼠體質(zhì)量的影響

表1 各組小鼠去瘤體質(zhì)量及免疫器官指數(shù)的比較n＝10，±s

表1 各組小鼠去瘤體質(zhì)量及免疫器官指數(shù)的比較n＝10，±s

a：P＜0.05，與對照組比較

組別 去瘤體質(zhì)量（g） 脾臟指數(shù)（%） 胸腺指數(shù)（%）25.0±3.6 0.64±0.21 0.34±0.17環(huán)磷酰胺組 20.7±2.0a 0.37±0.08a 0.095±0.05a低劑量組 24.0±2.4 0.66±0.21 0.38±0.10高劑量組 23.9±1.7 0.54±0.12 0.37±0.11 F值對照組0.001 5 0.000 5 0.000 1 6.163 7.389 15.59 P值

2.3 CN-N對荷瘤小鼠的壽命延長效果

對照組，環(huán)磷酰胺組，CN-N1組、N2組、N3組存活時間分別為（19.9±5.9）d，（29.9±7.2）d，（21.8±7.1）d，（25.4±7.2）d，（30.8±10.4）d（F＝4.716，P＝0.002 9）。環(huán)磷酰胺組延長率達50.3%，較對照組顯著延長荷瘤小鼠生存期（t＝3.465，P＝0.002 8）；CN-N1組和N2組延長率分別為9.5%，27.6%，與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝0.667 8，1.909，P均＞0.05）；CN-N3組延長率為54.8%，與對照組比較延長作用明顯（t＝3.416，P＝0.003 1）。結(jié)果表明，CN-N高劑量可明顯延長荷瘤小鼠的存活時間。見圖3。

2.4 各組腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)

對照組腫瘤細胞體積大，呈多邊形或類圓形，細胞核大深染，核質(zhì)比增大，核分裂象易見。腫瘤細胞密集排列呈實體團塊，浸潤于周圍的肌肉和脂肪組織內(nèi)。腫瘤間質(zhì)無明顯炎細胞浸潤，可見充血、出血現(xiàn)象，多數(shù)為輕、中度。環(huán)磷酰胺組腫瘤細胞形態(tài)與對照組相同，但腫瘤細胞異型性明顯，腫瘤凋亡和（或）壞死程度較對照組明顯，腫瘤間質(zhì)無明顯炎細胞浸潤，充血、出血較對照組輕。CN-N給藥組腫瘤細胞形態(tài)與對照組相同，腫瘤凋亡和（或）壞死程度較對照組明顯，并且呈一定劑量依賴的趨勢。見圖4。

2.5 腫瘤組織凋亡情況

結(jié)果顯示，對照組凋亡不明顯，環(huán)磷酰胺組凋亡明顯，CN-N低劑量組凋亡較對照組多但較環(huán)磷酰胺組少；CN-N高劑量組凋亡同環(huán)磷酰胺組，表明CN-N可能引起腫瘤細胞的凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用。見圖5。

2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測CN-N對PCNA的影響

結(jié)果顯示，CN-N給藥組PCNA表達量低于對照組，且高劑量組表達比低劑量組更低，表明CN-N能夠降低PCNA的表達。見圖6。

圖3 鱷嘴花正丁醇提取物對荷瘤小鼠存活時間的影響

圖4 各組腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE染色×100）

圖5 TUNEL法檢測細胞凋亡結(jié)果（×100）

圖6 各組PCNA蛋白的表達

3 討論

全球每年有超過50萬患者被確診患有肝癌［7－8］。臨床上治療肝癌的藥物以化療藥物為主，但其毒副作用較大。在預(yù)防肝癌發(fā)生，減輕患者痛苦，提高生存質(zhì)量，延長生存時間等方面，植物來源的藥物有獨特的優(yōu)勢。其中，紫杉醇、長春新堿、鬼臼毒素是較成功的抗腫瘤藥物，例如，拓撲替康和伊立替康（喜樹堿半合成的衍生物）用于治療卵巢癌、小細胞肺癌和結(jié)腸癌［9－10］。

在泰國、馬來西亞等東南亞國家，鱷嘴花作為一種傳統(tǒng)草藥用于治療帶狀皰疹、蚊蟲叮咬、肝炎和蛇咬傷，其主要成分有豆甾醇，羽扇豆醇，β-谷甾醇，樺木醇，異牡荊素，6種碳苷黃酮和牡荊素等；其中，羽扇豆醇、樺木醇、異牡荊素有抗腫瘤作用，這為本研究提供了一定基礎(chǔ)。本實驗表明，CN-N對異體移植瘤有很好的抑制作用，給藥后第3天開始，腫瘤體積增長速度放緩。給藥11 d后，高劑量組抑瘤率高達61.7%。

生存期的延長是考察抗腫瘤藥的一個重要指標(biāo)，本實驗顯示CN-N高劑量組荷瘤小鼠的生存期明顯延長，生命延長率達54.8%，顯示出CN-N具有較好的應(yīng)用前景。

CN-N對小鼠去瘤體質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)無影響，不排除其有較小毒副作用的可能。CN-N顯示出了良好的抗腫瘤作用，其抑瘤作用可能與誘導(dǎo)凋亡和抑制細胞增殖有關(guān)，但其有效成分到底是什么，以及誘導(dǎo)凋亡、抑制細胞增殖的分子機制還有待進一步研究。

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Inhibitive effect of Clinacanthus nutans（Burm.f.）Lindau n-butanol extracts on Heps hepatoma in m ice

LIU Xu1，GUOWen-jie1，HUANG Dan-min1，2，GAO Jing1
（1.School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China；2.Bio Nice Industry Sdn Bhd，Kuala Lumbur 57000，Malaysia）

Objective：To investigate the anti-tumor activity and life extention effect of Clinacanthus nutans（Burm.f.）Lindau n-butanol extract（CN-N）on tumor loaded mice.M ethods：Mice hepatoma carcinoma cells（Heps，grown in donormice）were transplanted subcutaneously into armpit of the ICR mice to establish the tumor xenograftsmodel.Tumormicewere randomized into four groups：control group，cytoxan group，CN-N low dose group（3 mg·kg－1·d－1），CN-N high dose group（10 mg·kg－1·d－1）.Tumor inhibition rate，bodyweights，immune organs index and life-prolonging effectwere recorded.Proliferation of tumor cellswere detected by western blotting and apoptosiswas examined by TUNEL assay.Results：Compared with the control group，CN-N low dose group and high dose group showed remarkable inhibition of tumor weight（t＝2.261，3.140，both P＜0.05）；no significant differences on spleen and thymus index of tumor-bearingmice（both P＞0.05）.PCNA expression levelswere greatly reduced when treated with low or high concentration of CN-N.Compared with the control group，CN-N high dose group significantly extended the survival time（t＝3.416，P＝0.003 1）.Conclusion：CN-N exhibited good antitumor activity and significantly prolonged the survival time of the tumor-bearingmice.

Clinacanthus nutans；n-butanol extracts；antitumor；apoptosis

R965

A

1671－7783（2014）03－0211－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140002

劉旭（1988—），男，碩士研究生；高靜（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：jinggao＠ujs.edu.cn

2014－01－17 ［編輯］劉星星