氮磷限制條件下螺旋魚腥藻產(chǎn)生土嗅素特征研究

賈曉燕,劉 聰,2,儲(chǔ)昭升*,龐 燕,胡小貞 (.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院湖泊環(huán)境創(chuàng)新基地,環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 0002；2.北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院,北京 00083)

隨著人類生活水平的不斷提高,對(duì)水質(zhì)量的要求越來(lái)越高,水體異味已成為研究關(guān)注的重點(diǎn).異味問(wèn)題廣泛存在于各類淡水水體中,早在1883年就出現(xiàn)了有關(guān)水體異味的報(bào)道[1].已有研究表明了產(chǎn)生水體異味的主要原因[2]是水體富營(yíng)養(yǎng)化,在富營(yíng)養(yǎng)化水體中,由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)剩,藻類過(guò)度生長(zhǎng),由藻類代謝和腐爛分解產(chǎn)生的異味物質(zhì)是水體中異味物質(zhì)的主要來(lái)源.土霉味是淡水水體中存在最廣泛、且最難聞的異味.引起水體土霉味的主要物質(zhì)之一是土嗅素[3-5].螺旋魚腥藻是一種常見的土嗅素產(chǎn)生藻.影響螺旋魚腥藻產(chǎn)生土嗅素的因素主要有溫度[6]、光照[7]和營(yíng)養(yǎng)鹽[8-9].

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于水體異味及土霉味的研究主要集中在異味的分布及原因分析[10-12],異味物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)[13-14]及水體異味的防治措施[15-16]等方面,開展室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn),分析水體中氮磷含量對(duì)藻類生長(zhǎng)及產(chǎn)生異味物質(zhì)影響的研究鮮有報(bào)道.本文通過(guò)研究在氮限制和磷限制條件下,藻細(xì)胞密度、葉綠素 a的合成以及土嗅素產(chǎn)生量等,探討氮限制和磷限制對(duì)螺旋魚腥藻生長(zhǎng)、土嗅素生成及釋放的影響,為更好的預(yù)測(cè)和控制魚腥藻水華暴發(fā)和預(yù)防由此產(chǎn)生的異味事件提供參考.

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)所用螺旋魚腥藻從河北省秦皇島市洋河水庫(kù)分離獲得,在中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院藻類培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng).采用 M11培養(yǎng)基[17](mg/L:NaNO3100, K2HPO410, MgSO4·7H2O 75,CaCl2·2H2O 40, Na2CO320, Na2EDTA·2H2O 0.1),在溫度 26℃,光照強(qiáng)度 2500lx、光暗比 12h:12h的條件下培養(yǎng).

1.2 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)在10L的玻璃瓶中分為2組進(jìn)行,分別為缺氮條件和缺磷條件,每組設(shè)置兩個(gè)平行.在每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入8L M11培養(yǎng)基和200mL的洋河水庫(kù)底泥濾液,其中氮限制控制氮的濃度為1/10M11培養(yǎng)基,則氮的濃度為 1.647mg/L(N:P=0.93);而磷限制則控制磷的濃度為 1/10M11培養(yǎng)基,則磷的濃度為 0.178mg/L(N:P=92.53),然后用高壓滅菌鍋在121℃下滅菌30min.

藻種在接種前分別在缺氮和缺磷的M11培養(yǎng)基中進(jìn)行3d的饑餓培養(yǎng).在無(wú)菌條件下接種至10L玻璃瓶中,接種量為 5×103cells/mL,培養(yǎng)時(shí)曝氣量為2.5L/min.藻細(xì)胞密度和葉綠素a每5d取樣進(jìn)行分析,異形胞和土嗅素含量每3d取樣進(jìn)行分析.

1.3 測(cè)定方法

藻細(xì)胞密度和異形胞用浮游植物計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下測(cè)定,每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次.土嗅素采取固相微萃取(美國(guó) Supelco公司)與 HP7890/5975氣相色譜-質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)進(jìn)行測(cè)定[18].用玻璃纖維濾膜(Whatman GF-C)對(duì)藻液進(jìn)行過(guò)濾后測(cè)定胞外土嗅素,用未過(guò)濾的藻液測(cè)定土嗅素總量.胞內(nèi)土嗅素含量為土嗅素總量減去胞外土嗅素含量.葉綠素a采用玻璃研磨器,丙酮提取,分光光度法測(cè)定[19].總氮和溶解性總氮采用過(guò)硫酸鉀氧化,紫外分光光度法測(cè)定[20];總磷和溶解性總磷采用過(guò)硫酸鉀氧化,鉬銻抗分光光度法測(cè)定[21].

2 結(jié)果

2.1 螺旋魚腥藻的生長(zhǎng)特征

螺旋魚腥藻在磷限制條件下的生長(zhǎng)受到抑制,生長(zhǎng)遲緩,而在氮限制條件下迅速進(jìn)入一個(gè)相對(duì)較快的生長(zhǎng)期(如圖 1所示).磷氮限制條件下最大藻細(xì)胞密度分別為 5.48×104,2.26×105cells/mL,后者是前者的4倍.

圖1 螺旋魚腥藻的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of Anabaena sp.population

圖2 氮限制條件下異形胞形成的百分比Fig.2 Ratios of heterocyst under nitrogen-limited condition

螺旋魚腥藻在磷限制下幾乎不生成異形胞,在氮限制下則極易生成異形胞.在螺旋魚腥藻培養(yǎng)到第20d后異形胞形成比例為3.5%～4.4%(如圖2所示).

2.2 土嗅素生成量的變化趨勢(shì)

圖3 磷氮限制條件下土嗅素濃度的變化趨勢(shì)Fig.3 Varietion of geosmin concentration under phosphoruslimited condition and nitrogen-limited condition

圖4 單位細(xì)胞所含土嗅素濃度的變化Fig.4 Varietion of geosmin concentration in unit cell

在螺旋魚腥藻的整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中,其胞內(nèi)土嗅素的含量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于胞外(圖3).在磷限制條件下,土嗅素的最高濃度為 1.91×103ng/L;而在氮限制條件下,土嗅素的最高濃度為8.64× 103ng/L,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前者.胞內(nèi)土嗅素的濃度變化與藻細(xì)胞密度的變化趨勢(shì)基本一致.

在磷限制和氮限制2種培養(yǎng)條件下(圖4),單位細(xì)胞內(nèi)土嗅素的濃度在培養(yǎng)的前 20d內(nèi)都處于急速下降的趨勢(shì),之后開始趨于平緩,分別維持在 3.18×10-5,3.68×10-5ng/cell左右.

2.3 葉綠素a的含量及與土嗅素含量的關(guān)系

螺旋魚腥藻單位細(xì)胞生成的葉綠素 a含量的變化趨勢(shì)(圖 5)表明,在磷限制條件下,每細(xì)胞所含葉綠素 a的濃度在培養(yǎng)的前 7d急速下降,之后基本維持在 1.89×10-3ng/cell;而在氮限制條件下,每細(xì)胞所含葉綠素 a濃度的下降趨勢(shì)并不明顯,維持在3.67×10-3ng/cell左右.在氮限制條件下,魚腥藻更易形成葉綠素 a,在磷限制條件下,魚腥藻形成葉綠素 a的過(guò)程受到抑制,其值遠(yuǎn)低于氮限制條件下葉綠素a的量.

圖5 單位細(xì)胞所含葉綠素a濃度的變化趨勢(shì)Fig.5 Varietion of chl a concentration in unit cell

圖6 單位細(xì)胞分泌土嗅素與葉綠素質(zhì)量比的變化趨勢(shì)Fig.6 Varietion of geosmin/Chl a ratio in unit cell

魚腥藻單位細(xì)胞產(chǎn)生的土嗅素與葉綠素 a的質(zhì)量比(geosmin/chl a)在磷限制條件下要高于氮限制條件下(圖6).

2.4 培養(yǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)鹽的變化

在磷限制條件下,隨著藻細(xì)胞的生長(zhǎng),藻液中的溶解性總磷(DTP)逐漸降低(由 0.13mg/L降為0.02mg/L)(圖 7).在氮限制條件下,魚腥藻首先利用培養(yǎng)基中的氮源,藻液中的總氮(TN)和溶解性總氮(DTN)都有所下降(圖 7),當(dāng)培養(yǎng)基中氮源不能滿足魚腥藻生長(zhǎng)需要時(shí),魚腥藻開始生成異形胞,并進(jìn)行固氮作用.所以隨著藻細(xì)胞密度的增加,藻液中總氮(TN)的濃度有所提高.

圖7 磷限制下水體中磷的變化趨勢(shì)和氮限制下水體中氮的變化趨勢(shì)Fig.7 Varietion of phosphorus content in water column under phosphorus-limited condition and varietion of nitrogen content in water column under nitrogenlimited condition

3 討論

在磷限制和氮限制條件下,魚腥藻的生長(zhǎng)情況不同.Rashash等[22]研究魚腥藻時(shí),發(fā)現(xiàn)其藻細(xì)胞密度在低磷情況下比在低氮情況下明顯減少.這主要是由于螺旋魚腥藻為固氮藍(lán)藻,當(dāng)其處在缺氮條件下時(shí),魚腥藻會(huì)形成具有固氮作用的異形胞,異形胞可以直接固定大氣中的N2(分子態(tài)),形成藻細(xì)胞可以利用的氮素化合物,從而使其生長(zhǎng)并不受到很大影響.在本研究中,在氮限制條件下,異形胞形成比率約為 3.8%,螺旋魚腥藻生長(zhǎng)未受到明顯影響.在磷限制條件下,螺旋魚腥藻幾乎不生成異形胞且生長(zhǎng)受到抑制;所以可以通過(guò)控制排入水體中磷的含量,使水體處于磷限制,更能有效避免魚腥藻過(guò)度生長(zhǎng).

在生成土嗅素方面,磷限制條件下單位細(xì)胞土嗅素的生成量比氮限制條件下的生成量低約15%.Wu等[23]研究魚腥藻發(fā)現(xiàn)魚腥藻中的異形胞比其他細(xì)胞產(chǎn)生更多的土嗅素,本研究中螺旋魚腥藻在氮限制條件下更易產(chǎn)生異形胞,推測(cè)由異形胞產(chǎn)生的土嗅素是螺旋魚腥藻單位細(xì)胞土嗅素的生成量在氮限制條件下高于磷限制條件下的主要原因.

不論是氮限制還是磷限制條件下,螺旋魚腥藻胞內(nèi)土嗅素的含量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于胞外土嗅素的含量,這說(shuō)明螺旋魚腥藻在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中,其生成的土嗅素大部分都保留在細(xì)胞內(nèi),只有很少一部分釋放到了水體.劉妍娟等[24]在研究螺旋魚腥藻土嗅素的產(chǎn)生和分布規(guī)律時(shí)報(bào)道螺旋魚腥藻的胞內(nèi)土嗅素占總土嗅素的85%-95%,說(shuō)明土嗅素在螺旋魚腥藻生長(zhǎng)過(guò)程中主要分布在藻細(xì)胞內(nèi)部;Jüttner等[25]研究表明在藻細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)旺盛期(約前 4d),細(xì)胞內(nèi)異味化合物濃度不斷增加,98%左右的異味化合物存在于細(xì)胞內(nèi),隨著細(xì)胞的衰老(第4d后),細(xì)胞內(nèi)異味化合物濃度開始下降,而培養(yǎng)液中的異味化合物的濃度卻不斷增加;Rashash等[22]研究得出,在生長(zhǎng)的初期,魚腥藻產(chǎn)生的土嗅素大部分保留在了細(xì)胞里,在 20d之后,細(xì)胞內(nèi)和水體中的土嗅素比例相當(dāng);Rosen等[26]研究揭示魚腥藻細(xì)胞的死亡導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)土嗅素向介質(zhì)中的釋放.本研究中在營(yíng)養(yǎng)鹽限制條件下,螺旋魚腥藻的生長(zhǎng)受到抑制,未達(dá)到衰敗期,故仍處于生成的土嗅素保留在細(xì)胞內(nèi)的階段.基于上述情況,在預(yù)防水體中發(fā)生螺旋魚腥藻引起的嗅味問(wèn)題時(shí),可以通過(guò)過(guò)濾去除水體中的過(guò)量的藻類,從而減小發(fā)生水體的嗅味問(wèn)題幾率.

4 結(jié)論

4.1 螺旋魚腥藻在磷限制下生長(zhǎng)受到限制,幾乎不生成異形胞;在氮限制下生長(zhǎng)未受到明顯影響,平均生成 3.8%異形胞.在磷限制條件下,螺旋魚腥藻產(chǎn)生土嗅素的最高濃度為 1.91×103ng/L;在氮限制條件下,土嗅素的最高濃度為 8.64×103ng/L.

4.2 不論是氮限制還是磷限制,螺旋魚腥藻在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中,其生成的土嗅素大部分都保留在細(xì)胞內(nèi),只有很少部分(0.2%～10.4%)釋放到了水體.

4.3 魚腥藻單位細(xì)胞產(chǎn)生的土嗅素與葉綠素 a的質(zhì)量比(geosmin/chl a)在磷限制條件下要高于氮限制條件下.

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