KSHV vFLIP在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)及其功能驗(yàn)證

金镠洋，嚴(yán)沁，盧春

（南京醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)系，江蘇南京210029）

KSHV vFLIP在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)及其功能驗(yàn)證

金镠洋，嚴(yán)沁，盧春

（南京醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)系，江蘇南京210029）

目的：構(gòu)建含卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒（Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）編碼的病毒FLICE抑制蛋白（viral FLICE inhibitory protein，vFLIP）基因的重組慢病毒表達(dá)載體，獲得穩(wěn)定表達(dá)vFLIP的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），并檢測(cè)vFLIP在HUVECs中活化NF-κB信號(hào)通路的能力。方法：以真核表達(dá)質(zhì)粒pEF-vFLIP為模板擴(kuò)增vFLIP基因，插入至慢病毒載體pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green中構(gòu)建重組質(zhì)粒pHAGE-vFLIP。利用脂質(zhì)體將其與包裝質(zhì)粒psPAX2和包膜質(zhì)粒pMD2.G共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，收集過(guò)濾后的培養(yǎng)上清獲得慢病毒懸液。利用梯度稀釋法測(cè)定病毒滴度后，以一定感染復(fù)數(shù)的慢病毒感染HUVECs，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)vFLIP的表達(dá)。經(jīng)綠色熒光蛋白（GFP）流式分選以及蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證獲得穩(wěn)定表達(dá)vFLIP的HUVECs。最后，通過(guò)蟲熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NF-κB的活性，免疫熒光染色檢測(cè)NF-κB亞基p65的細(xì)胞定位，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)IκBα蛋白的表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)穩(wěn)定表達(dá)vFLIP蛋白的HUVECs功能。結(jié)果：核酸序列測(cè)定證實(shí)含vFLIP基因的慢病毒表達(dá)載體已構(gòu)建成功。重組慢病毒感染HUVECs后可檢測(cè)到vFLIP的表達(dá)。通過(guò)流式分選獲得了穩(wěn)定表達(dá)vFLIP的HUVECs細(xì)胞，并且能通過(guò)抑制IκBα的降解，阻礙p65入核來(lái)活化NF-κB，從而激活經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路。結(jié)論：成功包裝了含KSHV vFLIP基因的重組慢病毒，并獲得具有激活NF-κB信號(hào)通路功能、穩(wěn)定表達(dá)vFLIP的HUVECs株。

慢病毒；卡波氏肉瘤；病毒FLICE抑制蛋白；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；核因子-κB

卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒（Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）又稱人類皰疹病毒8型（human herpesvirus 8，HHV-8），屬于γ-2型皰疹病毒，主要感染內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。KSHV是由Chang等［1］于1994年在人類獲得性免疫缺陷綜合征有關(guān)的卡波氏肉瘤組織中發(fā)現(xiàn)的。研究證實(shí)，KSHV作為卡波氏肉瘤的病原體，同時(shí)與以下兩種疾病密切相關(guān)，即原發(fā)性滲出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）和多中心卡斯特萊曼?。?］。

卡波氏肉瘤是一種與血管生成密切相關(guān)的惡性腫瘤，常見(jiàn)于皮膚、黏膜以及內(nèi)臟器官。大量的梭形細(xì)胞、炎性細(xì)胞以及異常增生的新生血管分布在卡波氏肉瘤瘤體組織中［3］。目前已有多個(gè)KSHV編碼蛋白被證實(shí)具有致瘤特性，包括病毒白細(xì)胞介素6（viral interleukin-6，vIL-6）、病毒干擾素調(diào)節(jié)因子（viral interferon regulatory factors，vIRFs）、病毒G蛋白耦聯(lián)受體（viral G protein coupled receptor，vGPCR）以及病毒FLICE抑制蛋白（viral FLICE inhibitory protein，vFLIP）等［3－4］。其中，由KSHV K13基因編碼的vFLIP是一個(gè)在潛伏期表達(dá)的重要致瘤蛋白［4］，結(jié)構(gòu)上與caspase-8／FLICE的前導(dǎo)肽相似。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，vFLIP并不能抑制caspase-8，而是通過(guò)活化核因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）信號(hào)通路［5－7］，促進(jìn)細(xì)胞的存活、增殖，細(xì)胞因子分泌以及腫瘤形成［8－11］。

本課題組先前的研究表明，KSHV編碼的vIL-6能夠通過(guò)自分泌和旁分泌方式促進(jìn)卡波氏肉瘤組織中梭形細(xì)胞的主要前體細(xì)胞——內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)血管腫瘤形成［12］。鑒于vFLIP同為KSHV重要的致瘤蛋白，本研究構(gòu)建了含KSHV vFLIP基因的重組慢病毒表達(dá)載體，并獲得了穩(wěn)定表達(dá)vFLIP的血管內(nèi)皮細(xì)胞株，以期為今后研究vFLIP在內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成的作用做好實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和慢病毒載體系統(tǒng)

人胚腎上皮293 T細(xì)胞（HEK 293 T細(xì)胞，以下簡(jiǎn)稱293 T）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）為本室保存。這兩種細(xì)胞需要在5%CO2、37℃環(huán)境條件下生長(zhǎng)于DMEM中，還需添加滅活胎牛血清（293 T細(xì)胞和HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)密度分別為10%和20%）、鏈霉素（100μg／mL）、青霉素（80 U／mL）和慶大霉素（80 μg／mL）。實(shí)驗(yàn)中所使用的胎牛血清和培養(yǎng)基均為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品。

慢病毒載體pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green、包膜質(zhì)粒pMD2.G以及包裝質(zhì)粒psPAX2三者共同構(gòu)成慢病毒載體系統(tǒng)［12］。含vFLIP基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pEF-vFLIP為本室構(gòu)建并保存［5］。表達(dá)海腎熒光素酶的質(zhì)粒pRL-TK購(gòu)自美國(guó)Promega公司，NF-κB蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒由本室保管［6］。

1.2 試劑

質(zhì)粒小量提取試劑盒、凝膠純化試劑盒為美國(guó)Omega公司產(chǎn)品。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)買自美國(guó)Invitrogen公司。PCR高保真酶Primer STAR HS為大連寶生物工程（TaKaRa）有限公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用的工具酶、蛋白標(biāo)準(zhǔn)參照物以及核酸標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量參照均為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。PCR引物為上海英濰捷基（Invitrogen）有限公司合成?；驕y(cè)序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成?？?Flag M2單克隆抗體、抗-α-微管蛋白單克隆抗體、抗-IκBα單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司?？?NF-κB p65多克隆抗體為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品。Alexa Fluor 555標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）為中國(guó)碧云天公司產(chǎn)品。雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 vFLIP基因的擴(kuò)增和含vFLIP基因重組質(zhì)粒pHAGE-vFLIP的構(gòu)建 vFLIP基因上游引物：5′-CTAGCTAGC GCCACC ATGGCCACTT-3′（斜體部分為Kozak序列，下劃線部分為NheⅠ識(shí)別序列）；下游引物：5′-CGCGGATCCTCA CTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTC TGGTGTA-3′（斜體部分為Flag標(biāo)簽蛋白編碼序列，下劃線部分為Bam HⅠ識(shí)別序列）。

應(yīng)用PCR法從pEF-vFLIP質(zhì)粒中擴(kuò)增出vFLIP基因。PCR反應(yīng)條件：94℃變性5 min，然后98℃15 s，58℃30 s，72℃1min擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸6 min。獲得的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收備用。

vFLIP PCR回收產(chǎn)物和慢病毒載體需在37℃條件下進(jìn)行限制性內(nèi)切酶NheⅠ、Bam HⅠ雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠純化后用T4DNA連接酶于4℃連接12～16 h。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選氨芐西林抗性菌落，獲得重組質(zhì)粒。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序分析。大量提取經(jīng)序列鑒定正確的重組質(zhì)粒，命名該質(zhì)粒為pHAGE-vFLIP。

1.3.2 慢病毒包裝與滴度測(cè)定 用pHAGE-vFLIP、psPAX2、pMD2.G 3種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，將細(xì)胞置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。10 h后吸棄原培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基以終止轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)24 h后通過(guò)熒光顯微鏡可以觀察到綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達(dá)。48 h后收集含有病毒顆粒（Lv-vFLIP）的細(xì)胞培養(yǎng)上清。陰性對(duì)照為慢病毒空載體pHAGE-Mock，所獲得的病毒為L(zhǎng)v-Mock。獲得病毒后按實(shí)驗(yàn)步驟計(jì)算病毒滴度［8］。

1.3.3 vFLIP基因在HUVECs細(xì)胞中的表達(dá) 將HUVECs細(xì)胞接種于明膠包被的6孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為0.5×106／mL，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)。24 h后去除培養(yǎng)基，用重組慢病毒Lv-vFLIP或空載體Lv-Mock上清感染HUVECs細(xì)胞，8 h后吸棄上清加入新鮮培養(yǎng)基以終止感染。感染72 h后，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)vFLIP在細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.3.4 穩(wěn)定表達(dá)vFLIP的內(nèi)皮細(xì)胞的構(gòu)建 按“1.3.3”所述方法感染HUVECs細(xì)胞。72 h后以未感染的HUVECs細(xì)胞為對(duì)照，流式細(xì)胞儀分選出GFP表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，置于含20%滅活胎牛血清的DMEM中繼續(xù)培養(yǎng)。獲得的高陽(yáng)性率感染細(xì)胞分別命名為HUVEC-vFLIP和HUVEC-Mock，并提取細(xì)胞總蛋白，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)vFLIP在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。

1.3.5 蟲熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NF-κB活性 轉(zhuǎn)染前24 h將HUVEC-vFLIP細(xì)胞和HUVEC-Mock細(xì)胞按每孔0.3×105／mL密度接種于48孔板。按LipofectamineTM2000說(shuō)明書推薦步驟將NF-κB蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與pRL-TK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVECs細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后蟲熒光素酶和海腎熒光素酶可以產(chǎn)生熒光，按照雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)介紹的方法檢測(cè)熒光強(qiáng)度。參照海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒熒光強(qiáng)度，以獲得標(biāo)準(zhǔn)化后的蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)?；钚?。

1.3.6 免疫熒光法（immunofluorescence assay，IFA）檢測(cè)p65的表達(dá) 用0.25%胰酶消化HUVEC-vFLIP和HUVEC-Mock細(xì)胞，將重懸細(xì)胞分別接種于玻底培養(yǎng)皿中。次日，棄去皿中培養(yǎng)基并用PBS洗滌，待皿自然風(fēng)干后以冰丙酮固定20 min；PBS洗滌后于37℃以0.5%Triton X-100穿膜30min，0.5% BSA封閉1 h。加入以0.5%BSA 1∶50稀釋的抗-p65單克隆抗體，于4℃孵育過(guò)夜。第2天加入以0.5%BSA（1∶200）稀釋的Alexa Fluor555標(biāo)記羊抗鼠IgG以及DAPI。染色后用Zeiss Axiovert 200 M金相顯微鏡觀測(cè)p65定位的變化。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以熒光強(qiáng)度的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示各組蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)?；钚?，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增vFLIP基因

以pEF-vFLIP質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出vFLIP基因，全長(zhǎng)約625 bp（圖1 A），基因大小正確。

2.2 鑒定pHAGE-vFLIP重組質(zhì)粒

重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶NheⅠ、Bam HⅠ雙酶切，產(chǎn)生載體pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green和vFLIP兩個(gè)基因片段，大小分別約為4 625 bp和625 bp（圖1 B）。經(jīng)核酸序列分析軟件DNAssist比對(duì)，結(jié)果顯示克隆基因序列與基因庫(kù)中登記的vFLIP基因序列完全一致，說(shuō)明重組質(zhì)粒pHAGE-vFLIP構(gòu)建成功。

圖1 PCR擴(kuò)增vFLIP基因以及NheⅠ、Bam HⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pHAGE-vFLIP

2.3 慢病毒包裝及其滴度的測(cè)定

將pHAGE-vFLIP、psPAX2和pMD2.G 3種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，24 h后可以觀察到GFP的表達(dá)（圖2）。通過(guò)熒光計(jì)數(shù)法測(cè)得重組慢病毒vFLIP（Lv-vFLIP）滴度和空載體病毒Mock（Lv-Mock）滴度分別約為3×106TU／mL和4×106TU／mL。

圖2 3種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞36 h后GFP的表達(dá)（×100）

2.4 HUVECs內(nèi)vFLIP的表達(dá)

HUVECs細(xì)胞經(jīng)過(guò)Lv-vFLIP感染48 h后提取細(xì)胞蛋白，以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)vFLIP蛋白的表達(dá)，同時(shí)以Lv-Mock作為對(duì)照。結(jié)果顯示，一條特異性條帶在約22 000處出現(xiàn)，而vFLIP-Flag蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量正是22 000（圖3）。這說(shuō)明Lv-vFLIP能夠有效感染HUVECs細(xì)胞，并介導(dǎo)vFLIP蛋白在其中表達(dá)。

圖3 重組慢病毒介導(dǎo)vFLIP在HUVECs細(xì)胞中的蛋白表達(dá)

2.5 穩(wěn)定表達(dá)vFLIP的血管內(nèi)皮細(xì)胞株的獲得

用Lv-vFLIP感染HUVECs細(xì)胞，并將細(xì)胞進(jìn)行流式分選以獲得GFP陽(yáng)性率近100%的細(xì)胞，即HUVEC-vFLIP細(xì)胞。同時(shí)以同樣方法獲得的HUVEC-Mock細(xì)胞作為對(duì)照（圖4）。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)兩種細(xì)胞蛋白，發(fā)現(xiàn)HUVEC-vFLIP細(xì)胞在約22 000處出現(xiàn)特異性條帶（圖5），提示vFLIP在流式分選后所獲得的HUVEC-vFLIP細(xì)胞中獲得穩(wěn)定表達(dá)。

圖4 流式分選獲得的HUVEC-vFLIP細(xì)胞和HUVEC-M ock細(xì)胞（×100）

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)兩類細(xì)胞中vFLIP的表達(dá)

2.6 穩(wěn)定表達(dá)vFLIP的血管內(nèi)皮細(xì)胞株的功能驗(yàn)證

鑒于vFLIP能夠激活經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路，我們將NF-κB蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和表達(dá)海腎熒光素酶的pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HUVEC-Mock和HUVEC-vFLIP細(xì)胞。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，HUVEC-vFLIP細(xì)胞組的蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒活性（1.6 ±0.17）明顯高于對(duì)照組（1.0±0.12，t＝4.53，P＝ 0.006 9）。這說(shuō)明穩(wěn)定表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的vFLIP有效活化了NF-κB信號(hào)。

進(jìn)一步采用IFA檢測(cè)NF-κB亞基p65在穩(wěn)定表達(dá)vFLIP的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的定位。如圖6所示，與HUVEC-Mock細(xì)胞核中的p65表達(dá)量相比，移位進(jìn)入HUVEC-vFLIP細(xì)胞核中的p65明顯增多。提示穩(wěn)定表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的vFLIP能誘導(dǎo)p65的核轉(zhuǎn)位，從而發(fā)揮活化NF-κB的生物學(xué)功能。

進(jìn)一步提取HUVEC-Mock和HUVEC-vFLIP的細(xì)胞總蛋白，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)IκBα蛋白的表達(dá)。與對(duì)照組比較，HUVEC-vFLIP細(xì)胞中IκBα蛋白表達(dá)量明顯降低，表明穩(wěn)定表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的vFLIP可通過(guò)抑制IκBα的降解，阻礙p65入核，從而激活經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路（圖7）。

圖6 穩(wěn)定表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的vFLIP對(duì)p65亞基細(xì)胞定位的影響（×400）

圖7 IκBα蛋白在HUVEC-M ock和HUVEC-vFLIP細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

FLIP（FLICE抑制蛋白）的全稱是Fas相關(guān)死亡區(qū)域蛋白樣白介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白，是新近發(fā)現(xiàn)的一種與惡性腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移侵襲密切相關(guān)的凋亡抑制蛋白，能通過(guò)抑制Fas以及腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡促進(jìn)腫瘤生成［8－9］。FLIP首先是由Thome等［13］在病毒研究中發(fā)現(xiàn)，被KSHV感染的細(xì)胞凋亡率明顯低于正常細(xì)胞，在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用的為病毒型FLIP（vFLIP）。隨后研究者們又發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細(xì)胞的胞質(zhì)中有一種類似于vFLIP、呈高水平表達(dá)的蛋白，稱為細(xì)胞型FLIP（cFLIP）［10］。vFLIP與cFLIP具有一定的同源性，且都能抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。但是，兩種類型的FLIP之間也存在明顯的區(qū)別。cFLIP主要通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡蛋白caspase-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來(lái)促進(jìn)細(xì)胞分化和腫瘤形成；而vFLIP主要通過(guò)誘導(dǎo)經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)腫瘤生成［11］。既往研究證明，vFLIP可以與IκB激酶（IκB kinase，IKK）IKKγ結(jié)合進(jìn)而招募IKKα和IKKβ形成復(fù)合物，IKK復(fù)合物活化后使下游的IκB降解，進(jìn)而使“囚禁”于胞質(zhì)的NF-κB二聚體p50／p65釋放進(jìn)入細(xì)胞核，從而調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞分化與腫瘤形成［14－17］。

vFLIP在卡波氏肉瘤組織中的表達(dá)，在促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和抑制細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著一定的作用，而其表現(xiàn)出的功能大多都依賴于NF-κB信號(hào)通路［18］。目前研究證實(shí)，vFLIP能夠保護(hù)KSHV潛伏感染的B淋巴細(xì)胞存活，其機(jī)制是通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制抗IgM誘導(dǎo)的生長(zhǎng)阻滯與細(xì)胞凋亡［19］，而下調(diào)KSHV感染的PEL細(xì)胞系中vFLIP的表達(dá)則會(huì)引起細(xì)胞凋亡和壞死［20－21］。鋅指蛋白A20能夠通過(guò)抑制腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF）和RNAⅢ抑制肽（RNAⅢ-inhibiting peptide，RIP）來(lái)阻斷經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而降低趨化因子IP-10的表達(dá)以抑制vFLIP誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖［22］。此外，vFLIP還能通過(guò)NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)IL-8和CXCL16的分泌［23－24］。vFLIP還可以調(diào)控Notch信號(hào)通路［25］，同時(shí)下調(diào)AP-1信號(hào)通路來(lái)抑制KSHV分子“開(kāi)關(guān)基因”復(fù)制轉(zhuǎn)錄激活因子（replication and transcription activator，RTA）的啟動(dòng)子活性，進(jìn)而抑制KSHV的裂解性復(fù)制和病毒顆粒的產(chǎn)生［26］。

依賴NF-κB通路的vFLIP能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和腫瘤的生成。近來(lái)的研究表明，vFLIP能夠通過(guò)上調(diào)zeste基因增強(qiáng)子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）的表達(dá)來(lái)促進(jìn)血管生成［27］。然而目前有關(guān)KSHV vFLIP促進(jìn)卡波氏肉瘤組織中梭形細(xì)胞的主要前體細(xì)胞——內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成的分子機(jī)制尚不清楚。為此，本研究利用慢病毒載體系統(tǒng)，構(gòu)建含有vFLIP基因的重組慢病毒，獲得了高陽(yáng)性率的穩(wěn)定表達(dá)vFLIP的HUVECs。通過(guò)蟲熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、免疫熒光染色和蛋白質(zhì)印跡法，證明穩(wěn)定表達(dá)vFLIP的HUVECs能有效抑制IκBα的降解，阻礙p65的核轉(zhuǎn)運(yùn)，最終活化NF-κB信號(hào)。NF-κB二聚體p50／p65轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核后，通過(guò)調(diào)控哪些基因的轉(zhuǎn)錄從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖遷移、血管生成和腫瘤形成，目前尚未可知。本研究所獲得的穩(wěn)定表達(dá)KSHV vFLIP，并且具備激活經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路功能的HUVECs，為今后進(jìn)一步研究KSHV vFLIP促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成的分子機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也有助于闡明卡波氏肉瘤的發(fā)病機(jī)制。

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Construction of the recombinant expression lentivirus vector carrying KSHV vFLIP gene and its protein expression in human umbilical vein endothelial cells

JIN Liu-yang，YAN Qin，LU Chun

（Department of Microbiology and Immunology，Nanjing Medical University，Nanjing Jiangsu 210029，China）

Objective：To construct the recombinant lentivirus carrying Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus（KSHV）-encoded viral FLICE inhibitory protein（vFLIP）gene and to obtain human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）stably expressing vFLIP protein.M ethods：The fragment of vFLIP gene from expression plasmid pEF-vFLIP was cloned into the lentivirus vector pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green.Then，the recombinant plasmid pHAGE-vFLIP，packaging plasmid psPAX2 and envelope plasmid pMD2.G were co-transfected into 293 T cells.The filtered culturemediawere harvested and the recombinant lentiviruswas obtained.After detecting the titer of recombinant lentivirus，the expression of vFLIP protein in lentivirus-infected HUVECswas detected byWestern blot.Next，HUVECs stably expressing vFLIPwere obtained by flow cytometry assay（FCM）and verified the expression of vFLIPbyWestern blot.Finally，the functional verificationswere performed in HUVECs stably expressing vFLIP，including detecting the activity of NF-κB by luciferase assay，the location of p65 by immunofluorescence assay（IFA），and the expression of IκBαprotein byWestern blot.Results：The recombinant lentivirus vector containing vFLIPwas constructed successfully，and the expression of vFLIP in HUVECs infected with lentivirus-vFLIPwas detectable.The HUVECs stably expressing vFLIP were gained successfully by FCM，which could inhibit the degradation of IκBαand the translocation of p65 to activate NF-κB pathway.Conclusion：The recombinant lentivirus carrying KSHVvFLIP gene was successfully constructed，and the HUVECs stably expressing vFLIPwith the ability of activating NF-κB pathway were obtained.

recombinant lentivirus；Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus；viral FLICE inhibitory protein；human umbilical vein endothelial cells；NF-κB

R392.11

A

1671－7783（2014）01－0006－06

10.13312／j.issn.1671-7783.y130235

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81371824）

金镠洋（1986—），女，碩士研究生；盧春（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：clu＠njmu.edu.cn

2013－10－17 ［編輯］陳海林