亞葉酸鈉注射液的健康人體生物等效性研究

程春燕，李 珍*，張逸凡，孫沁瑩，陸建萍

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433；2.中國科學(xué)院上海藥物研究所藥物代謝研究中心,上海 201203；3.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院呼吸科，上海 200433；4.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433)

亞葉酸(folinic acid)是葉酸還原型的甲?；苌?，系葉酸在體內(nèi)的活化形式。亞葉酸在腫瘤化療中可作為化學(xué)保護(hù)劑，降低化療對患者的毒副作用，減輕患者的痛苦；還可以作為生物調(diào)節(jié)劑，增加抗腫瘤藥物對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，提高療效，延長患者的生存期。臨床主要用于高劑量甲氨蝶呤等葉酸拮抗劑的解救，與氟尿嘧啶同時(shí)應(yīng)用于治療晚期胃癌、大腸癌[1-3]等。由于亞葉酸鈣對溫度和空氣敏感，在高溫和接觸空氣的條件下易降解，穩(wěn)定性差，在水中的溶解度不高。因其含有鈣離子，與氟尿嘧啶混合易產(chǎn)生沉淀；而亞葉酸鈉比亞葉酸鈣具有更好的溶解性和穩(wěn)定性，它能與氟尿嘧啶通過同一個(gè)給藥泵24 h給藥，可更好地應(yīng)用在臨床，且不良反應(yīng)較少，偶見發(fā)熱、皮疹、蕁麻疹或哮喘等過敏反應(yīng)。本研究參照文獻(xiàn)[4]，采用LC-MS/MS法測定無活性、非對映異構(gòu)體6R-亞葉酸、生物活性物質(zhì)左旋體6S-亞葉酸及其活性代謝產(chǎn)物5-甲基四氫葉酸的血漿濃度，以此判定亞葉酸鈉注射液與亞葉酸鈣注射液的生物等效性，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 受試對象 20例男性健康受試者，年齡(21.20±1.11)歲，體重(65.00±5.33) kg，身高(174.65±4.58) cm，體重指數(shù)(21.31±1.51) kg/m2，試驗(yàn)前體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查均未見異常，無藥物與食物過敏史，無煙、酒嗜好或?yàn)E用毒品史，篩選前2周內(nèi)未服用過可能影響本試驗(yàn)研究結(jié)果的藥物，入選前3個(gè)月內(nèi)未參加過其他藥物臨床試驗(yàn)且無獻(xiàn)血史。試驗(yàn)方案經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 藥品和試劑 受試制劑：亞葉酸鈉注射液[批號20110603，2 ml∶100 mg(以亞葉酸計(jì)),江蘇方強(qiáng)制藥廠有限責(zé)任公司]；參比制劑：亞葉酸鈣注射液[批號11031632，10 ml∶0.1 g(以亞葉酸計(jì))，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司]。亞葉酸鈣非對應(yīng)異構(gòu)體(批號100252-200703，純度85.9%)和甲氨蝶呤(批號100138-200603，純度99.6%)由中國食品藥品檢定研究院提供；L-5-甲基四氫葉酸鈣(批號20110320，純度97.0%，含水量17%，上海匯倫生命科技有限公司)；甲醇和三氟乙酸為色譜純(美國Sigma公司)；乙酸銨為色譜純(美國ROE公司)；二巰基乙醇和氨水為色譜純(德國Fluka公司)； 乙酸為色譜純(美國Tedia公司)； 維生素C(純度≥99%， 美國Sigma公司)； 水由Millipore純水儀制備。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和血樣采集 20例男性健康受試者隨機(jī)分成2組，每組10人。受試者在試驗(yàn)前至少48 h及試驗(yàn)全過程不得吸煙或飲用可樂、茶、酒等含咖啡因或乙醇的飲料，避免食用富含葉酸的食物。分兩周期分別單次120 min靜脈滴注受試制劑亞葉酸鈉注射液200 mg/m2(以亞葉酸計(jì))或參比制劑亞葉酸鈣注射液200 mg/m2(以亞葉酸計(jì))。經(jīng)7 d的清洗期后，兩組受試者交叉用藥。分別在給藥前(0)和給藥后的0.5、1.0、1.5、2.0(給藥結(jié)束)、2.25、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0、12和24 h于肘靜脈采血3 ml，肝素抗凝，離心(4 ℃、3500 r/min、離心半徑7 cm)10 min。定量分離血漿1.0 ml，加入抗氧劑(含維生素C、檸檬酸三鈉、二巰基乙醇、蒸餾水)25 μl，置-70 ℃冰箱冷凍避光保存，待測。血樣采集及處理過程避光操作。

1.4 血藥濃度測定方法

1.4.1 儀器 LC-20AD輸液泵和SIL-HTA型自動(dòng)進(jìn)樣器(日本島津公司)；API 4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧電離源(ESI源)以及數(shù)據(jù)采集使用的Analyst 1.4.2軟件(美國Applied Biosystem公司)。

1.4.2 色譜條件與質(zhì)譜條件 參照文獻(xiàn)[4]。

1.4.3 血漿樣品的預(yù)處理 血漿樣品在避光條件下自然解凍后，取200 μl，向其中分別加入40 μl含穩(wěn)定劑的甲醇∶水(1∶1，v/v)和40 μl內(nèi)標(biāo)溶液(1.00 μg/ml甲氨蝶呤溶液)和400 μl含穩(wěn)定劑的甲醇，渦旋混合1 min，室溫放置5 min，離心5 min(1.1×104r/min, 離心半徑6 cm)。移取600 μl上清液于30 ℃氮?dú)饬飨麓导s20 min，向殘留液中加入400 μl pH 3.5的醋酸銨緩沖液，渦旋混合，上樣至活化好的固相萃取小柱，加水1 ml淋洗，加甲醇(含穩(wěn)定劑)1 ml進(jìn)行洗脫。收集洗脫液于干凈試管中，取洗脫液20.0 μl進(jìn)行LC-MS/MS分析。

本試驗(yàn)所測得的血藥濃度數(shù)據(jù)用非房室模型進(jìn)行計(jì)算，cmax和tmax用實(shí)測值表示；AUClast(從零到最后可測濃度的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積)用梯形法計(jì)算，AUCinf(從零到無窮大時(shí)間內(nèi)血藥濃度-時(shí)間曲線下面積)=AUClast+ctn/λz,tn是最后一次可實(shí)測濃度的取樣時(shí)間；ctn是末次可測定樣本藥物濃度；λz是對數(shù)血藥濃度-時(shí)間曲線末端直線部分求得的末端消除速率常數(shù)，可用對數(shù)血藥濃度-時(shí)間曲線末端直線部分的斜率求得；t1/2用公式t1/2=0.693/λz計(jì)算。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 取含穩(wěn)定劑的人空白血漿配制成相當(dāng)于6R-亞葉酸、6S-亞葉酸和5-甲基四氫葉酸血漿濃度分別為0.050/0.050/0.025，0.150/0.150/0.075，0.400/0.400/0.200，1.50/1.50/0.750，4.00/4.00/2.00，10.0/10.0/5.00和20.0/20.0/10.0 μg/ml的樣品，按1.4.3項(xiàng)下操作，每一濃度進(jìn)行雙樣本分析，進(jìn)樣20.0 μl，記錄色譜圖。以待測物濃度為橫坐標(biāo)(X)，待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，6R-亞葉酸的線性范圍為0.050～20.0 μg/ml，6S-亞葉酸的線性范圍為0.050～20.0 μg/ml，5-甲基四氫葉酸的線性范圍為0.025～10.0 μg/ml。

取含穩(wěn)定劑的人空白血漿配制成相當(dāng)于6R-亞葉酸、6S-亞葉酸和5-甲基四氫葉酸血漿濃度分別為0.050/0.050/0.025 μg/ml的樣品，在方法確證時(shí)對該樣品進(jìn)行6樣本分析，并根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每一樣本測得濃度。求得該濃度的6R-亞葉酸、6S-亞葉酸和5-甲基四氫葉酸日內(nèi)精密度(RSD)分別為2.9%、5.4%和6.9%，準(zhǔn)確度(RE)分別為9.3%、6.9%和13.3%(n=6)。

1.4.5 精密度和準(zhǔn)確度 取低、中、高3個(gè)濃度(6R-亞葉酸、6S-亞葉酸和5-甲基四氫葉酸血漿濃度分別為0.150/0.150/0.075，1.50/1.50/0.750和16.0/16.0/8.00 μg/ml)的質(zhì)控樣品，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)測定3 d，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)控樣品的測得濃度。LC-MS/MS法測得6R-亞葉酸在每一質(zhì)控濃度水平的日內(nèi)精密度(RSD)均<4.8%，日間精密度(RSD)均<10.7%，準(zhǔn)確度為-1.1%～4.0%。6S-亞葉酸在每一質(zhì)控濃度水平的日內(nèi)精密度(RSD)均<6.3%，日間精密度(RSD)均<6.6%，準(zhǔn)確度在-2.2%～0.1%。5-甲基四氫葉酸在每一質(zhì)控濃度水平的日內(nèi)精密度(RSD)均<5.3%，日間精密度(RSD)均<6.7%，準(zhǔn)確度為-3.1%～7.0%。

1.4.6 稀釋試驗(yàn) 本試驗(yàn)考察超出定量上限的血漿樣品，經(jīng)空白血漿稀釋后的準(zhǔn)確度。取稀釋質(zhì)控樣品，用人空白血漿稀釋至1/4后，按1.4.3項(xiàng)下操作，進(jìn)行6樣本分析，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每一樣本測得濃度。6R-亞葉酸測得的精密度和準(zhǔn)確度分別為6.4%和-2.0%；6S-亞葉酸測得的精密度和準(zhǔn)確度分別為5.8%和-2.8%；5-甲基四氫葉酸測得的精密度和準(zhǔn)確度分別為4.0%和-8.5%。該結(jié)果表明，血漿樣品經(jīng)空白血漿稀釋到1/4后測定不影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.4.7 穩(wěn)定性考察 血漿樣品處理后4 ℃避光放置12 h后，血漿樣品4 ℃避光放置6 h后，血漿樣品經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)后，血漿樣品-70 ℃放置34 d后穩(wěn)定，6R-亞葉酸、6S-亞葉酸和5-甲基四氫葉酸儲(chǔ)備液4 ℃放置12 d后均穩(wěn)定，RE分別為3.7%、3.0%和5.1%。

1.4.8 基質(zhì)效應(yīng) 6R-亞葉酸、6S-亞葉酸和5-甲基四氫葉酸低濃度基質(zhì)效應(yīng)分別為89.4%、93.2%和97.2%；高濃度基質(zhì)效應(yīng)分別為102%、96.1%和105%，且RSD均分別<11.8%、13.7%和9.1%；內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)為94.9%，RSD為4.7%。結(jié)果表明，在本試驗(yàn)選擇的色譜和質(zhì)譜條件下，可忽略基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2 結(jié) 果

2.1 主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 受試制劑和參比制劑各成分的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖1，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1。

表1 健康受試者單劑量靜脈滴注亞葉酸鈉注射液與亞葉酸鈣注射液200 mg/m2后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

Table 1 Main pharmacokinetic parameters of healthy volunteers after a single injection of sodium folinate and calcium folinate 200 mg/m2

表1 健康受試者單劑量靜脈滴注亞葉酸鈉注射液與亞葉酸鈣注射液200 mg/m2后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

tmax(t/h)cmax(ρB/μg·ml-1)AUClast(A/μg·h·ml-1)AUCinf(A/μg·h·ml-1)t1/2(t/h)6R- 2．15±0．24919．7±2．21179±16．1215±25．99．34±1．99 2．15±0．34820．2±2．77176±20．8208±27．28．76±1．046S- 1．80±0．2886．08±1．1215．0±1．7615．6±1．881．50±0．583 1．85±0．2356．60±1．0715．6±1．6616．1±1．651．36±0．3585- 3．18±0．5632．43±0．43719．7±3．8820．9±4．105．81±0．682 3．30±0．4412．50±0．40920．3±3．9321．5±4．165．69±0．773

圖1 健康受試者單次靜脈滴注亞葉酸鈉注射液(受試制劑)和亞葉酸鈣注射液(參比制劑)200 mg/m2后6R-亞葉酸、6S-亞葉酸和5-甲基四氫葉酸的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

2.2 生物等效性評價(jià) 分別將6R-亞葉酸、6S-亞葉酸和5-甲基四氫葉酸的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(AUClast和cmax)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，采用90%置信區(qū)間法進(jìn)行等效性評價(jià)。AUClast和cmax均拒絕生物不等效假設(shè)，受試制劑6R-亞葉酸、6S-亞葉酸和5-甲基四氫葉酸AUClast的90%置信區(qū)間分別為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的98.14%～106.08%、 92.37%～100.41%和94.00%～100.36%，均在80%～125%范圍內(nèi)；cmax的90%置信區(qū)間分別為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的92.49%～102.97%、85.99%～97.94%和94.05%～100.42%，均在75%～133%范圍內(nèi)。tmax經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)均無顯著性差異(P>0.05)[5]，表明受試制劑與參比制劑生物等效。

2.3 臨床觀察 所有完成試驗(yàn)的健康受試者在給藥前后進(jìn)行的生命體征、血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化、心電圖等檢查數(shù)據(jù)均在正常范圍內(nèi)或異常無臨床意義。20例健康受試者中有1例出現(xiàn)發(fā)熱(37.9 ℃)，癥狀持續(xù)1 d，程度為輕度，未經(jīng)處置自行痊愈，經(jīng)研究者判定與研究藥物(受試制劑)可能無關(guān),未發(fā)生嚴(yán)重不良事件。采用精確概率法比較了兩組不良事件發(fā)生情況，無顯著性差異(P>0.05)。

3 討 論

本試驗(yàn)采用LC-MS/MS法測定健康人血漿中的6R-亞葉酸、6S-亞葉酸和5-甲基四氫葉酸濃度。血漿樣品經(jīng)過固相萃取處理后， 采用ESI源， 利用MRM掃描方式進(jìn)行定量分析，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物和內(nèi)標(biāo)的測定，具有靈敏、快速、準(zhǔn)確和可重現(xiàn)等特點(diǎn)[4]。

所有受試者在給藥前后進(jìn)行的各項(xiàng)檢查數(shù)據(jù)均正?；虍惓o臨床意義，說明單次給予試驗(yàn)藥物亞葉酸鈉注射液200 mg/m2安全，耐受性良好。

本研究所得6R-亞葉酸、6S-亞葉酸和5-甲基四氫葉酸的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)方差分析和90%置信區(qū)間分析結(jié)果表明，健康男性受試者單次靜脈滴注受試制劑亞葉酸鈉注射液與參比制劑亞葉酸鈣注射液具有生物等效性。

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