急性壞死性胰腺炎大鼠Ghrelin表達的變化及GHRP-2對其的影響

梁志海 唐國都 方春蕓 覃蒙斌

重癥急性胰腺炎(server acute pancreatitis, SAP)患者早期病情變化迅速、病死率高，雖然近年SAP的治療手段有很大進步，但尋找早期干預(yù)疾病進程、減少疾病重癥化仍是本領(lǐng)域的研究熱點之一。生長激素釋放肽-2(growthhormone releasing peptides，GHRP-2)是ghrelin受體激動劑，它可以減輕肝臟炎癥、急性肺損傷[1-2]，而且外源性ghrelin對急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)的炎癥反應(yīng)有抑制作用[3]，但內(nèi)源性ghrelin與AP發(fā)病機制的關(guān)系未明確。本研究觀察GHRP-2干預(yù)急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)大鼠后內(nèi)源性ghrelin表達的變化。

一、材料與方法

1．實驗動物及分組：健康雄性SD大鼠，12周齡，體質(zhì)量250～350 g，清潔級，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。按數(shù)字表法隨機分為假手術(shù)組、ANP組、GHRP-2組，每組30只。大鼠造模前禁食12 h，自由飲水。采用膽胰管逆行注射2%?；悄懰徕c(日本TCI公司)1 ml/kg體質(zhì)量的方法制備ANP模型。GHRP-2組在制模前30 min給予腹腔注射GHRP-2(杭州中肽公司)200 g/kg體質(zhì)量；ANP組制模前30 min注射等容積生理鹽水。對照組僅剖腹翻動胰腺。術(shù)后3、6、12、24、48 h分批處死大鼠，每時點每組處死6只。采血分離血清，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。取胰腺組織，部分放入RNA保存液(廣州東盛公司)中置液氮保存?zhèn)溆?，部分?0%甲醛液固定。

2．胰腺組織病理學(xué)檢查及評分：固定的胰腺組織常規(guī)切片、HE染色。由病理科醫(yī)師盲法讀片，并參考Schmit標準[4]從水腫、出血、壞死、炎癥4個項目進行評分，每個項目由輕到重共分5級，分別計0～4分，4個項目評分之和作為總的病理評分，最高16分。

3．血清淀粉酶活性檢測：送廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科使用全自動生化分析儀檢測。

4．血清ghrelin、IL-1β水平檢測：采用ELISA法檢測。ghrelin試劑盒購自武漢華美公司，IL-1β試劑盒購自杭州聯(lián)科公司，按說明書操作。

5．胰腺組織ghrelin mRNA檢測：采用實時熒光定量PCR法檢測胰腺組織ghrelin mRNA表達。ghrelin引物序列：上游5′-CAGAAAGCCCAGCAGAGAAAGG-3′，下游5′-GCCAACATCGAAGGGAGCAT-3′，產(chǎn)物153 bp；內(nèi)參β-actin引物序列：上游5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，產(chǎn)物150 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。取液氮保存的胰腺組織，先用液氮研磨粉碎組織，按總RNA小量制備試劑盒(美國Axygen公司)提供的方法提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(美國Fermentas 公司)的說明書進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。取其中一個樣本的cDNA按1∶4的稀釋比例等比稀釋，上熒光定量PCR儀擴增。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，40個循環(huán)，60℃ 1 min。由儀器自帶軟件分析數(shù)據(jù)，繪制標準曲線。所繪制的標準曲線R2均>0.99，擴增效率為90%～110%。按上述體系以及反應(yīng)條件分別測定待測樣本的Ct值，采用公式2-△△Ct計算ghrelin mRNA的表達量。

二、結(jié)果

1．胰腺組織病理改變：對照組大鼠胰腺組織無明顯變化。ANP組在腹腔內(nèi)可見淡黃色腹水、鼓腸、腹腔臟器粘連、出現(xiàn)皂化斑；胰腺壞死，部分呈膠凍狀，部分有暗紅色出血樣改變。光鏡下見胰腺組織水腫、炎癥、出血、壞死，程度較輕者見胰腺腺泡、間質(zhì)水腫，少量炎癥細胞浸潤；較重者見胰腺凝固性壞死、腺小葉結(jié)構(gòu)消失；胰腺實質(zhì)內(nèi)、小葉間有大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤以及出血。GHRP-2組大鼠的胰腺組織病理改變與ANP組無明顯差異。ANP組、GHRP-2組大鼠的胰腺病理評分均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01)，而GHRP-2組與ANP組間胰腺組織病理評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

2．血清淀粉酶、ghrelin、IL-1β水平的變化：除48 h點外，ANP組各時點血淀粉酶活性均顯著高于對照組(P<0.05或<0.01)；除24 h點外，GHRP-2組各時點血淀粉酶活性均顯著高于對照組(P<0.05或<0.01)。但ANP組與GHRP-2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

ANP組6、12、48 h點血清ghrelin水平顯著高于對照組(P<0.05或<0.01)；GHRP-2組3、12、48 h點血清ghrelin水平顯著高于對照組(P<0.05或<0.01)，3 h點的ghrelin水平顯著高于ANP組(P<0.05，表1)。

ANP組3、6 h點血清IL-1β水平顯著高于對照組(P值均<0.05)；GHRP-2組3、6 h點血清IL-1β水平顯著低于ANP組(P值均<0.05)，其他時點兩組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

血清ghrelin水平與血清IL-β水平、胰腺組織水腫及炎癥細胞浸潤評分、病理總評分均呈正相關(guān)(r值分別為0.355、0.229、0.330、0.292，P<0.05或<0.01)。

3．胰腺組織ghrelin mRNA表達的變化：ANP組6、12、24 h點胰腺組織ghrelin mRNA表達顯著高于對照組(P<0.05或<0.01，表1)；GHRP-2組24 h點胰腺組織ghrelin mRNA表達顯著高于對照組(P<0.05)，其他各時點無顯著差異；GHRP-2組與ANP組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組大鼠各項檢測指標比較

討論GHRP-2是一種人工合成的小分子多肽，是ghrelin的受體激動劑，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎等功能。Kato等[5]報道，GHRP-2可以提高心肌組織谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的比值，同時改善實驗動物的左心室功能。體外實驗還發(fā)現(xiàn)，GHRP-2對氧化修飾型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的動脈平滑肌細胞氧化應(yīng)激也有抑制作用[6]。新近研究結(jié)果顯示，GHRP-2對脂多糖(LPS)引起的肝損傷有保護作用，作用機制可能與同時降低肝細胞TNF-α表達和提高IGF-1 mRNA表達有關(guān)[1]。在LPS注射引起的肺損傷研究中，GHRP-2預(yù)處理可以減少LPS引起的炎癥介質(zhì)釋放、中性粒細胞浸潤，從而改善實驗動物的氧合能力[2]。因此，GHRP-2有可能通過抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)的途徑對疾病發(fā)展有保護作用。

Ghrelin在炎癥反應(yīng)中的保護作用已經(jīng)在多項研究中得到證實。在AP、急性腎損傷實驗研究中，外源性ghrelin干預(yù)可以使實驗動物的炎癥反應(yīng)減輕[3, 7-9]，還可以抑制膿毒癥引起的炎癥反應(yīng)和多器官功能障礙[10]，其機制可能與NF-κB、促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)等信號通路有關(guān)[7,9,11]。

本研究結(jié)果顯示，血清IL-1β水平在制模后3 h達峰值，然后逐漸到正常水平，提示ANP大鼠早期炎癥反應(yīng)最明顯。制模后，ANP組、GHRP-2組大鼠血清ghrelin逐漸升高，在12 h達峰值，且血清ghrelin水平與血清IL-1β水平、胰腺組織的病理損傷呈正相關(guān)，與Dembinski等[12]采用雨蛙肽誘導(dǎo)的AP動物模型結(jié)果類似，可作為預(yù)測AP嚴重程度的指標。此外，ANP組大鼠胰腺組織ghrelin mRNA表達顯著高于對照組，提示胰腺組織ghrelin mRNA表達上調(diào)也是ANP發(fā)病的早期事件。制模前應(yīng)用GHRP-2干預(yù)ANP大鼠，結(jié)果顯示GHRP-2組大鼠血清IL-1β水平較ANP組下降，血清ghrelin水平僅在制模后3 h高于ANP組，其他各時點均無顯著差異；而且胰腺組織病理評分、胰腺組織ghrelin mRNA表達均與ANP組無顯著差異，表明GHRP-2干預(yù)雖然在AP發(fā)病早期發(fā)揮一定的抗炎作用，同時引起血ghrelin水平升高，但對ANP胰腺的ghrelin mRNA表達無影響，也不足以改善ANP胰腺的病理損傷。這可能與ghrelin在胰腺外分泌腺泡細胞的表達量不高有關(guān)[13]。因此，GHRP-2干預(yù)ANP大鼠是否具有應(yīng)用前景尚待探討。

參 考 文 獻

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