超微粉碎對羅勒顯微特征及總黃酮體外溶出的影響

張海英，劉 飛

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 830000)

羅勒(OcimumbasilicumL.)為唇形科植物羅勒的干燥地上部分，一年生草本，全國各地多有栽培。羅勒具有開竅、蘇醒、發(fā)汗、祛風(fēng)散腫和祛痰功能，用于心悸失眠、咳嗽哮喘、脾胃濕寒、口腔炎、尿路結(jié)石等[1]。羅勒全草主要含黃酮和香豆素等成分[2]。超微粉碎是指利用機械或流體力學(xué)的途徑將物料粉碎至粒徑<10 μm顆粒的過程。超微粉是超微粉碎的最終產(chǎn)品，具有一般顆粒所不具有的一些特殊理化性質(zhì)，如良好的溶解性、分散性、吸附性、化學(xué)反應(yīng)活性等，目前在中藥加工方面開始研究和應(yīng)用，并顯露出其特有的優(yōu)勢。本課題對羅勒超微粉與常規(guī)粉中總黃酮的體外溶出特性進(jìn)行研究，為超微粉在中藥生產(chǎn)中的應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)和參考。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 SYFM-8超微粉碎振動磨(濟(jì)南松岳機器有限責(zé)任公司)；DYQ-188流水式粉碎機(中國浙江省瑞安市環(huán)球藥械廠)；Rcz-6B3型藥物溶出度儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；Cintra-20型紫外-可見分光光度計(澳大利亞GBC科學(xué)儀器公司)；SK3300LH超聲清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；Leica DFC425IQ 光學(xué)顯微鏡(德國徠卡儀器有限公司)；AG-135萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 藥品和試劑 蘆丁對照品(純度98%，批號100080-200707，中國食品藥品檢定研究院)；羅勒(批號 20121025，購自新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院李永和主任中藥師鑒定為OcimumbacilicumL.。乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉等均為分析純。人工胃液(按《中華人民共和國藥典》2010年版二部附錄ⅩA方法自配)。

2 方法和結(jié)果

2.1 樣品制備 (1)羅勒常規(guī)粉：羅勒藥材剪成3 cm短段，經(jīng)DYQ-188流水式粉碎機粉碎15 min，過100目篩，即得。(2)羅勒超微粉：羅勒藥材剪成3 cm短段，經(jīng)SYFM-8超微粉碎振動磨粉碎15 min制備而成。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 最大吸收波長的選擇 精密量取供試品溶液、蘆丁對照品儲備液各2 ml，分別置25 ml量瓶中，加60%乙醇溶液4 ml，總量為6 ml。各加4%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液各1 ml，搖勻，放置6 min，再各加10%氫氧化鈉溶液10 ml，用60%乙醇溶液定容，搖勻，放置15 min。以相應(yīng)的試劑為空白，在紫外-可見分光光度計下400～700 nm處掃描，確定最大吸收波長為(500±2) nm。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取蘆丁對照品儲備液1、2、3、4、5、6 ml，置25 ml量瓶中，依次加60%乙醇溶液5、4、3、2、1、0 ml，使總量至6 ml。往下按2.3.1項下方法操作，得濃度為8.0、16.0、24.0、32.0、40.0、48.0 μg/ml的系列對照品溶液，以相應(yīng)的試劑為空白，按照《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅤA紫外-可見分光光度法，在500 nm處測定吸光度(Y)，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸?；貧w方程為Y=12.814X+0.004 5(r=0.999 8)，結(jié)果表明蘆丁在8.0～48.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實驗 精密量取供試品溶液2 ml，置25 ml容量瓶中，其余操作同2.3.1項下方法。每隔15 min測定一次吸光度，測定至2 h。計算得到RSD為1.05%(n=9)，表明供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 精密度實驗 精密吸取蘆丁對照品溶液(32.0 μg/ml)2 ml，置25 ml量瓶中，按2.3.1項下方法操作。重復(fù)測定6次，計算RSD為0.61%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.5 重現(xiàn)性實驗 稱取同一批號(批號20120815)樣品5份，按溶出量測定方法平行操作，測定吸光度，計算得到RSD為1.58%(n=5)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 組間比較采用t檢驗。

2.5 羅勒超微粉和常規(guī)粉體外溶出的研究[3，4]

2) 常規(guī)參數(shù)檢查、運行組態(tài)、零點調(diào)整等操作，只能通過手抄器或?qū)Ｓ密浖浆F(xiàn)場掛接操作，耗時耗力，效率低。

2.5.1 總黃酮溶出量的測定 分別取約7 g羅勒超微粉及常規(guī)粉各5份，精密稱定，置半透膜中，加900 ml人工胃液(不加胃蛋白酶)作為溶出介質(zhì)，余同2.2項之(2)。溶出3 h后，取樣5 ml，立即補入(37±0.5) ℃人工胃液5 ml。樣品液加60%乙醇溶液5 ml，超聲30 min，用濾紙過濾。精密量取濾液2 ml，按2.3.1項下方法操作。測定總黃酮含量，計算最大溶出量。結(jié)果羅勒超微粉及常規(guī)粉的溶出量分別為(9.401±0.323)和(8.618±0.291) mg/g(n=5)。經(jīng)t檢驗后，可知兩種粉體中總黃酮體外溶出量無顯著性差異(P>0.05)。

2.5.2 總黃酮溶出速率的測定 分別取約7 g羅勒超微粉及常規(guī)粉各3份，精密稱定，余同2.2項之(2)，在1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60 min取樣5 ml，立即補入(37±0.5) ℃人工胃液5 ml。樣品加60%乙醇溶液5 ml，超聲30 min，過濾。精密量取濾液2 ml，置25 ml量瓶中，按2.3.1項下操作。測定吸光度，計算各時間點總黃酮的累積溶出百分率，并繪制溶出曲線，結(jié)果見表1。

表1 羅勒超微粉體及常規(guī)粉體中總黃酮累積溶出百分率

Table 1 Cumulative dissolution percentage of ultramicro- and traditional powder forms of Ocimum bacilicum

表1 羅勒超微粉體及常規(guī)粉體中總黃酮累積溶出百分率

(t/min)1 2 3 4 5 10 15 20 30 40 50 6041．2±1．250．9±1．855．8±1．962．2±2．164．9±2．371．2±2．175．0±1．980．2±2．483．8±2．688．2±2．190．3±2．992．5±3．152．3±1．563．4±1．977．0±2．184．5±2．287．1±2．391．3±2．494．3±2．195．4±3．196．5±3．297．5±3．098．7±2．999．1±3．4

2.5.3 總黃酮溶出曲線的擬合 數(shù)據(jù)按零級動力學(xué)函數(shù)、對數(shù)正態(tài)函數(shù)、Higuchi分布、Weibull分布曲線進(jìn)行擬合，結(jié)果見表2。由表2可知，零級動力學(xué)模型、Higuchi模型的γ值比較低，對數(shù)正態(tài)分布和Weibull分布的γ值比較高，表明其相關(guān)性比較好，因此羅勒超微粉及常規(guī)粉總黃酮溶出曲線符合對數(shù)正態(tài)分布和Weibull分布。

2.5.4 溶出速率的比較 根據(jù)對數(shù)正態(tài)分布和Weibull分布計算T0.5、Td、T0.7、T0.8、T0.9、m等溶出參數(shù)，T0.5、Td、T0.7、T0.8、T0.9分別表示溶出50%、63.2%、70%、80%、90%所需的時間，m表示所擬合的直線的斜率，見表3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超微粉和常規(guī)粉中總黃酮的溶出參數(shù)T0.5、Td、T0.7、T0.8、T0.9上限和下限之間均無重復(fù)，說明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，經(jīng)t檢驗，可見超微粉與常規(guī)粉中總黃酮溶出50%、63.2%、70%、80%、90%所需的時間均具有顯著性差異(P<0.01)。

表3 羅勒超微粉和常規(guī)粉中總黃酮溶出參數(shù)

Table 3 Dissolution parameters of total flavone in ultramicro and traditional powder of Ocimum bacilicum

表3 羅勒超微粉和常規(guī)粉中總黃酮溶出參數(shù)

WeibullT0．50．289 1．778＊＊0．569 1．893＊＊Td1．051 5．241＊＊1．370 5．134＊＊T0．72．046 9．149＊＊2．142 8．522＊＊T0．85．447 20．755＊＊4．302 18．795＊＊T0．914．502 47．086＊＊10．170 49．877＊＊m 0．235 0．281 0．416 0．367

**P<0.01,與超微粉比較；T0.5、Td、T0.7、T0.8、T0.9：溶出50%、63.2%、70%、80%、90%所需時間；m：所擬合直線的斜率

2.6 粉體的顯微特征觀察 分別挑取羅勒常規(guī)粉和超微粉少許，置載玻片上，水合氯醛加熱透化，稀甘油固定后置顯微鏡下，進(jìn)行光學(xué)顯微觀察、測量和攝影。顯微鑒別結(jié)果表明，兩種粉體的顯微特征在同樣放大倍數(shù)下有很大差異。常規(guī)粉在顯微鏡下能明顯觀察到非腺毛眾多；導(dǎo)管螺紋；油細(xì)胞三角形或圓形，內(nèi)含淺黃色油滴；而超微粉在鏡下已不能見到完整的組織細(xì)胞，表現(xiàn)為不規(guī)則的小顆粒狀物充滿視野，呈淡黃色，有散在油滴，偶見螺紋導(dǎo)管碎片和非腺毛碎片。見圖1。

圖1 羅勒常規(guī)粉與超微粉顯微特征圖(×70)

2.7 粉體學(xué)特征研究[5](1)堆密度的測定：將羅勒粉末放入干燥的量筒中，輕輕振動，其近刻度處的體積V(ml)，與其質(zhì)量m(g)的比值m/V即為堆密度。測定結(jié)果常規(guī)粉和超微粉的堆密度分別為(0.557±0.003)和(0.401±0.002) g/ml (n=3)。(2)休止角的測定：采用固定漏斗法，將3只漏斗串聯(lián)并固定于水平放置的坐標(biāo)紙上方3 cm處，小心地將粉末沿最上的漏斗壁倒入，粉末順次經(jīng)過3個漏斗，自然流下，直到坐標(biāo)紙上形成的粉末圓錐體尖端接觸到漏斗口為止，由坐標(biāo)紙測出圓錐底部的直徑(2R)，計算出休止角tgθ=H/R(H=3 cm)。結(jié)果常規(guī)粉和超微粉的休止角分別為(42.6±0.7)°和(46.1±0.9)°，可見羅勒粉體流動性隨著粒度減小而變差，微粉化對羅勒粉的流動性和填充性有不利的影響。

3 討 論

黃酮類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛地存在于植物中，表現(xiàn)出多種多樣的藥理活性，能防治心腦血管和呼吸系統(tǒng)的疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗輻射、抗腫瘤以及增強免疫力等藥理作用。文獻(xiàn)[6]表明，羅勒總黃酮具有清除超氧陰離子，抑制脂質(zhì)過氧化，減輕或消除氧自由基對DNA損傷的作用，是有效的天然抗氧劑和自由基清除劑；還有抑菌活性。因此本研究選擇總黃酮為評價指標(biāo)。

體外溶出實驗顯示，在3 h內(nèi)，羅勒超微粉的溶出量大于常規(guī)粉，但兩者沒有顯著性差異，即在該條件下超微粉和常規(guī)粉中羅勒總黃酮均能充分溶出。但超微粉中總黃酮的體外溶出參數(shù)T0.5、Td、T0.7、T0.8、T0.9均明顯小于其常規(guī)粉，表明超微粉技術(shù)能顯著加快羅勒總黃酮在水中的溶出速率。

一般情況下藥用有效成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)，植物藥細(xì)胞中的有效成分需經(jīng)過浸潤、溶脹、滲透和分散方能溶出。為消除這種阻力，本研究采用超微粉碎工藝。顯微鑒別結(jié)果表明，羅勒常規(guī)粉碎后，粉末中的組織塊清晰可見，且形狀不規(guī)則；而經(jīng)超微粉碎后細(xì)胞破壁率明顯提高，顯微鏡下看不到完整的細(xì)胞組織，多為不規(guī)則的小顆粒狀物，且大小均勻，顆粒的球性度提高。提示在制劑過程中，超微粉更加有利于制劑的混合均勻性。

文獻(xiàn)報道粉體休止角θ<30°時流動性很好，θ≤40°時可以滿足生產(chǎn)過程中流動性的需求，θ>45°時流動性差。本研究中測得羅勒經(jīng)過超微粉碎后粉體休止角為46.1°，說明其流動性不好。堆密度是反映粉體充填性的指標(biāo)之一，在片劑、膠囊劑的裝填過程中具有重要意義。堆密度大，有利于粉末的充填。本研究結(jié)果表明羅勒超微粉碎后堆密度較常規(guī)粉減小，表明其流動性和充填性變差。提示在制劑的過程中，可采用加助流劑或制顆粒的方法加以改善。

綜上所述，超微粉具有速釋的特點，有效成分溶出速率和溶出量增大。 但藥物的粒徑和溶出速率之間的相關(guān)性， 尚需深入研究。 超微粉碎過程會使某些活性成分溶出速率提高， 是否也會讓某些具有毒性作用的化學(xué)成分溶出速率提高也需進(jìn)行深入研究。

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