七氟醚預(yù)處理對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠T細(xì)胞死亡耦聯(lián)基因8表達(dá)的影響

束薇薇，邵東華，杭黎華，濮健峰，高輝德

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院麻醉科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

七氟醚預(yù)處理對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠T細(xì)胞死亡耦聯(lián)基因8表達(dá)的影響

束薇薇，邵東華，杭黎華，濮健峰，高輝德

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院麻醉科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

目的：觀察七氟醚預(yù)處理對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶內(nèi)T細(xì)胞死亡耦聯(lián)基因8（TDAG8）表達(dá)的影響。方法：選取54只成年雄性SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、再灌注組和七氟醚組，每組18只。采用大腦中動(dòng)脈內(nèi)線栓阻斷法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）制造大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。缺血2 h后再灌注48 h。七氟醚組在造模前吸入最低肺泡有效濃度（MAC）為1的七氟醚30 min，對(duì)照組和再灌注組則吸入O2。大鼠行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后處死。取大腦行2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色，計(jì)算腦梗死容積百分比，采用蛋白印跡法和RT-PCR法檢測(cè)腦缺血半暗帶內(nèi)的TDAG8蛋白和mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果：①與對(duì)照組相比，再灌注組和七氟醚組腦梗死容積百分比均顯著升高（P均＜0.05）；七氟醚組腦梗死容積百分比較再灌注組顯著降低（P＜0.05）。②與對(duì)照組相比，再灌注組和七氟醚組TDAG8蛋白和mRNA表達(dá)均顯著升高（P均＜0.05）；七氟醚組較TDAG8的表達(dá)再灌注組明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：七氟醚預(yù)處理可降低TDAG8的表達(dá)，對(duì)腦缺血再灌注損傷具有一定保護(hù)作用。

七氟醚；預(yù)處理；腦缺血再灌注；T細(xì)胞死亡耦聯(lián)基因8；大腦中動(dòng)脈內(nèi)線栓阻斷法

七氟醚是新型鹵代烴基醚類揮發(fā)性吸入麻醉藥，臨床應(yīng)用具有蘇醒快、刺激小，既能增加腦血流量，又能保留中樞自主調(diào)節(jié)等特點(diǎn)。徐仲煌等［1］研究表明，七氟醚預(yù)處理可增加腦血流量、降低腦代謝率，從而對(duì)腦組織起到保護(hù)作用。T細(xì)胞死亡耦聯(lián)基因8（T cell death-associated gene 8，TDAG8）是新近發(fā)現(xiàn)的一種G蛋白耦聯(lián)的受體，也稱為G蛋白耦聯(lián)受體65［2－3］。本課題組前期研究表明［4］，TDAG8參與腦缺血再灌注損傷。本研究旨在研究七氟醚預(yù)處理對(duì)缺血半暗帶TDAG8表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討TDAG8在腦缺血再灌注損傷中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

大腦中動(dòng)脈內(nèi)線栓阻斷（middle cerebral artery occlusion，MCAO）線栓（北京沙東生物技術(shù)有限公司），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（Sigma公司），Trizol（Invitrongen公司），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKa-Ra公司），PCR儀、SsoFast（Bio-Rad公司），兔多克隆抗G蛋白偶聯(lián)受體65（Abcam公司），β-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（Bioworld公司），山羊抗兔IgG（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），PVDF膜（GE healthcare公司），DAB顯色劑（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.2 動(dòng)物及分組

健康成年雄性SD大鼠54只，購(gòu)自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（蘇）2008-0024，體質(zhì)量250～280 g，隨機(jī)分為對(duì)照組、再灌注組和七氟醚組，每組18只。我們前期已證實(shí)假手術(shù)組TDAG8表達(dá)與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［4］，故本研究未設(shè)假手術(shù)組。

1.3 模型的制作

參照Longa等［5］大鼠MCAO法加以改良構(gòu)建大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型。用2%戊巴比妥鈉（40 mg／kg）腹腔注射麻醉大鼠，將其仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，于頸部正中切開，逐層分離組織，顯露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈。結(jié)扎頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，在頸內(nèi)動(dòng)脈上套一根線打一活結(jié)并用血管鉗夾住線的末端，將此線往外側(cè)輕拉頸內(nèi)動(dòng)脈（防止頸總動(dòng)脈破裂后血液急劇流出）；于頸總動(dòng)脈分叉下方剪一切口，將一線栓置入頸內(nèi)動(dòng)脈17～18 mm，直到有輕微阻力感為止，扎緊活結(jié)固定線栓后全層縫合皮膚。缺血2 h后抽出線栓，恢復(fù)灌注（對(duì)側(cè)半球血流經(jīng)Wills環(huán)供血）。對(duì)照組不做處理，正常喂養(yǎng)。再灌注48 h后，先行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，隨后處死大鼠。實(shí)驗(yàn)過(guò)程及大鼠蘇醒期間均保持大鼠體溫正常（實(shí)驗(yàn)過(guò)程中予以電燈泡照射，保持體溫37℃±0.5℃），監(jiān)測(cè)肛溫、呼吸及心跳。

1.4 分組處理

七氟醚組在缺血再灌注30 min前，預(yù)先吸入最低肺泡有效濃度（MAC）為1的七氟醚。將實(shí)驗(yàn)大鼠置于一半密閉的有機(jī)玻璃盒內(nèi)，體積約30 cm× 30 cm×25 cm，設(shè)有進(jìn)出氣孔各一，通過(guò)麻醉氣體揮發(fā)罐持續(xù)輸入含有2%七氟醚的O2，4 L／min，燈泡加熱，維持盒內(nèi)溫度為35～37℃，避免大鼠體溫在麻醉過(guò)程中下降。盒底鋪上鈉石灰，使PCO2＜50 kPa（0.05標(biāo)準(zhǔn)大氣壓）。大鼠保留自主呼吸。

對(duì)照組和再灌注組在缺血再灌注30 min前，吸入O2（4 L／min），其他同七氟醚組。

1.4.1 觀察指標(biāo) 動(dòng)物恢復(fù)及神經(jīng)功能損害評(píng)估：麻醉蘇醒后，將動(dòng)物放回鼠籠，自由飲食。腦缺血-再灌注后，由一不了解分組情況的觀察者評(píng)估記錄神經(jīng)功能障礙評(píng)分，方法參考文獻(xiàn)［5］，即6級(jí)評(píng)分法：0分，無(wú)功能障礙；1分，不能伸展右側(cè)前肢；2分，向右側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分，向右側(cè)傾倒；4分，無(wú)自主活動(dòng)伴意識(shí)障礙；5分，死亡。

1.4.2 造模成功的標(biāo)準(zhǔn) 神經(jīng)功能障礙評(píng)分為1～3分，取腦時(shí)蛛網(wǎng)膜下腔無(wú)出血。

1.5 TTC染色及腦梗死灶測(cè)量

完成大鼠神經(jīng)功能障礙評(píng)分后，行2%戊巴比妥鈉深麻醉，斷頭處死。迅速取出鼠腦，置于冰鹽水中10 min，取冠狀面，均勻切片2 mm，迅速放入2% TTC溶液（37℃）中染色30 min，然后用10%甲醛液固定。24 h后用數(shù)碼相機(jī)（KODAK，DC240）將切片拍照，輸入計(jì)算機(jī)，用圖像處理軟件（ADOBE PHOTOSHOP 5.0）計(jì)算梗死容積（粉紅色區(qū)為正常腦組織，白色區(qū)為腦梗死組織）百分比，即梗死灶占對(duì)側(cè)正常大腦半球的百分比。

1.6 熒光定量RT-PCR檢測(cè)TDAG8 mRNA

腦缺血半暗帶的范圍為冠狀面距額極7～11 mm，缺血側(cè)大腦縱裂到大腦外側(cè)溝皮層上1／3并去除縱裂內(nèi)切1 mm的組織區(qū)域（大腦前動(dòng)脈供血）。

Trizol抽提大鼠缺血半暗帶總RNA，測(cè)定其濃度，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。cDNA的PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。TDAG8引物長(zhǎng)度為199 bp，引物序列：上游5′-CATTTTAGAGCGCAACGTGA-3′，下游5′-TTGTCCTCGGGATCTATTGC-3′。選用β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，其引物長(zhǎng)度為207 bp，引物序列：上游5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′；下游5′-CCC ATACCCACCATCACACC-3′。采用實(shí)時(shí)定量PCR法，將cDNA產(chǎn)物從56℃緩慢提升到95℃，每升高0.2℃讀1次熒光值，共40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行熔解曲線分析。以β-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)量為參照標(biāo)準(zhǔn)，按照2－△△Ct計(jì)算TDAG8 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TDAG8蛋白的表達(dá)

提取各組大鼠缺血半暗帶腦組織總蛋白，采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量后行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST 4℃封閉過(guò)夜。一抗（兔多克隆抗G蛋白偶聯(lián)受體65，1∶5 000）孵育過(guò)夜，洗滌后加入二抗（山羊抗兔IgG，1∶5 000），室溫孵育1 h，洗滌后用Bio-Rad顯色，掃描并用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶的相對(duì)分子質(zhì)量和凈光密度值，以各蛋白與內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白的比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死容積百分比

與對(duì)照組相比，再灌注組和七氟醚組腦梗死容積百分比均顯著升高（F＝375.071，P＜0.001）；七氟醚組腦梗死容積百分比較再灌注組顯著降低（t＝4.023，P＜0.01）。見圖1。

2.2 腦缺血半暗帶內(nèi)TDAG8 mRNA及蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組相比，再灌注組和七氟醚組TDAG8 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著升高（P均＜0.001），且七氟醚組TDAG8 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)明顯低于再灌注組（t分別為4.459，5.431；P值分別為0.015，0.001 7）。見表1，圖2。

圖1 各組腦組織TTC染色圖

表1 各組大鼠腦缺血半暗帶內(nèi)TDAG8 mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量 x－±s

圖2 大鼠腦缺血半暗帶內(nèi)TDAG8蛋白的表達(dá)

3 討論

近來(lái)研究顯示，吸入麻醉藥預(yù)處理，可以模擬缺血預(yù)處理，減輕腦缺血再灌注損傷。研究證實(shí)，在成年嚙齒類動(dòng)物永久或短暫局灶性腦缺血模型中，異氟醚或七氟醚預(yù)處理能顯著減少腦梗死面積，改善缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)［6－7］。Payne等［8］在全腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ脱芯恐凶C實(shí)，1 MAC的七氟醚具有腦保護(hù)作用，并且一次給予七氟醚30 min已經(jīng)足夠誘導(dǎo)早期預(yù)處理對(duì)全腦缺血的保護(hù)作用。所以本實(shí)驗(yàn)采用在缺血再灌注前預(yù)先吸入1 MAC的七氟醚30 min進(jìn)行預(yù)處理。鑒于大鼠腦缺血2 h后梗死灶趨于穩(wěn)定［9］，我們之前的實(shí)驗(yàn)將大鼠分為5組，分別為對(duì)照組，缺血再灌注6、12、24、48 h組，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組大鼠缺血半暗帶內(nèi)TDAG8的表達(dá)，結(jié)果顯示，再灌注48 h時(shí)，缺血半暗帶內(nèi)TDAG8的表達(dá)最高（未發(fā)表）。所以本實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、再灌注組和七氟醚組，其中七氟醚組在缺血再灌注前預(yù)先吸入1 MAC七氟醚30 min。

TDAG8在T淋巴細(xì)胞程序性死亡過(guò)程中高表達(dá)，表明其可能參與活化誘導(dǎo)T細(xì)胞死亡，因此得名［2－3］。TDAG8主要存在于外周血白細(xì)胞、脾臟、淋巴結(jié)、胸腺組織中［10］，另外在正常大鼠腦組織，如杏仁核、下丘腦、海馬、額皮質(zhì)、紋狀體等部位，也有明顯表達(dá)［11］。TDAG8屬于7次跨膜的G蛋白耦聯(lián)受體，由α、β、γ3個(gè)亞基組成異源三聚體。根據(jù)α亞基可將G蛋白分為Gi、Gs、Gq、G12／13等型。G蛋白的分子構(gòu)象有結(jié)合GDP的失活態(tài)和結(jié)合GTP的激活態(tài)2種。激活態(tài)的G蛋白可激活下游的效應(yīng)器，如腺苷酸環(huán)化酶、磷脂酶C和磷脂酶A2等，進(jìn)而催化生成（或分解）第二信使，通過(guò)激活蛋白激酶A、C等通路來(lái)調(diào)控活化的T細(xì)胞核因子的表達(dá)。Wang等［12］研究結(jié)果顯示，七氟醚通過(guò)激活腺苷A1受體，進(jìn)而激活Gi蛋白及蛋白激酶C，再激活線粒體和肌纖維膜上的ATP敏感性鉀通道以及有絲分裂原活化的蛋白激酶；ATP敏感性鉀通道可通過(guò)縮短動(dòng)作電位和減少鈣離子的流入來(lái)發(fā)揮心肌保護(hù)作用，提示七氟醚也可通過(guò)該途徑發(fā)揮對(duì)腦的保護(hù)作用。由于胞內(nèi)各條信號(hào)通路并不是完全孤立存在，而是相互影響相互“對(duì)話”（cross-talk），所以，我們推測(cè)七氟醚對(duì)TDAG8表達(dá)的下調(diào)可能是通過(guò)某條或幾條信號(hào)通路來(lái)調(diào)控的，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，七氟醚組較再灌注組腦梗死容積百分比顯著降低，提示七氟醚預(yù)處理后能顯著減小腦梗死體積，對(duì)腦缺血再灌注損傷具有一定保護(hù)作用。從基因表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)這兩方面發(fā)現(xiàn)，七氟醚處理后腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶內(nèi)TDAG8 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降，且接近于未缺血再灌注損傷水平。由此得出，七氟醚預(yù)處理降低了TDAG8在損傷腦組織中的表達(dá)，結(jié)合TDAG8在再灌注組中的高表達(dá)，我們推測(cè)TDAG8在腦組織再灌注后會(huì)加劇其損傷程度。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TDAG8在腦缺血再灌注損傷中可能起損傷作用，而七氟醚預(yù)處理對(duì)其損傷具有保護(hù)作用。

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Effect of sevoflurane preconditioning on the expression of T cell death-associated gene 8 follow ing focal cerebral ischem ia-reperfusion injury in rats

SHUWei-wei，SHAO Dong-hua，HANG Li-hua，PU Jian-feng，GAO Hui-de

（Department of Anesthesiology，Affiliated People′s Hospital，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To observe the effect of sevoflurane preconditioning on the expression of T cell death-associated gene 8（TDAG8）in the penumbra of rat cortex after focal cerebral ischemia-reperfusion injury.M ethods：Fifty-four adult male SD rats were equally randomly divided into three groups：control group，reperfusion group and sevoflurane group.The focal cerebral ischemia-reperfusionmodelswere established bymiddle cerebral artery occlusion（MCAO）method.The reperfusion group and sevoflurane group were reperfused for 48 h after ischemia for 2 h.In sevoflurane group the rats inhaled 1 MAC sevoflurane for 30 min before MCAO，while control group and reperfusion group inhaled oxygen.After neurological function appraising，all animals were killed.Infarct volume，as a percentage of volume at normal cerebral hemisphere，was determined by 2，3，5-triphenylte-trazolium（TTC）staining and real-time PCR；Western blotting were used to detect the levels ofmRNA and protein expression of TDAG8.Results：①Compared with the control group，the infarct volume in reperfusion group and sevoflurane group were significantly larger（P＜0.05）；compared with the reperfusion group，the infarct volume in sevoflurane group was decreased significantly（P＜0.05）.②Compared with the control group，the expression ofmRNA and protein of TDAG8 in reperfusion group and sevoflurane group were increased significantly（both P＜0.05）；the expression of mRNA and protein of TDAG8 in sevoflurane group were markedly decreased than the reperfusion group（P＜0.05）.Conclusion：Sevoflurane preconditioning could downregulate the expression of TDAG8 in the penumbra of rat cortex，which might protect against cerebral ischemia from reperfusion insult.

sevoflurane；preconditioning；brain ischemia-reperfusion；T cell death-associated gene 8；middle cerebral artery occlusion

R743.31

A

1671－7783（2014）01－0036－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y120131

束薇薇（1987—），女，碩士研究生；邵東華（通訊作者），主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：shaodonghua1964＠yahoo.com.cn

2012－11－18 ［編輯］劉星星