KAI1基因?qū)θ艘认侔┞闶蠓N植瘤淋巴轉(zhuǎn)移的影響

劉旭 郭曉鐘 李宏宇 陳江 任麗楠 吳春燕 許文達(dá)

KAI1基因?qū)σ认侔┺D(zhuǎn)移的抑制作用已得到了證實(shí)，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)了該基因的高表達(dá)對動(dòng)物模型的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有抑制作用，但具體作用方式及機(jī)制尚不清楚。淋巴管新生是機(jī)體適應(yīng)局部及全身環(huán)境變化的代償或主動(dòng)誘導(dǎo)過程，可發(fā)生在包括胚胎發(fā)育、炎癥轉(zhuǎn)歸、傷口愈合和實(shí)體腫瘤等多種正常生理或病理過程中。研究顯示，淋巴管新生是腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的重要過程[1-3]。本研究應(yīng)用胰腺癌裸鼠皮下荷瘤模型，采用KAI1腺病毒瘤內(nèi)注射方式，觀察淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，淋巴管新生的變化，探討KAI1基因的作用機(jī)制。

材料和方法

一、胰腺癌裸鼠模型的建立

人胰腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MiaPaCa-2引自瑞士伯爾尼大學(xué)，本實(shí)驗(yàn)室保存。成功培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞，制備細(xì)胞密度為1.0×107/ml的細(xì)胞懸液。4～6周齡雄性BLAB/c裸鼠購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在本實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼養(yǎng)房SPF級層流柜內(nèi)分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)l周。然后將0.2 ml細(xì)胞懸液接種于裸鼠左側(cè)大腿外側(cè)皮下，定期觀察裸鼠精神、飲食及體重變化情況。

二、表達(dá)KAI1基因的腺病毒瘤內(nèi)注射

表達(dá)KAI1基因的腺病毒載體Ad-KAI1由本實(shí)驗(yàn)室先期構(gòu)建[4]。將成瘤的裸鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為生理鹽水組、腺病毒(Ad)組、Ad-KAI1組，每組10只，分別瘤內(nèi)注射生理鹽水、Ad和Ad-KAl1，每周1次，每次100 μl，共注射3次[5]。密切觀察裸鼠皮下腫瘤生長情況，每3 d用游標(biāo)卡尺測量并記錄腫瘤的最大徑(A)、最小徑(B)，并計(jì)算瘤體積(V)。V=A×B2×0.4。接種50 d后行頸椎脫臼處死裸鼠，解剖觀察淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，取出瘤體及淋巴結(jié)。稱重后浸泡于10%甲醛溶液固定。

三、病理學(xué)檢查及免疫組化染色

取固定的淋巴結(jié)和腫瘤組織，分別行常規(guī)病理學(xué)檢查及免疫組化染色檢測淋巴血管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體1(LYVE-1)的表達(dá)?？筁YVE-1抗體購自北京博奧森公司，工作濃度1∶100。胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性染色。由于LYVE-1為淋巴管特異性標(biāo)記物，故顯色陽性為淋巴管。在低倍鏡下(40、100倍)觀察整張切片的淋巴管分布情況，選擇癌灶內(nèi)微淋巴管密度最密集的3個(gè)區(qū)域，在400倍鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域中的淋巴管數(shù)，取3個(gè)區(qū)域的平均值作為該切片的微淋巴管密度(MLVD)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組荷瘤裸鼠腫瘤的生長情況

裸鼠接種Mia PaCa-2細(xì)胞2周后100%成瘤。3組裸鼠治療后皮下腫瘤的生長速度無明顯差異(F=2.62，P>0.05，圖1)。

接種50 d后各組裸鼠均無死亡，處死裸鼠后取出的瘤體重量，生理鹽水組為(2514.4±351.3)mg、Ad組為(2466.1± 295.5)mg，Ad-KAI1 組為(2294.4±255.4)mg，各組瘤重的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 3組胰腺癌種植瘤裸鼠皮下腫瘤的生長曲線

二、各組荷瘤裸鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況

生理鹽水組在接種28 d后首次發(fā)現(xiàn)左側(cè)腹股溝淋巴結(jié)腫大的裸鼠，50 d處死裸鼠解剖后發(fā)現(xiàn)有8只(80%)裸鼠左側(cè)腹股溝及左側(cè)腋窩淋巴結(jié)腫大，共收集到腫大淋巴結(jié)20枚，平均2.0枚/只。Ad組在接種后30 d發(fā)現(xiàn)有左側(cè)腹股溝淋巴結(jié)腫大的裸鼠，處死時(shí)有7只(70%)裸鼠發(fā)現(xiàn)該區(qū)域腫大淋巴結(jié)，共收集到腫大淋巴結(jié)15枚，平均1.5枚/只。Ad-KAI1組在接種35 d后首次發(fā)現(xiàn)左側(cè)腹股溝淋巴結(jié)腫大的裸鼠，處死時(shí)有4只(40%)裸鼠發(fā)現(xiàn)該區(qū)域腫大淋巴結(jié)，共收集到腫大淋巴結(jié)6枚，平均0.6枚/只。各組收集到的腫大淋巴結(jié)經(jīng)病理學(xué)檢查均發(fā)現(xiàn)形狀不規(guī)則的腫瘤細(xì)胞，確定為腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移灶(圖2)。3組裸鼠腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率及平均淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為3.14、3.35，P值均<0.05)。

圖2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的病理改變(HE ×200)

三、各組荷瘤裸鼠腫瘤組織內(nèi)淋巴管新生的情況

生理鹽水組、Ad組、Ad-KAI1組裸鼠胰腺癌種植瘤組織中MLVD分別為(18.70±5.60)、(19.40±4.58)、(9.80±4.10)個(gè)/400倍視野(圖3)。Ad-KAI1組MLVD顯著低于生理鹽水組和Ad組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為10.76、11.36，P值均<0.05)，而生理鹽水組和Ad組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)繪制散點(diǎn)圖發(fā)現(xiàn)，所有種植瘤的MLVD與腫瘤大小無相關(guān)性(圖4)。

圖3 Ad-KAI1組(a)、Ad組(b)、生理鹽水組(c)種植瘤組織的LYVE-1表達(dá)(×400)

圖4 微淋巴管密度與腫瘤重量散點(diǎn)圖

討 論

KAI1基因作為抑癌基因，在前列腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、纖維肉瘤等實(shí)驗(yàn)研究中，不管采用皮下、鼠尾靜脈、局部注射等不同方式成瘤，其結(jié)果相似，均發(fā)現(xiàn)KAI1高表達(dá)不影響原位癌的生長[6]。本研究結(jié)果與其一致。本研究組以往的研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中KAI1的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中KAI1基因低表達(dá)或不表達(dá)[7]。此外，KAI1基因下調(diào)可影響作為重要的淋巴管生成因子的VEGF的表達(dá)[8]。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了KAI1基因的高表達(dá)可抑制胰腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，已有研究證實(shí)，腫瘤的膨脹性生長造成組織間隙壓力增加和癌周圍間質(zhì)水腫，即癌間質(zhì)內(nèi)壓升高[9]，導(dǎo)致癌周淋巴管的錨絲張力增加，原有淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞連接脫離接觸；同時(shí)，腫瘤細(xì)胞釋放Ⅳ型膠原酶、透明質(zhì)酸酶等活性物質(zhì)，破壞毛細(xì)淋巴管周圍的網(wǎng)狀纖維和膠原纖維結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步破壞部分淋巴管壁[9-10]；此外，腫瘤細(xì)胞分泌促淋巴管生成因子VEGF-C、VEGF-D等，與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體VEGFR-3結(jié)合，刺激淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并在趨化因子的作用下向病變部位遷移[11]，從而形成新的淋巴管。腫瘤細(xì)胞還可刺激胚胎干細(xì)胞、成淋巴管細(xì)胞和淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞分化形成新的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，在細(xì)胞外基質(zhì)的協(xié)同作用下形成新的淋巴管。隨著淋巴管新生，腫瘤細(xì)胞利用其結(jié)構(gòu)的有利因素，通過自身的主動(dòng)運(yùn)動(dòng)和管腔外壓力的推擠，從新形成且結(jié)構(gòu)功能不全的內(nèi)皮細(xì)胞通道侵入毛細(xì)淋巴管腔內(nèi)，發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移[1]。

本研究結(jié)果顯示，通過瘤內(nèi)注射KAI1腺病毒，使KAI1基因高表達(dá)，可降低腫瘤組織內(nèi)微淋巴管密度。因此推測，在胰腺癌發(fā)展過程中抑制淋巴管的生成，降低微淋巴管密度可能是KAI1抑制胰腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。本研究結(jié)果還顯示，微淋巴管密度與荷瘤的重量無相關(guān)性，較小的腫瘤組織內(nèi)淋巴管密度并不低，提示KAI1基因?qū)α馨凸苻D(zhuǎn)移的抑制作用與腫瘤的體積及發(fā)展階段不相關(guān)，可能是自腫瘤發(fā)生早期至轉(zhuǎn)移一直持續(xù)存在的。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] He Y, Rajantie I, Pajusola K, et al. Vascular endothelial cell growth factor receptor 3-mediated activation of lymphatic endothelium is crucial for tumor cell entry and spread via lymphatic vessels[J]. Cancer Res, 2005, 65(11):4739-4746.

[2] Ochi N, Matsuo Y, Sawai H, et al. Vascular endothelial growth factor-C secreted by pancreatic cancer cell line promotes lymphatic endothelial cell migration in an in vitro model of tumor lymphangiogenesis[J]. Pancreas, 2007,34(4):444-451．

[3] Schulz P, Scholz A, Rexin A, et al. Inducible re-expression of p16 in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer inhibits lymphangiogenesis and lymphatic metastasis[J]. Br J Cancer, 2008,99(1):110-117.

[4] 張巍巍,郭曉鐘,王立生,等.KAI1復(fù)制缺陷型腺病毒載體抑制人胰腺癌細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)研究[J]. 胰腺病學(xué),2006,6(3):131-134.

[5] 田宏,郭曉鐘,徐建華,等.KAI1基因抑制胰腺癌轉(zhuǎn)移的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[J].中華胰腺病雜志,2008, 8(5):292-294.

[6] Mashimo T, Bandyopadhyay S, Goodarzi G, et al. Activation of the tumor metastasis suppressor gene, KAI1, by etoposide is mediated by p53 and c-Jun genes[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2000,274(2):370-376.

[7] Guo XZ, Friess H, Graber HU, et al. KAI1 expression is up-regulated in early pancreatic cancer and decreased in the presence of metastases[J]. Cancer Res, 1996, 56(21): 4876-4880.

[8] 劉旭,郭曉鐘,李宏宇,等.KAI1基因轉(zhuǎn)染對乏氧培養(yǎng)下胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞增殖、遷移及VEGF表達(dá)的影響[J].中華胰腺病雜志,2013,12(6):370-373.

[9] Liang P, Hong JW, Ubukata H, et al. Increased density and diameter of lymphatic microvessels correlate with lymph node metastasis in early stage invasive colorectal carcinoma[J]. Virchows Arch, 2006, 448(5):570-575．

[10] Gombos Z, Xu X, Chu CS, et al. Peritumoral lymphatic vessel density and vascular endothelial growth factor C expression in early-stage squamous cell carcinoma of the uterine cervix[J]. Clin Cancer Res, 2005,11(23):8364-8371．

[11] Saintigny P, Kambouchner M, Ly M, et al. Vascular endothelial growth factor-C and its receptor VEGFR-3 in non-small-cell lung cancer: concurrent expression in cancer cells from primary tumour and metastatic lymph node[J]. Lung Cancer, 2007,58(2):205-213.