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    子宮內電擊轉染技術在神經元樹突棘發(fā)育及神經纖維歸巢研究中的應用①

    2014-08-02 03:02:24段明慧李玲玲陳樹林趙善廷西北農林科技大學動物醫(yī)學院楊陵712100
    中國免疫學雜志 2014年3期
    關鍵詞:軸突電擊樹突

    段明慧 盧 習 張 偉 李玲玲 陳樹林 趙善廷 (西北農林科技大學動物醫(yī)學院,楊陵 712100)

    1888年,西班牙神經系統(tǒng)科學家Ramóny Cajal[1]利用Golgi染色方法發(fā)現了神經元樹突棘結構。隨著電子顯微鏡的出現,科學家們證實了神經元樹突棘作為突觸連接間的重要部件,是一種突出于神經元樹突表面的微小膜性結構。它具有一定的能動性,其形態(tài)具有一定的可塑性。在大腦發(fā)育過程中,樹突棘與突觸的發(fā)生密切相關。突觸的可塑性常常與樹突棘的形成、脫落、擴張、萎縮等形態(tài)變化相伴發(fā)生。樹突棘形態(tài)的改變與突觸效應的強弱及長時程增強效應(Long-term potentiation,LTP)也有密切關系[2-4]。LTP誘導產生的樹突棘的數量和形態(tài)的改變對于學習和記憶有著重要的研究意義,特別是在海馬和大腦皮層。

    神經元樹突棘作為突觸后膜的主要存在部位,是神經元接受外界信息、表現環(huán)境適應性、實現自身功能的主要部位。樹突棘結構的異常與神經系統(tǒng)的功能障礙也息息相關。在病理學研究中顯示阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease)、帕金森綜合癥(Parkinson’s disease)、脆性X染色體綜合征(Fragile-X syndrome)、癲癇(Epilepsy)、精神分裂癥(Schizophrenia)、成癮(Addiction)、中風(Stroke)等疾病中都有樹突棘的結構畸形[5,6]。可見,樹突棘的形態(tài)和動力學特征對神經障礙疾病的臨床診斷和治療都具有重大意義。

    在哺乳動物中,位于大腦縱裂底部的胼胝體是腦內最大的連合系統(tǒng),由兩側大腦皮層錐體細胞發(fā)出的軸突集合而成,負責兩側大腦半球之間的信息交換。近年來,遺傳學研究顯示分子信號通路對其投射的神經元和神經纖維導向尤為重要。這不僅在神經科學研究上更在臨床上有重大意義。胼胝體的發(fā)育畸形與人類許多先天性疾病相關,例如發(fā)育遲緩、運動障礙、智力障礙、癲癇、視力降低、語言障礙、情感和行為異常等[7,8]。

    子宮內電擊轉染技術(In utero electroporation,IUE)是研究基因功能的缺失和超表達的新型方法體系。相對于其他轉基因方法,IUE更為快速簡便,高效并具選擇性。雖然一個世紀以前科學家利用多種方法對神經元發(fā)育包括樹突棘形成及神經纖維歸巢的研究就已經開始,但關于其具體的分子機制、信號通路等仍舊不甚清楚。為更好的研究神經元發(fā)育,并由此指導其功能性的研究,利用子宮內電擊轉染技術將帶pCAG啟動子表達綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的質粒轉染到鼠胚大腦皮質的新生神經元中,在小鼠出生當天(Postnatal day 0,P0)和P28取材固定,結合激光共聚焦顯微鏡技術觀察被轉染神經元的所有細胞結構包括樹突、軸突及樹突棘,研究樹突棘的形態(tài)學特征和神經纖維歸巢的情況,從而為進一步研究神經元發(fā)育奠定了一種新型的技術基礎。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 本實驗中用到的動物為孕期(Embryonic day,E)為 15.5 d 的 C57BL/6J小鼠共 10只。成年C57BL/6J小鼠(3月齡)購自西安第四軍醫(yī)大學實驗動物中心。C57BL/6J小鼠放置于超凈鼠房[室溫(26±1)℃,相對濕度50% ~60%]適應7 d。按照雌∶雄=2∶1的比例進行合籠,次日上午檢查陰道栓。若見陰栓,當天上午記為孕期E0.5,小鼠出生當天記為P0。

    1.2 質粒構建 本實驗采用的電轉質粒由雞的βactin啟動子啟動EGFP,骨架載體pCAG-MCS購自百恩維生物,pEGFP-N1由本實驗室保存。以pEGFP-N1載體為模板通過PCR擴增得到EGFP基因片段,PCR引物為EGFP-F(5'-AGATCTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3')和EGFP-R(5'-AGATCTT TACTTGTACAGCTCGTC-3')。將 PCR產物電泳純化后回收,連接到pGEM-T Easy(Promega)上進行測序,將測序正確的菌落擴大培養(yǎng)并提取質粒,用BglⅡ進行單酶切,同時對pCAG-MCS空載體也用BglⅡ單酶切并用CIAP(TaKaRa)去磷酸化處理。電泳并回收處理后的EGFP基因片段和酶切后的pCAGMCS載體骨架片段,用T4連接酶將EGFP連接于pCAG-MCS的BglⅡ位點。挑取陽性克隆并做PCR鑒定,將陽性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序,保存測序正確克隆即為pCAG-GFP。

    1.3 子宮內電擊轉染 電轉操作過程(圖1)參照Saito等[9]的研究。選取 E15.5孕鼠,稱取其體重。用2~3 ml乙醚基礎麻醉,再行腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)做全身麻醉。待小鼠麻醉完全,剃除腹部被毛,充分暴露術部消毒皮膚即可開始手術。

    將麻醉完全的小鼠背臥式放于37.5℃恒溫板上。將一次性無菌手術墊單鋪于術部,沿腹中線作一長約1.5 cm的縱向切口,打開腹壁。沿腹腔背側進玻璃分針沿胚胎間隔處將左右兩側子宮輕輕拉出體外,并記錄胚胎情況。

    微電極拉制儀(P-97,Sutter,美國)按照如下參數拉制玻璃微電極:壓強500;熱度800;拉力30;速率40;時間1;平頭鑷子將玻璃微電極于外徑為50~80μm處作平齊斷口。利用拉制好的玻璃微電極吸取1~1.5μl的pCAG-GFP質粒(質粒由本實驗室存留,濃度1~5μg/μl)將質粒載體準確注射入小鼠胚胎大腦一側的側腦室中。將板狀電極置于注射質粒的小鼠胚胎頭部兩側,正極放于注射質粒一側,電穿孔儀(ECM830,BTX,美國)給予一定的電刺激。電擊的參數設置如下:電壓:30 V;每次持續(xù)時間:50 ms;間隔時間:950 ms;電擊次數:5次。

    手術過程中,37.5℃預熱的0.9% 無菌生理鹽水滴加于子宮外壁,保持濕潤,防止早期流產。電擊轉染結束后將子宮重新放回母鼠體內,并加入2 ml含有氨芐青霉素的生理鹽水。利用連續(xù)鎖邊縫合法分別縫合腹壁和皮膚后將孕鼠放回保溫鼠籠,繼續(xù)飼養(yǎng)。

    1.4 取材及切片 待電擊轉染基因小鼠出生后P0,立即在體視熒光顯微鏡(SZX16,Olympus,日本)下觀察,出現綠色熒光者(綠色熒光蛋白GFP顏色)標為陽性。部分陽性小鼠立即斷頭處死取腦,用4%多聚甲醛(Paraformaldehyde,PFA)固定。其余陽性小鼠繼續(xù)哺養(yǎng)4周后即P28,用4%PFA心臟灌注固定15 min,取出大腦。將大腦組織在4%PFA中后固定過夜。用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer,PB)清洗3次后用瓊脂包埋。在全自動震蕩切片機(VT1000S,Leica,德國)上做連續(xù)冠狀切片,厚度為50μm。

    1.5 熒光免疫組織化學 選取腦片放在24孔培養(yǎng)板中進行漂染。首先將切片在Rabbit anti-GFP一抗(1∶500)、Mouse anti-NeuN 一抗(1∶500,Millipore)混合液中4℃孵育過夜,然后0.1 mol/L PB清洗5次,每次10 min。清洗完畢加入Goat anti-rabbit 488二抗(1∶300)、Goat anti-mouse 568 二抗(1∶300,Millipore)混合液,室溫孵育3 h,0.1 mol/L PB清洗5次,每次30 min。DAPI(1∶1 000,Invitrogen)、PI(1∶1 000,Millipore)復染細胞核30 min,0.1 mol/L PB清洗5次,每次10 min。最后用熒光封片劑(Fluorescent mounting medium,DAKO,美國)加蓋玻片封片。

    1.6 圖像分析和統(tǒng)計學處理 利用激光共聚焦顯微鏡(TCSSP5,LEICA,德國)對染色后的切片觀察拍照。利用該顯微鏡拼圖和Z軸連續(xù)掃描功能拍攝鼠腦的全景照和單根神經元樹突的Z軸層掃疊加照片,用相應軟件導出Tiff格式圖片。用Photoshop CS3和Illustrator軟件處理圖片,分析轉染后神經元樹突棘的分布和軸突的投射情況。用Image J軟件計數大腦皮質第Ⅰ層中GFP陽性頂樹突上樹突棘的數量和密度,并統(tǒng)計樹突棘的分類情況。僅計數頭部清晰可辨的樹突棘,絲狀偽足不作計數。每只小鼠選取2張切片進行拍照計數。

    2 結果

    2.1 帶pCAG啟動子的質粒能在體內高效長時程表達所攜帶基因 本實驗所用轉染載體為含雞β-肌動蛋白啟動子(pCAG)的質粒,在該啟動子之后插入表達EGFP的cDNA序列以標記被轉染的細胞。實驗中出生后隨即處死的小鼠被轉染一側大腦皮質中有很強的綠色熒光(圖2A中的小島),免疫組化染色切片低倍鏡下觀察,被轉染一側大腦皮質中有大量被GFP標記的細胞,絕大多數位于靠近邊緣帶(Marginal zone,MZ)的部位(圖 2A、B),表明這些細胞已經完成了遷移過程,到達了它們的最終目的地。進一步放大顯示這些細胞已初具神經元的形態(tài),頂部有較長的樹突并出現少量分支,底部有細而長的軸突(圖2C1)。另外,在皮質板中還有少量GFP陽性細胞,它們呈現遷移神經元的典型雙極形態(tài)特征,一個卵圓形胞體,向上發(fā)出一根粗長而光滑的頂突起,向下發(fā)出一根細而短的尾突起(圖2A、B、C2),表明它們是正在遷移的神經元。為了檢測pCAG-GFP質粒能否在神經元內長時程表達,我們對E15.5轉染,P28取材的鼠腦進行了觀察。低倍鏡下發(fā)現轉染陽性的小鼠,P28的大腦皮質內仍有大量的GFP陽性細胞(圖2D)。這表明帶pCAG啟動子的質粒在體內可高效長時程表達。

    圖1 鼠胚子宮內電擊轉染技術Fig.1 Schematic representation of IUE protocols

    圖2 帶p CAG啟動子的質粒能夠在大腦神經元中高效長時程表達Fig.2 Long-term expression of GFP construct with pCAG promoter in electroporated brains

    2.2 GFP陽性細胞多為晚期出生的神經元 P28取材的鼠腦在低倍鏡下觀察發(fā)現,GFP陽性細胞的胞體多靠近大腦皮質的表面,位于皮質的淺層,相當于大腦皮質的Ⅱ~Ⅳ層(圖3A)。高倍鏡下觀察發(fā)現絕大多數GFP陽性細胞具有大量突起,呈現典型的神經元形態(tài)。胞體呈大的圓形或三角形,從胞體發(fā)出一個粗而長的頂樹突和多個較細且長短不一的基樹突。頂樹突一般伸向大腦皮質的表面,并發(fā)出許多分支(圖3B、E,圖4A)。在多數情況下,在頂樹突的對側從胞體上發(fā)出一根細而長的軸突。

    圖3 GFP陽性細胞為晚期出生神經元Fig.3 GFP-positive cells are later-born neurons

    為了驗證GFP陽性細胞是否是神經元,我們用一種神經元的特異性標記物抗體NeuN進行免疫組織化學染色,發(fā)現90%GFP陽性細胞的胞核為NeuN陽性(圖3B~D),表明 E15.5轉染,P28表達GFP的細胞絕大多數為神經元。因為這些GFP陽性神經元胞體大多靠近大腦皮質的表面,位于皮質的淺層,相當于大腦皮質Ⅱ-Ⅳ層的部位。表明它們應為晚期出生的神經元,這與轉染的時間點一致。

    圖4 GFP陽性神經元具有大量樹突棘Fig.4 GFP-labeled neuron with dendritic spines

    2.3 GFP陽性神經元具有大量的樹突棘 因為P28大多數神經元已經成熟,應具有大量的樹突棘。為了觀察子宮內電擊轉染方法是否能夠標記樹突棘,我們用油鏡對切片進一步放大觀察。結果發(fā)現,在GFP陽性神經元的各級樹突上有大量形態(tài)不一的小棘狀結構(圖4A~C)。我們對大腦皮質第Ⅰ層中樹突上的小棘進行了定量計數和分析,小棘的密度約為(11.83±2.17)個/10μm 樹突。既有矮粗的穩(wěn)定性樹突棘,也有頭小頸細長的細長型樹突棘,還有頭大頸粗短的蘑菇型樹突棘,其中細長型占多數,為59%,短粗的穩(wěn)定型占23%,而蘑菇型最少,僅占18%。

    圖5 GFP陽性神經元軸突投射到對側的海馬和大腦皮質Fig.5 GFP-Labeled axons were traced in the contralateral cortex and hippocampus

    2.4 GFP陽性神經元的軸突能遠距離投射 在對P28取材的鼠腦的冠狀切片進行全面觀察后我們發(fā)現,除了在轉染一側的大腦皮質有大量GFP陽性的神經元胞體及其密集的突起(包括樹突和軸突)外,在對側大腦皮質的某些部位及兩側海馬及胼胝體中,也有大量 GFP陽性的細絲狀結構(圖2D,圖5A、B、C),應為被轉染一側 GFP陽性神經元的軸突。這表明pCAG-GFP質粒表達的GFP不但能夠標記被轉染神經元的胞體和樹突,而且還可以通過軸突順向運輸到達軸突的末端。進一步放大觀察表明在兩側海馬內GFP陽性神經纖維主要分布于CA1區(qū)的腔隙分子層,在轉染對側的大腦皮質中GFP陽性神經纖維主要密集分布于兩個柱狀區(qū)域,且在皮質的淺層(Ⅱ~Ⅲ層)(圖5C)。

    3 討論

    在神經元樹突棘和突觸的可塑性探索中,使樹突棘可視化的技術方法顯得尤為重要。其中Golgi染色技術曾在神經解剖學領域被廣泛應用。雖然這種方法較好地保持了神經元的細微結構,但是Golgi染色法步驟繁瑣,過程較長,并且不能用于做活體觀察,這大大限制了神經科學工作者的研究思路。近年來Ziv和Smith等利用DiO等親脂性熒光染料標記神經元和樹突棘獲得成功[10-12]。雖然這種方法可以進行活體觀察,但是同Golgi染色法一樣,只能非特異性標記神經元和神經膠質細胞等。除此以外,也有學者利用Thy-1-GFP轉基因小鼠觀察神經元樹突棘[13]。雖然 Thy-1-GFP轉基因小鼠能夠持續(xù)表達綠色熒光,但是只能用于觀察成熟神經元的樹突棘,因為在這種轉基因小鼠中GFP僅在成熟神經元中表達。

    神經纖維的投射與大腦皮層的分層有重要意義,神經元產生的時間對軸突的投向也具有一定作用。在哺乳動物中,胼胝體是中樞神經系統(tǒng)最大的連接纖維束,連接兩側大腦半球,主要起協調雙側大腦半球的功能。組成胼胝體的神經纖維向兩側大腦半球內部的前、后、左、右輻射,連系額、頂、枕、顳葉,形成兩側側腦室頂。大腦皮層的胼胝體連接對兩側大腦半球的信息交流有著重要作用,但至今其機理尚未明了,仍有待研究。

    本研究中,我們利用子宮內電擊轉染技術清晰顯示了神經元樹突和樹突棘的形態(tài)特點,并且成功觀察到神經元軸突和軸突投射的情況,從而允許我們對大腦發(fā)育過程中神經元纖維歸巢進行研究。

    近年來,研究者借助子宮內電擊轉染技術成功將外源基因轉入小鼠和大鼠胚胎[9,14,15],用以研究大腦皮層的發(fā)育情況,從而展露出該方法在研究大腦發(fā)育和相關分子機制方面的優(yōu)勢。相對于神經元樹突棘的其他研究方法,子宮內電擊轉染技術有著更多的優(yōu)勢:①與培育基因敲除鼠相比,該方法操作簡便,可以更為快速地研究目的基因的缺失和超表達對細胞結構和功能的影響;②多種不同的基因能夠同時轉入同一個細胞,從而能夠結合分析基因的功能;③相對于脂質體轉染、病毒載體等,該轉染方法細胞毒性低,轉染效率高。但是,子宮內電擊轉染技術仍然存在一些技術難點。不同時期的胚胎所需要電擊參數不盡相同;胚胎存活率也有待進一步提高;實驗人員的操作技術對胚胎的轉染效果也有一定影響。

    總而言之,子宮內電擊轉染技術是研究大腦不同發(fā)育階段中樞神經系統(tǒng)不同區(qū)域結構功能的一種強而有力的方法。我們利用子宮內電擊轉染技術,將綠色熒光蛋白GFP轉入小鼠大腦皮層,結合激光共聚焦顯微技術,清晰地顯示了正常發(fā)育過程中被轉染神經元的所有細胞結構包括樹突、軸突及樹突棘,使用子宮內電轉方法標記大腦皮層的錐體細胞,持續(xù)穩(wěn)定表達的GFP將這些神經元發(fā)出的軸突顯示出來,可以觀察胼胝體的整個發(fā)育過程。從而為更深入地研究神經元發(fā)育,包括樹突棘的發(fā)生和可塑性,神經纖維的歸巢的分子機制等奠定了有力的技術基礎。

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