烏司他丁對大鼠急性壞死性胰腺炎的保護作用及相關(guān)機制的實驗研究

劉潔 袁小凌 楊淑麗 陳衛(wèi)昌

烏司他丁(urinary trypsin inhibitor，UTI)能抑制多種酶(胰蛋白酶、磷脂酶Az、玻璃酸酶、彈性蛋白酶等)的活性，且其分解形成的分子質(zhì)量較低的成分也具有很強的抑制蛋白水解酶的作用[1]。此外，它可穩(wěn)定溶酶體膜，抑制多種炎癥介質(zhì)釋放，減輕對組織器官造成的損傷，改善機體的免疫狀態(tài)，現(xiàn)已用于臨床治療多種疾病。但其作用機制尚未完全清楚。文獻報道，細胞自噬活性的異常與急性胰腺炎(AP)的發(fā)生關(guān)系密切[2-4]，而Beclin-1是哺乳動物參與自噬的特異性基因[5]。本研究應(yīng)用烏司他丁干預(yù)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠，觀察自噬相關(guān)基因表達的變化,探討烏司他丁的作用機制。

一、材料與方法

1．實驗動物及分組：健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠54只，體質(zhì)量220～260 g，購自蘇州大學(xué)動物實驗中心。按數(shù)字表法將大鼠隨機分為假手術(shù)組、ANP組、烏司他丁組，每組各20只。采用胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c(Sigma公司)方法制備ANP大鼠模型[8]。烏司他丁組大鼠在制模后30 min經(jīng)尾靜脈注射烏司他丁l00 000 U/kg體質(zhì)量(12 500 U/ml，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司)，速度為0.2 ml/min；ANP組大鼠經(jīng)尾靜脈注射等容積生理鹽水；假手術(shù)組大鼠在開腹后僅翻動胰腺即關(guān)腹。制模后3、6、12 h分批處死大鼠，取血分離血清，置-80℃保存，留取胰腺組織。

2．血清淀粉酶、IL-1β水平測定：采用西班牙A15全自動生化分析儀檢測血清淀粉酶。采用ELISA法檢測血清IL-1β水平，試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，按說明書操作。

3．胰腺病理學(xué)檢查：取甲醛固定的胰腺組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，采用盲法由?？漆t(yī)師在光學(xué)顯微鏡下讀片。每張切片隨機選擇5個高倍視野，觀察胰腺組織病理學(xué)改變，并按改良Schmidt評價標(biāo)準(zhǔn)[6]進行病理評分。

4．胰腺組織Beclin-1、NF-κB p65蛋白表達檢測：采用免疫組化方法檢測胰腺組織Beclin-1、NF-κB p65蛋白表達。試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，按說明書操作。

抗Beclin-1抗體(Cell Signaling公司)工作濃度1∶200，抗NF-κB p65抗體(SantaCruz公司)工作濃度1∶50，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)工作濃度1∶1 000。最后DAB顯色。以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。隨機觀察5個高倍視野，根據(jù)陽性細胞率和染色強度評分。陽性細胞率：<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強度：無染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩者之和為總分，取均值。

另取新鮮胰腺組織，加入蛋白裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)，離心取上清，蛋白定量后行蛋白質(zhì)印跡法檢測Beclin-1、NF-κB p65蛋白表達?？笲eclin-1、NF-κB p65抗體工作濃度1∶1 000，內(nèi)參β-actin抗體工作濃度1∶5 000，羊抗兔IgG工作濃度1∶5 000，抗鼠IgG工作濃度1∶10 000，最后ECL化學(xué)發(fā)光，暗室壓片，顯影，定影。應(yīng)用圖像掃描儀掃描，以目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。

二、結(jié)果

1．病理改變：假手術(shù)組大鼠胰腺組織無明顯變化，病理評分為(0.33±0.52)分。ANP組造模3 h時見胰腺輕度充血、水腫，伴有點片狀紫褐色壞死區(qū)及少量血性腹水，6 h時病理改變加重，胰腺、腸系膜和大網(wǎng)膜可見少量皂化斑；12 h時胰腺大片壞死,呈暗紅色，出現(xiàn)大量皂化斑和血性腹水；鏡下見胰腺腺泡水腫，腺泡結(jié)構(gòu)破壞、消失，葉間隔、小葉間隔和腺泡間隔顯著增寬，腺泡細胞不同程度變性壞死，周圍出血，且隨著時間的延長呈進行性加重。3、6、12 h的病理評分分別為(6.67±0.82)、(9.67±1.03)、(10.33±0.82)分，較對照組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。烏司他丁組各時間點病理改變均較ANP組減輕,病理評分分別為(4.95±2.33)、( 7.11±1.67)、( 6.36±2.24)分，較ANP組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05，圖1)。

2．血淀粉酶、IL-1β水平的變化：ANP組、烏司他丁組大鼠血清淀粉酶、IL-1β水平均較對照組顯著升高(P值<0.05或<0.01)。除1h時的血淀粉酶水平外，烏司他丁組血淀粉酶、IL-1β水平均較ANP組顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01，表1)。

圖1 假手術(shù)組(a)、ANP組(b)、烏司他丁組(c)大鼠胰腺組織的病理改變(HE ×200)

表1 各組大鼠血淀粉酶、IL-1β水平的變化

3．胰腺組織Beclin-1、NF-κB p65蛋白表達：假手術(shù)組大鼠胰腺內(nèi)胰島細胞及腺泡細胞胞質(zhì)見少量Beclin-1表達，3、6、12 h的免疫組化評分分別為0.20、0.35、0.32分；ANP組3h時細胞Beclin-1的表達開始增多，并持續(xù)增高，12 h時強表達，胞質(zhì)呈棕褐色，且胰島細胞表達多于腺泡細胞，3、6、12 h的免疫組化評分分別為3.0、5.0、6.4分，較假手術(shù)組顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01)；烏司他丁組各時間點Beclin-1蛋白表達分別為1.7、2.9、2.7分，較ANP組顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05，圖2) 。

圖2 假手術(shù)組(a)、ANP組(b)、烏司他丁組(c)大鼠胰腺組織Beclin-1蛋白表達(免疫組化 ×400)

假手術(shù)組胰腺腺泡細胞胞質(zhì)及胞核內(nèi)見少量NF-κB p65蛋白表達，3、6、12 h的免疫組化評分分別為0.35、0.15、0.30分；ANP組胰腺組織NF-κB p65蛋白表達隨著時間延長而增強，12 h時強表達，3、6、12 h的免疫組化評分分別為4.3、5.6、6.4分，較假手術(shù)組顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01)；烏司他丁組各時間點NF-κB p65蛋白表達分別為1.4、2.9、2.6分，較ANP組顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01，圖3)。

蛋白質(zhì)印跡法檢測Beclin-1、NF-κBp65蛋白表達的結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致(圖4)。

圖3 假手術(shù)組(a)、ANP組(b)、烏司他丁組(c)大鼠胰腺組織NF-κB p65蛋白表達(免疫組化法，×400)

討論自噬是近年來提出的新的細胞死亡方式，它與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。Beclin-1是哺乳動物中最早發(fā)現(xiàn)的自噬基因，主要通過與Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)形成復(fù)合體來調(diào)控其他自噬蛋白的定位，調(diào)節(jié)自噬活性[7]。賈文焯等[8]的研究結(jié)果表明，PI3K基因敲除小鼠誘發(fā)AP后胰腺組織中Beclin-1蛋白表達明顯低于野生型小鼠，提示PI3K基因敲除可減弱自體吞噬過程。本課題組前期研究結(jié)果表明[9]，聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑3-MA和NF-κB特異性抑制劑吡咯烷二硫氨基甲酸鹽(PDTC)干預(yù)能夠明顯減輕ANP大鼠的胰腺損傷程度，胰腺組織Beclin1和LC3蛋白表達增加，表明ANP時胰腺細胞的自噬活性增強。

圖4 假手術(shù)組(1)、ANP組(2～4)、烏司他丁組(5～7)大鼠胰腺組織Beclin-1、NF-κB p65蛋白表達

NF-κB是Rel轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白家族成員之一，NF-κB p65為其主要亞單位。目前已證實NF-κB信號通路作為關(guān)鍵啟動因子參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。NF-κB信號途徑激活可增強自噬蛋白Beclin-1的表達[10]，給予NF-κB特異性抑制劑可下調(diào)大鼠腦組織損傷部位和海馬中Beclin-1表達[11]。

烏司他丁是從人尿中提取精制得到的一種Kunitz型糖蛋白水解酶抑制劑，具有兩個不完全重疊的功能區(qū)。由于其來源于人體，故無免疫原性，安全性高，目前已廣泛應(yīng)用于臨床。烏司他丁主要作用是抑制炎癥介質(zhì)釋放，預(yù)防細胞因子級聯(lián)反應(yīng)，抑制白細胞過度激活[12]，下調(diào)炎癥細胞因子、趨化因子及黏附因子的表達，抑制中性粒細胞與內(nèi)皮細胞的黏附、聚集，減輕內(nèi)皮細胞的損傷[13-14]。

本研究結(jié)果顯示，給予烏司他丁干預(yù)ANP大鼠，血清淀粉酶、 IL-1β水平下降，胰腺病理損傷減輕，胰腺組織Beclin-1、NF-κB p65蛋白表達下調(diào)，表明烏司他丁不僅可抑制蛋白酶活性，而且可阻斷NF-κB信號通路，并通過調(diào)控Beclin-1的表達來調(diào)節(jié)ANP大鼠胰腺細胞的自噬。

參 考 文 獻

[1] 曾文紅，自國強．烏司他丁研究進展[J]．中華肝膽外科雜志，2001，7(1)：52.

[2] Vaccaro MI.Autophagy and pancareas disease[J].Pancreatology,2008,8(4-5):425-429.

[3] Ohmuraya M,Yamamura K.Autophagy and acute pancreatitis: a novel autophagy theory for trypsinogen activation[J].Autophagy,2008,4(8):1060-1062.

[4] Fortunato F,Kroemer G.Impaired autophagosomelysosome fusion in the pathogenesis of pancreatitis[J].Autophagy,2009,5(6):850-853.

[5] Mizushima N.Methods for monitoring autophagy[J].Int J Biochem Cell Biol,2004,36(12):2491-2502.

[6] Riegert-Johnson DL,Godfrey JA, Myers JL, et al.Delayed hypersensitivity reaction and acute respiratory distress syndrome following infliximabinfusion[J]. Inflamm Bowel Dis, 2002,8(3):186-191.

[7] Sun Q,Fan W,Chen K,et al. Identification of Barkor as a mammalian autophagy-specific factor for Beclin-1 and class III phosphatidylinositol 3-kinase[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(49):19211-19216.

[8] 賈文焯，孫建華，韋軍民.磷脂酰肌醇3-激酶γ對急性胰腺炎小鼠胰腺腺泡細胞自噬作用的影響[J].中華胰腺病雜志，2011,11(6)：417-419.

[9] 袁小凌,劉潔,楊淑麗,等.3-MA和PDTC聯(lián)合應(yīng)用對大鼠急性胰腺炎協(xié)同保護作用[J].胃腸病學(xué),2013,18(2)：80-81.

[10] Yang S,Bing M,Chen F,et al.Autophagy regulation by the nuclear factor κB signal axis in acute pancreatitis[J].Pancreas,2012,41(3):367-373.

[11] Zhang YB,Li SX,Chen XP,et al.Autophagy is activated and might protect neurons from degeneration after traumatic brain injury[J].Neurosci Bull,2008,24(3):143-149.

[12] Bingyang J, Jinping L, Mingzheng L, et al. Effects of urinary protease inhibitor on inflammatory response during on pump coronary revascularisation. Effect of ulinastatin on inflammatory response[J]. J Cardiovasc Surg(Tofino),2007，48(4)：497-503.

[13] Inoue K, Takano H, Yanagisawa R, et al. Protective role of urinary trypsin inhibitor in acute lung injury induced by lipopolysaccharide[J]．Exp Biol Med，2005，230(4)：281-287.

[14] Molor-Erdene P, Okajima K, Isobe H, et al. Urinary trypsin inhibitor reduces LPS-induced hypotension by suppressing tumor necrosis factor-production through inhibition of Egr-1 expression[J]．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，288(3)：1265-1271.