快速檢測肺炎鏈球菌recA、ply及16S rRNA基因的多重降落PCR方法建立及應用

侯艷嬌，羅欲承，邵晨，倪穎，邵世和

（1.江蘇大學基礎(chǔ)醫(yī)學與醫(yī)學技術(shù)學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.興化市人民醫(yī)院檢驗科，江蘇泰州225700）

快速檢測肺炎鏈球菌recA、ply及16S rRNA基因的多重降落PCR方法建立及應用

侯艷嬌1，羅欲承2，邵晨1，倪穎1，邵世和1

（1.江蘇大學基礎(chǔ)醫(yī)學與醫(yī)學技術(shù)學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.興化市人民醫(yī)院檢驗科，江蘇泰州225700）

目的：建立快速檢測肺炎鏈球菌recA、ply及16S rRNA基因的多重降落PCR方法并應用。方法：設(shè)計肺炎鏈球菌的特異基因recA、ply及其菌屬保守序列16S rRNA基因的引物，建立多重降落PCR的反應體系及條件，通過該方法檢測13株標準菌株的基因以判定recA、ply、16S rRNA基因的檢測特異性；并通過對不同稀釋度肺炎鏈球菌DNA的檢測判定該方法的靈敏度。最后，應用多重降落PCR方法檢測98份痰標本的肺炎鏈球菌，并與細胞培養(yǎng)法進行比較。結(jié)果：建立的多重降落PCR方法檢測肺炎鏈球菌的特異性達100%，靈敏度達5 pg／μL，該方法對98份痰標本中肺炎鏈球菌的檢測結(jié)果與細胞培養(yǎng)法一致。結(jié)論：成功建立檢測肺炎鏈球菌的多重降落PCR方法，靈敏度高，特異性強，可用于臨床標本肺炎鏈球菌的快速檢測。

肺炎鏈球菌；多重降落PCR；臨床標本

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumonia，SP）是細菌性感染的主要病原體之一，在世界范圍內(nèi)引起較高的發(fā)病率和死亡率，既可導致敗血癥、腦膜炎等侵襲性感染，也可導致中耳炎、肺炎等非侵襲性感染［1］。我國每年因SP相關(guān)性疾病導致的兒童死亡人數(shù)位居全球前10列［2］。該菌培養(yǎng)要求較高，耗時且培養(yǎng)檢出率較低，特別是已使用抗生素的患者標本中更加難以分離。由于SP不同菌株可能出現(xiàn)某個基因的缺失，或存在多個毒力基因，為提高檢出率，本研究嘗試建立一種可同時檢測SP的特異基因recA基因（編碼高度保守的細菌重組酶的亞基）［3］，ply基因（肺炎鏈球菌溶血素基因）［4］，以及該菌屬的保守序列16S rRNA基因的靈敏度高、特異性強的多重降落PCR方法，以用于臨床痰標本的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株及培養(yǎng)基 本研究所用菌株如表1，其中SP ATCC 49619由史利寧博士饋贈，糞腸球菌ATCC 29212由孫光明博士饋贈，b型流感嗜血桿菌ATCC10211購自美國模式菌種收集中心（ATCC），其他菌株均由江蘇大學基礎(chǔ)醫(yī)學與醫(yī)學技術(shù)學院檢驗醫(yī)學研究所保存［5］。結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿菌接種羅－琴培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)2～4周；流感嗜血桿菌ATCC 49247、b型流感嗜血桿菌ATCC 10211接種5129固體培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)24～48 h；其他菌株接種于血平板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24～48 h，即獲得各細菌的純培養(yǎng)物。

表1 用于評價引物特異性的菌株

1.1.2 試劑與儀器 瓊脂糖（Sigma公司，美國）；DL2000 DNA標準參照物、細菌基因組DNA提取試劑盒（TaKaRa公司，大連）；Taq DNA聚合酶、dNTPs（Fermantas公司，立陶宛）；PCR擴增儀（2720 Thermal Cycler，美國ABI公司）；凝膠成像及分析系統(tǒng)（SYNGENE，GENE公司）。電泳儀（Jim-X，Bio-Rad公司）；核酸檢測儀（BioPhotometer，Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計和合成 根據(jù)基因庫公布的SP的recA、ply基因序列，應用Primer premier 6.0（PremierBiosoft，美國）軟件設(shè)計recA、ply基因的特異性擴增引物；SP的保守序列16S rRNA基因的引物引用自文獻［6］。引物均由上海英駿生物科技有限公司合成，序列見表2。

表2 目的基因的引物序列

1.2.2 DNA模板的制備 純培養(yǎng)細菌DNA的提取按細菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作。收集自江蘇大學附屬醫(yī)院的98份臨床痰標本，先用0.9%NaCl洗滌2次，然后用1%胰酶37℃消化90 min，再用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。提取的DNA保存于－20℃，備用。

1.2.3 單一降落PCR 反應體系：10×PCR緩沖液2.5μL，10 mg／mL BSA 0.25μL，25 mmol／L MgCl23μL，10 mmol／L dNTP 0.5μL，5 U／μL Taq DNA聚合酶0.2μL，SP DNA模板2μL，分別將10 μmol／L recA、ply或16S rRNA的上下游引物各1μL作為引物，加入反應體系。加ddH2O 14.55μL至體系25μL。

反應條件：94℃5 min；94℃30 s，65℃（每循環(huán)降低0.5℃）30 s，72℃1 min，20個循環(huán)；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，20個循環(huán)；72℃7 min。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠6 V／cm恒壓電泳，0.5 mg／L溴化乙啶溶液染色，在凝膠成像儀下分析電泳結(jié)果。

1.2.4 多重降落PCR 反應體系：10×PCR緩沖液2.5μL，10 mg／mL BSA 0.25μL，10μmol／L recA上下游引物各3μL，10μmol／L ply上下游引物各0.25μL，10μmol／L 16S rRNA上下游引物各0.5 μL，25 mmol／L MgCl23μL，10 mmol／L dNTP 0.5 μL，5 U／μL Taq DNA聚合酶0.2μL，DNA模板2μL，加ddH2O 9.05μL至體系25μL。

反應條件：94℃5 min；94℃30 s，65℃（每循環(huán)降低0.5℃）30 s，72℃1 min，20個循環(huán)；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，20個循環(huán)；72℃7 min。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠6 V／cm恒壓電泳，0.5 mg／L溴化乙啶溶液染色，在凝膠成像儀下分析電泳結(jié)果。

1.2.5 多重降落PCR體系特異性檢測 采用13種常見菌株的DNA作模板，其中SP為陽性對照，ddH2O為陰性對照，通過多重降落PCR方法觀察對recA、ply、16S rRNA3種基因檢測的特異性。

1.2.6 多重降落PCR體系靈敏度檢測 1.5 mL SP純培養(yǎng)液提取的基因組DNA，經(jīng)核酸蛋白檢測儀于260 nm檢測，其質(zhì)量濃度為0.5 ng／μL。將0.5 ng DNA進行10倍梯度稀釋后獲得5，0.5，0.05，0.005，0.000 5 ng／μL的DNA，分別以其為模板進行多重降落PCR反應檢測recA、ply、16S rRNA基因，試驗重復2次，將產(chǎn)生特異性可見條帶的最低DNA濃度定為檢測下限。

1.2.7 應用多重降落PCR檢測臨床痰標本中的SP 將10μL已消化的98份臨床痰標本接種于巧克力平板、血平板以及麥康凱平板，在5%CO2，35℃條件下孵育24～48 h后，進行細菌鑒定。同時，用已建立的多重降落PCR方法檢測98份臨床痰標本中提取的DNA，與傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)法鑒定SP的結(jié)果相比較，以驗證其可靠性。

2 結(jié)果

2.1 降落PCR擴增結(jié)果

單一降落PCR擴增時，SP的recA、ply、16S rRNA 3種基因擴增片段長度分別為735、581、217 bp。多重降落PCR擴增時，3對引物混合后產(chǎn)生可區(qū)分的目的片段，且無非特異性擴增（圖1）。

圖1 降落PCR擴增目的基因

2.2 多重降落PCR體系的特異性

用已建立的多重降落PCR方法檢測常見的13種菌株，結(jié)果顯示只有陽性對照SP可擴增出recA、ply、16S rRNA3種基因的特異性條帶，與其他菌株無交叉反應，特異性達100%，如圖2。

圖2 多重降落PCR特異性評價

2.3 多重降落PCR體系的靈敏度

不同濃度SP DNA經(jīng)多重降落PCR反應檢測，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生特異性可見條帶的最低DNA濃度為0.005 ng／μL（5 pg／μL），即為靈敏度（圖3）。

2.4 臨床痰標本檢測

對98份臨床痰標本基因組DNA進行多重降落PCR方法檢測SP，發(fā)現(xiàn)在25份SP培養(yǎng)陽性的痰標本基因組DNA中均成功擴增出特異性條帶，兩種檢測結(jié)果相一致，但多重降落PCR方法的檢測時間大大縮短。圖4為部分臨床痰標本的擴增結(jié)果。

3 討論

SP主要存在于人類上呼吸道黏膜表面，引起細菌性肺炎、腦膜炎和SP性敗血?。?］。兒童社區(qū)獲得性肺炎中，SP感染占30%～35%［8］；在住院患者中，院內(nèi)獲得性肺炎位居院內(nèi)獲感染的第2位或第3位，是較常見的死亡原因。而快速檢測和鑒定痰中的SP是及時有效控制呼吸道感染、降低藥物耐藥性的重要前提。目前檢測SP的方法還是以培養(yǎng)鏡檢法為主，然后進一步用免疫學方法進行血清分型及生化鑒定，即培養(yǎng)鏡檢法、免疫學方法（酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫熒光試驗、沉淀試驗、凝集試驗等），分子生物學方法（核酸分子雜交、基因重組法、PCR技術(shù)、生物芯片技術(shù)）等。但這些方法均分別在不同程度上存在煩瑣復雜、費時、費力，敏感性或特異性不高等缺點，對標本很難在短時間內(nèi)做出全面正確的診斷。因此，研究檢測SP的敏感、特異、快速、簡便和易于操作的方法尤為重要。

圖3 多重降落PCR靈敏度檢測

圖4 多重降落PCR檢測臨床痰標本中的Sp

PCR技術(shù)對致病菌的鑒定已不再局限于細菌的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理特性等一般檢驗上，而是從分子生物學水平研究生物大分子，特別是核酸結(jié)構(gòu)及其組成部分，而且PCR敏感度高、特異性強、操作簡便、快速，已被廣泛應用于致病菌的檢測。但常規(guī)PCR一次實驗只能針對致病菌的單一基因，而SP可能會出現(xiàn)某個基因的缺失，或存在多個毒力基因。多重PCR根據(jù)致病菌的毒素基因、高度保守基因及特異性基因，設(shè)計合成多對寡核苷酸引物，建立多重PCR反應體系，降落PCR通過將退火溫度從65℃經(jīng)每一循環(huán)降低0.5℃共20個循環(huán)降至55℃，有效解決了退火溫度不合適時PCR產(chǎn)物的非特異性結(jié)合及引物與模板的結(jié)合率低的問題，顯著提高了檢測靈敏度。

近年來已有PCR方法檢測SP的文獻報道［9－12］，然而尚無同時針對recA、ply、16S rRNA3種基因的多重降落PCR方法的報道。本研究建立的多重降落PCR體系同時檢測SP的3個基因，極大地縮短檢測時間、降低成本和提高檢出率，可為SP的檢測提供快速、敏感、特異的診斷。我們一方面選取SP的特異性基因recA、ply及該菌屬的保守序列16S rRNA基因作為目的基因設(shè)計引物，并使用Primer-BLAST在線比對、驗證引物的特異性，另一方面使用臨床常見的13種菌株作模板，SP、ddH2O分別作為陽性對照、陰性對照，驗證體系的特異性。通過雙重驗證，確保多重降落PCR體系的特異性。另外，本研究所建立的多重降落PCR對SP的檢測下限是5 pg／μL，低于Wang等［13］報道的50 pg／μL，與Tzanakaki等［14］報道的10 pg／μL相當，檢測體系較為靈敏。而且，多重降落PCR對臨床痰標本中SP的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)一致，能準確快速地檢出SP。

［1］Jauneikaite E，Jefferies JM，Hibberd ML，et al.Prevalence of Streptococcus pneumoniae serotypes causing invasive and non-invasive disease in South East Asia：a review［J］.Vaccine，2012，30（24）：3503－3514.

［2］Chen Y，DengW，Wang SM，etal.Burden of pneumonia and meningitis caused by Streptococcus pneumoniae in China among children under5 years of age：a systematic literature review［J］.PLoS One，2011，6（11）：e27333.

［3］Zbinden A，Kohler N，Bloemberg GV.recA-based PCR assay for accurate differentiation of Streptococcus pneumoniae from other viridans streptococci［J］.JClin Microbiol，2011，49（2）：523－527.

［4］Shak JR，Ludewick HP，Howery KE，et al.Novel role for the Streptococcus pneumoniae toxin pneumolysin in the assembly of biofilms［J］.MBio，2013，4（5）：eoo655－13.

［5］Luo YC，Du P，Zhao JZ，et al.A multiplex touchdown PCR for detection of Streptococcus pneumoniae，Haemophilus influenzae type b and Mycobacterium tuberculosis complex in sputum samples［J］.Trop Biomed，2012，29（3）：422－428.

［6］El Aila NA，Em ler S，Kaijalainen T，et al.The development of a 16S rRNA gene based PCR for the identification of Streptococcus pneumoniae and comparison with four other species specific PCR assays［J］.BMC Infect Dis，2010，10：104.

［7］Choi CW，An HY，Lee YJ，et al.Characterization of Streptococcus pneumoniae N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase as a novel diagnostic marker［J］.J Microbiol，2013，51（5）：659－664.

［8］Morozumi M，Chiba N，Okada T，et al.Antibiotic susceptibility in relation to genotype of Streptococcus pneumoniae，Haemophilus influenzae，and Mycoplasma pneumoniae responsible for community-acquired pneumonia in children［J］.J Infect Chemother，2013，19（3）：432－440.

［9］Dominguez J，Gali N，Matas L，et al.PCR detection of Streptococcus pneumoniae DNA in serum samples for Pneumococcal pneumonia diagnosis［J］.Clin Microbiol Infect，2001，7（3）：164－166.

［10］Mayoral C，Norona M，Baroni MR，et al.Evaluation of a nested-PCR assay for Streptococcus pneumoniae detection in pediatric patients with community-acquired pneumonia［J］.Rev Argent Microbiol，2005，37（4）：184－188.

［11］李馬超，張礪，李倩，等.肺炎鏈球菌PCR分型技術(shù)的建立與應用［J］.中華流行病學雜志，2010，31（3）：316－320.

［12］Koseoglu EO，Alp S，Ergin A，etal.Comparison of culture and real-time PCRmethods in the detection of Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae in acute otitis media effusion specimens［J］.Mikrobiyol Bul，2012，46（4）：676－681.

［13］Wang Y，Kong F，Yang Y，et al.A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization（mPCR／RLB）assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia［J］.Pediatr Pulmonol，2008，43（2）：150－159.

［14］TzanakakiG，Tsopanomichalou M，Kesanopoulos K，et al.Simultaneous single-tube PCR assay for the detection of Neisseria meningitidis，Haemophilus influenzae type b and Streptococcus pneumoniae［J］.Clin Microbiol Infect，2005，11（5）：386－390.

Establishment and application ofmultiplex touchdown PCR for rapid detection of recA，ply and 16S rRNA genes of Streptococcus pneumonia

HOU Yan-jiao1，LUO Yu-cheng2，SHAO Chen1，NIYing1，SHAO Shi-he1

（1.School of Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.Department of Clinical Laboratory，Xinghua People′s Hospital，Taizhou Jiangsu 225700，China）

Objective：To develop and applymultiplex touchdown PCR for rapid detection of recA，ply and 16S rRNA genes of Streptococcus pneumonia（SP）.M ethods：Primers based on recA，ply and the genus conserved 16S rRNA gene sequenceswere designed for Sp respectively to establishmultiplex touchdown PCR system and conditions.To evaluate the specificity of primers，DNA template prepared from 13 standard strainswere tested using the established multiplex touchdown PCR method.The sensitivity of the method was determined by detecting serial dilutions of SP DNA template.Finally，multiplex touchdown PCR was applied to detect SP in 98 cases of sputum samples，and the resultswere compared with cell culturemethod.Results：The specificity of themultiple touchdown PCR were 100%，the SP detection limits of themultiple touchdown PCR assay was5 pg／μL.The results of SP in 98 cases of sputum samples bymultiplex touchdown PCR were consistentwith cell culture.Conclusion：A higher sensitivity and specificity multiplex touchdown PCR assay was successfully developed.It could be used for rapid detection of SP in clinical samples.

Streptococcus pneumonia；multiplex touchdown PCR；clinical samples

R446.5

A

1671－7783（2014）01－0040－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130259

江蘇省科技創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化專項資金資助項目（BL2012047）

侯艷嬌（1989—），女，山東滕州人，碩士研究生；邵世和（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：shaoshihe2006＠163.com

2013－11－26 ［編輯］何承志