用GC-MS法分析姜黃和片姜黃中揮發(fā)油成分并研究其體外抗腫瘤作用

高麗紅，張玉梅，劉艷霞，宋洪杰*

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433；2.第三軍醫(yī)大學(xué)生物波研究所藥學(xué)室，重慶 400038)

姜黃和片姜黃是臨床常用中藥材，兩者同屬姜科姜黃屬，源于不同種植物。前者為姜科植物姜黃CurcumalongaL.的干燥根莖，后者為姜科植物溫郁金CurcumawenyujinY. H. Chen et C. Ling的干燥根莖。目前兩者在臨床上常?；ハ嗵娲褂?，有的醫(yī)師甚至誤認(rèn)為它們是同一植物。盡管兩者藥性相似，均有破血行氣、通經(jīng)止痛的功能，但其基源、產(chǎn)地、性味歸經(jīng)、加工方法、鑒別方法和化學(xué)成分均不同[1]。隨著中藥臨床應(yīng)用的有效性和安全性日益受到重視，將姜黃和片姜黃替代使用的科學(xué)性和合理性有待評(píng)估。姜科植物富含揮發(fā)油，有限的研究資料顯示，這兩種藥材揮發(fā)油的主要成分有差異。藥理學(xué)研究表明，姜黃揮發(fā)油有抗真菌和抗腫瘤作用[2,3]，片姜黃揮發(fā)油的藥理作用則幾乎未見報(bào)道。本研究對(duì)姜黃和片姜黃揮發(fā)油的成分進(jìn)行了分析，并對(duì)其體外抗腫瘤作用進(jìn)行比較，旨在為其進(jìn)一步開發(fā)和臨床合理應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑 6890N-MS5973N GC-MS聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)；ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀(美國Bio-Tek公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國 Forma公司)；細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Falcon公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，Amersco公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibcol BRL公司)；無水乙醇(分析純，江蘇省常州市楊園化工有限公司)；二甲亞砜(DMSO，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 細(xì)胞和藥材 A-549人肺癌細(xì)胞株和SGC-7901人胃癌細(xì)胞株(分別由第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院呼吸內(nèi)科和第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部藥物分檢室保存)；姜黃和片姜黃(購于上海藥材有限公司，姜黃產(chǎn)地：四川，批號(hào)061018；片姜黃產(chǎn)地：福建，批號(hào)DH2006102704)，由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室郭美麗教授鑒定。

1.3 揮發(fā)油的提取 分別取姜黃和片姜黃粗粉約200 g，稱定重量，置燒瓶中，加2000 ml水，按《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅩD揮發(fā)油測(cè)定甲法進(jìn)行總揮發(fā)油提取，提取所得揮發(fā)油經(jīng)無水硫酸鈉脫水干燥后置4 ℃冰箱保存。結(jié)果測(cè)得姜黃和片姜黃兩種飲片揮發(fā)油的得率分別為1.5%和1.2%。

1.4 GC-MS分析 采用6890N-MS5973N GC-MS聯(lián)用儀，色譜柱：HP-5型毛細(xì)管色譜柱(30 m×250 μm，0.25 μm)；載氣為氦氣，流速1.0 ml/min；程序升溫：起始溫度40 ℃，保持1 min，然后以4 ℃/min升至250 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比50∶1，檢測(cè)器溫度280 ℃。電離方式為電子電離(electron ionization,EI)，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍50～550amu。姜黃和片姜黃揮發(fā)油各取2 μl，分別用10 ml無水乙醇稀釋后進(jìn)樣分析。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng) A-549人肺癌細(xì)胞株和SGC-7901人胃癌細(xì)胞株分別培養(yǎng)在含10%小牛血清、青霉素和鏈霉素各100 U/ml的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.6 MTT法檢測(cè)揮發(fā)油對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 取對(duì)數(shù)生長期A-549細(xì)胞株和SGC-7901細(xì)胞株，分別稀釋至細(xì)胞濃度為2×104/ml和5×104/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁良好，棄去培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組分別加入新配制的含50、100、200、400和800 μg/ml揮發(fā)油的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，以0.1% DMSO溶液作為對(duì)照。細(xì)胞在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，棄去含揮發(fā)油的培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(終濃度為5 g/L)，37 ℃繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。棄去孔內(nèi)液體，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩混勻10 min后，用酶標(biāo)儀在參考波長490 nm和檢測(cè)波長570 nm檢測(cè)各孔吸光度值。揮發(fā)油對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用以IC50表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件中的Probit模塊，根據(jù)吸光度值計(jì)算IC50[4]。

2 結(jié) 果

2.1 揮發(fā)油的化學(xué)組成 姜黃和片姜黃揮發(fā)油GC-MS分析所得總離子流色譜圖見圖1。采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分相對(duì)含量，經(jīng)Wiley275質(zhì)譜庫檢索，結(jié)合文獻(xiàn)和人工解析進(jìn)行化合物鑒定。姜黃和片姜黃揮發(fā)油中已鑒別的化學(xué)成分見表1和表2。姜黃揮發(fā)油共檢測(cè)出24個(gè)化合物，其中20個(gè)化合物已被鑒別。按質(zhì)量百分比計(jì)，單萜類成分占1.53%，倍半萜類成分占60.64%，其中β-姜黃酮(34.79%)、芳姜黃烯(7.24%)、β-倍半水芹烯(4.85%)、吉瑪酮(4.51%)和姜烯(2.68%)為主要成分。片姜黃揮發(fā)油共檢測(cè)出41個(gè)化合物，其中27個(gè)化合物已被鑒別，按質(zhì)量百分比計(jì)，單萜類成分占17.22%，倍半萜類成分占34.65%，其中莪術(shù)二酮(15.13%)、1,8-桉樹腦(7.62%)、吉瑪酮(5.60%)、異莪術(shù)醇(4.23%)、莪術(shù)醇(4.10%)和樟腦(3.55%)為主要成分。

圖1 姜黃和片姜黃揮發(fā)油的GC-MS分析總離子流圖譜

表1 姜黃揮發(fā)油的化學(xué)成分分析結(jié)果

表2 片姜黃揮發(fā)油的化學(xué)成分分析結(jié)果

2.2 揮發(fā)油的體外抗腫瘤作用 不同濃度的揮發(fā)油作用于A-549和SGC-7901細(xì)胞株48 h后，兩種細(xì)胞株的生長均受到一定程度的抑制，細(xì)胞存活率隨揮發(fā)油濃度的升高而降低，結(jié)果見圖2。姜黃和片姜黃揮發(fā)油抑制A-549人肺癌細(xì)胞株的IC50分別為227.8和202.1 μg/ml，抑制SGC-7901人胃癌細(xì)胞株的IC50則分別為129.7 和230.0 μg/ml。

3 討 論

本研究采用GC-MS法對(duì)姜黃和片姜黃揮發(fā)油成分進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示兩種揮發(fā)油成分在含量和組成上存在顯著差異。姜黃和片姜黃揮發(fā)油中單萜類成分分別占1.53%和17.22%，表明前者低沸點(diǎn)成分比后者少。片姜黃揮發(fā)油中保留時(shí)間短的成分比姜黃多，從而也驗(yàn)證了兩者的炮制工藝的差異，姜黃是取根莖蒸、煮加工后入藥，而片姜黃是根莖鮮品直接切片后入藥。由此可見，藥材飲片成分是藥材炮制工藝的決定因素之一。再者，本研究測(cè)得的兩種藥材飲片揮發(fā)油成分和相對(duì)含量與已有的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果也存在顯著差異[5-7]，分析原因可能主要與藥材的產(chǎn)地、加工和飲片存放時(shí)間等有關(guān)。姜黃和片姜黃的揮發(fā)油得率分別為1.5%和1.2%,前者的揮發(fā)油得率遠(yuǎn)低于《中華人民共和國藥典》2010年版一部規(guī)定的姜黃飲片中揮發(fā)油含量不得<5.0%的要求，在文獻(xiàn)[7]中也有類似報(bào)道。文獻(xiàn)[7]采用水蒸汽蒸餾法提取31批姜黃揮發(fā)油，提取率為1.63%～4.52%。而對(duì)于片姜黃，《中華人民共和國藥典》2010年版一部只規(guī)定了藥材的揮發(fā)油含量不得<1.0%。從已鑒別的揮發(fā)油成分中可見，姜黃和片姜黃揮發(fā)油成分的差異決定了其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不同，因此臨床上將兩種藥材替代使用缺乏科學(xué)性。但從中醫(yī)辨證論治本質(zhì)來講，它們的替代使用是否合適尚有待研究和探討。

本研究比較了姜黃和片姜黃揮發(fā)油對(duì)A-549人肺癌細(xì)胞株和SGC-7901人胃癌細(xì)胞株的體外抗腫瘤作用，結(jié)果顯示，兩種揮發(fā)油對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖均有一定的抑制作用，并且呈劑量依賴性,但抑制作用較弱。姜黃和片姜黃是臨床常用的中藥材，其揮發(fā)油的抗腫瘤作用尚需采用其他細(xì)胞株和體內(nèi)研究進(jìn)一步證實(shí)。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 馬 宇，楊培龍，張 亮.姜黃與片姜黃異同考[J].四川中醫(yī)，2007,25(10)：33-35.

Ma Yu,Yang PeiLong,Zhang Liang.The differences and similarities betweenCurcumalongaL. and Wenyujin Rhizoma Concisum[J].J Sichuan Tradit Chin Med，2007,25(10)：33-35.In Chinese.

[2] 杜青云，王國勝，張銘窮.中藥姜黃揮發(fā)油體外抗真菌實(shí)驗(yàn)研究[J].中華皮膚性病學(xué)雜志，1997,11(4)：212，230.

Du QingYun,Wang GuoSheng,Zhang MingQiong.Experimental study on the antifungal effects of essential oil fromCurcumalongaL.[J].Chin J Derm Venereol,1997,11(4)：212,230.In Chinese.

[3] 王海晶，楊和平.姜黃揮發(fā)油對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞作用的形態(tài)學(xué)研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005,27(3)：220-222.

Wang HaiJing,Yang HePing.Effects of turmeric volatile oil on the morphology of human lung adenocarcinoma A549 cells[J].Acta Acad Med Mil Tertiae，2005,27(3)：220-222.In Chinese with English abstract.

[4] 趙 斌，葛金芳，朱娟娟，等.小議在MTT法測(cè)細(xì)胞增殖抑制率中IC50的計(jì)算方法[J].安徽醫(yī)藥，2007，11(9)：834-836.

Zhao Bin,Ge JinFang,Zhu JuanJuan,etal.Discussion on calculation methods of inhibition rate IC50of cell proliferation by MTT method[J].Anhui Med Pharm J,2007,11(9):834-836.In Chinese.

[5] Qin N Y,Yang F Q,Wang Y T,etal. Quantitative determination of eight components in rhizome (Jianghuang) and tuberous root (Yujin) ofCurcumalongausing pressurized liquid extraction and gas chromatography-mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal,2007，43(2):486-492.

[6] 張桂芝，張 立，孟慶華.姜黃飲片揮發(fā)油的GC-MS特征成分及指紋圖譜研究[J].中成藥，2010,32(7)：1092-1095.

Zhang GuiZhi,Zhang Li,Meng QingHua.GC-MS characteristic components and fingerprint of essential oils of processedRhizomacurcumaelongae[J].Chin Tradit Pat Med,2010,32(7)：1092-1095. In Chinese with English abstract.

[7] 蔣建蘭，丁洪濤，蘇 鑫，等.基于組效關(guān)系的姜黃揮發(fā)油抗腫瘤活性成分辯識(shí)研究[J].分析化學(xué)，2012，40(10)：1488-1493.

Jiang JianLan,Ding HongTao,Su Xin,etal.Identification of anti-tumor ingredients in curcuma volatile oil based on composition-activity relationship[J].Anal Chem，2012，40(10)：1488-1493.In Chinese with English abstract.