加拿大楊莖段愈傷組織誘導及不定芽分化研究

花陽景，林碧瑜，張智勇，游佳琪，劉希華

（三明學院資源與化工學院，福建 三明 365004）

加拿大楊莖段愈傷組織誘導及不定芽分化研究

花陽景，林碧瑜，張智勇，游佳琪，劉希華

（三明學院資源與化工學院，福建 三明 365004）

以加拿大楊莖段為外植體探討不同激素處理對愈傷組織誘導及不定芽形成的影響。研究表明，在外植體消毒中，以0．1%升汞處理4．5m in時間效果最好，以MS培養(yǎng)基+0．15mg·L-1TDZ+0．1mg·L-1NAA+1．0mg·L-16-BA的愈傷組織誘導率最高達60%。叢生芽誘導最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0．15mg·L-1TDZ+0．125mg·L-1NAA+1．25mg·L-16-BA，叢生芽誘導率達86．7%。

加拿大楊；愈傷組織；不定芽；組織培養(yǎng)

加拿大楊（Populus canadensis Moench）又稱加楊、歐美楊，屬于楊柳科（Salicaceae），是美洲黑楊和歐洲黑楊雜交種。其生長迅速，繁殖容易，適應性較強，既可以成片造林，又能做“四旁”栽植，全國各地均有種植，生長快速[1]。木材質軟而輕，是優(yōu)良的纖維用材樹種[2]，因其樹冠闊，葉片大而有光澤，宜作行道樹、庭蔭樹、公路樹及防護林等，又因其孤植、列植均適宜，故是常見的綠化樹種，也是“四旁”綠化和營造農田林網(wǎng)的重要樹種之一[1]。近年來，加拿大楊應用前景看好，但是由于受到母種材料的短缺，還有繁殖季節(jié)較短的限制，常規(guī)的扦插繁殖已經(jīng)很難滿足生產中對種苗的需求。在全國范圍內的退耕還林及退耕還草的形勢下，加拿大楊已經(jīng)呈現(xiàn)出供不應求的趨勢。加拿大楊的組培再生體系的研究卻未見報道。本研究是通過對加拿大楊莖段的愈傷組織誘導和不定芽的分化研究，目的是解決加拿大楊在生產中種苗不足的問題，加速實現(xiàn)加拿大楊工廠化育苗，完善加拿大楊的組培快繁體系。同時通過愈傷組織的誘導分化研究，為加拿大楊的遺傳改良和遺傳轉化等研究工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自于三明學院的加拿大楊樹上當年生枝條。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體處理與培養(yǎng)

2012年8月～10月之間，選取三明學院的加拿大楊當年生枝條，于中午時分，采取健康的枝條，從自莖尖開始剪成約2 cm左右的莖段。外植體處理的過程是：洗潔精洗凈，浸泡30 min→0.1%的多菌靈浸泡3 0min→流水沖洗2.0 h→75%酒精處理30 s→0.1%升汞溶液處理→無菌水沖洗5遍。

接種時，將芽以形態(tài)學下端接入培養(yǎng)基，芽原基接觸培養(yǎng)基。每瓶植入一個芽段。做好標記，放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，光強2000 lx，光照時間12h·d-1，溫度(25±1)℃。每隔2～3 d觀察一次，清出污染的組培瓶以減少污染，觀察記錄結果。

1.2.2 升汞處理對外植體誘導的影響

為比較0.1%升汞的處理時間對外植體的影響，采用4種升汞處理時間（2.5，3.5，4.5，5.5min）。每個處理20瓶，3次重復。

1.2.3 愈傷組織誘導培養(yǎng)基的選擇

將莖段接種到以MS為基本培養(yǎng)基，以NAA、6-BA、TDZ 3種不同濃度的激素組合做為探討因素，激素配比采用L9（34）正交試驗設計，設計如表1，培養(yǎng)基中含3%的蔗糖、8 g的瓊脂，pH值為6.0。每組處理20瓶，3次重復，1個月后觀察愈傷組織生長情況并統(tǒng)計誘導率。

表1 莖段愈傷組織誘導培養(yǎng)因素與水平表

1.2.4 叢生芽的誘導與分化

以MS為基本培養(yǎng)基，加入0.15 mg·L-1TDZ、3%的蔗糖和8g的瓊脂，pH值為6.0。以雙因素完全隨機設計來分析6-BA（0.75、1.25mg·L-1）和NAA（0.075、0.125 mg·L-1）兩種濃度的激素組合對不定芽分化的影響。將大小相近的愈傷組織分別接在4種培養(yǎng)基上，每個處理接種30塊愈傷組織，3次重復。每隔一個月繼代一次。30 d后觀察愈傷組織和叢生芽生長狀況，統(tǒng)計各處理叢生芽誘導率。

1.3 統(tǒng)計方法與數(shù)據(jù)分析

觀察愈傷組織及叢生芽產生的時間，愈傷組織以及叢生芽生長狀況，形態(tài)以及顏色等。對相關試驗結果統(tǒng)計，拍照。統(tǒng)計愈傷組織誘導率，叢生芽誘導率。

出愈率（%）=產生的愈傷組織數(shù)/接種的外植體數(shù)×100

叢生芽誘導分化率（%）=叢生芽分化數(shù)/轉接愈傷組織數(shù)×100

芽分化數(shù)=叢生芽個數(shù)/轉接愈傷組織數(shù)

采用唐啟義的DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)[3]。

表2 升汞處理時間對出愈率的影響

2 結果與分析

2.1 升汞消毒處理時間對出愈率的影響

升汞的處理時間對外植體的生長會產生一定的影響，假如處理時間過長，外植體會受到傷害甚至是死亡，處理時間過短則殺菌消毒不徹底，外植體在培養(yǎng)過程中容易染菌。結果表明，第1（2.5 min）與第2（3.5 min）處理組大部分為細菌污染，第3（4.5 min）與第4（5.5 min）處理組則多為真菌污染。由表2可以得當0.1%升汞的時間超過5.5 min后，無菌率明顯提高，消毒效果明顯，但出愈率則相對最低，說明外植體開始受到升汞的毒害作用。但隨著0.1%升汞處理時間的減少，無菌率也相對降低，這樣出愈率也較低。綜合0.1%升汞的不同處理時間的無菌率和出愈率，發(fā)現(xiàn)第3處理組即0.1%升汞處理4.5 min，無菌率相對較高，達到70%，出愈率也達到60%。

升汞處理時間低于3.5 min，外植體所引起的污染多是細菌所引起的污染，外植體殺菌時間不夠徹底。在4.5 min這段時間內，滅菌效果則較好，污染率低，出愈率超過5.5 min，因此0.1%升汞處理時間以4.5 min為最佳。

2.2 不同激素配比對愈傷組織誘導研究

采用正交試驗來分析不同的激素種類與濃度對愈傷組織誘導的影響。誘導結果如表3。

表3 不同激素濃度對愈傷組織誘導的影響

由表3的統(tǒng)計結果可以看出，莖段愈傷組織所用的三種植物激素6-BA，NAA，TDZ不同配比的培養(yǎng)基中，莖段愈傷組織最高誘導率可以達到60.0%。因此，對于莖段外植體的最佳誘導培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+0.15mg·L-1TDZ，長出的愈傷組織如圖1和圖2，大小約為3.30cm2，為嫩綠色，致密狀愈傷組織，在轉接培養(yǎng)后，調整激素后，能誘導出不定芽。而第1組即，MS培養(yǎng)基+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA+0.05mg·L-1TDZ，愈傷組織誘導率僅16.7%，而且面積也比較小，大小僅2.53 cm2，且為土黃色，絮狀，在經(jīng)過轉接培養(yǎng)2個月后，愈傷組織逐漸消亡。

表4 方差分析表

對正交試驗的各因素進行分析，K代表每個因素試驗結果的總和，從表3中的K值大小可以看出，愈傷組織誘導培養(yǎng)中的各因素最優(yōu)組合是A2B2C3，而這一組合正好在這個正交試驗表中出現(xiàn)，即MS培養(yǎng)基+1.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+0.15mg·L-1TDZ。從R值（代表每個因素3個水平的K值的全距）大小可以看出，3個因素對出愈率影響的主次關系為：C→A→B，各處理的較優(yōu)因子依次為：C3，A2，B2。同時本研究對出愈率進行方差分析（表4），僅C因素（TDZ）達到顯著。

圖1 愈傷組織誘導

圖2 愈傷組織誘導

2.3 不同激素濃度對叢生芽誘導分化培養(yǎng)

由表5可知，對于加拿大楊通過愈傷組織進行叢生芽的誘導培養(yǎng)中，第4處理組的叢生芽誘導率最高，高達86.7%，且叢生芽長較好（圖4）。培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.15mg·L-1TDZ+1.25mg·L-16-BA+0.125mg·L-1NAA。愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基15d后，愈傷組織上長出嫩綠的小芽，愈傷組織整體變得更致密，基部靠近培養(yǎng)基的部分變紅，如圖3。經(jīng)過1個月的培養(yǎng)后，芽開始生長分化，芽生長最高為2.5 cm，如圖4。對雙因素進行方差分析（表6），結果表明，NAA因素達到顯著差異，而6-BA則不顯著。

表5 激素濃度對叢生芽的誘導分化培養(yǎng)

表6 方差分析表

3 討論

在普通的自然條件下，在8～10月份進行外植體取材，其組織培養(yǎng)的污染率低[4]。同時，采取外植體時必須保證前3 d以上的天氣晴朗，避免雨天所帶來的真菌，細菌污染。本研究通過0.1%升汞不同消毒時間，得出0.1%升汞時間在4.5 min時，無菌率相對較高，達到70%，出愈率也達到60%。

以莖段為外植體的愈傷組織誘導分化培養(yǎng)中，最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+0.15mg·L-1TDZ，長出的愈傷組織大小約為3.30 cm2，為嫩綠色，致密狀愈傷組織，在轉接培養(yǎng)后，調整激素后，能誘導分化出不定芽。作為建立再生體系的前提及基礎，愈傷組織的誘導非常關鍵。其形成一般分為3個階段：誘導期、分裂期和形成期[5]。加拿大楊莖段則采用6-BA、NAA以及TDZ 3種激素搭配誘導愈傷組織的產生，NAA能夠誘導莖段脫分化形成愈傷組織，形成綠色致密狀的愈傷組織，加入TDZ可促進叢生芽的分化，形成的芽體生長迅速。TDZ是一種新型具有細胞分裂素活性的一類物質，是一種苯基脲衍生物，商品名為塞苯隆。在各種細胞分裂素類物質當中，TDZ的作用最明顯，通常最小的用量就能起到明顯的效果[6]。

圖3 不定芽誘導分化

圖4 不定芽誘導分化

在加拿大楊叢生芽的誘導培養(yǎng)中，采用MS+0.15mg·L-1TDZ+1.25mg·L-16-BA+0.125mg·L-1NAA這個配比的培養(yǎng)基叢生芽誘導率最高，高達86.7%，且叢生芽生長較好。在6-BA、NAA以及TDZ的協(xié)調作用下，成功誘導出叢生芽。器官的形成是由生長素與細胞分裂素的相互之間的比率所決定的，不是由絕對物質濃度決定的[5]。同時，在加拿大楊叢生芽芽誘導過程中，低濃度的TDZ也起到了促進作用。賈小明等人[7]在新疆楊(P.alba L.var.pyramidais）和河北楊（P.hopeiensis Huet Chow）莖段再生過程中都發(fā)現(xiàn)了TDZ的濃度對叢生芽分化有重要影響。較低濃度的TDZ有利于叢生芽的分化，較高濃度的TDZ則抑制叢生芽的分化。

［1］王金華．加拿大楊栽培技術及應用［J］．現(xiàn)代農村科技，2013（17）：55．

［2］C XU E，黃海，夏新興．加拿大楊木P-RC APMP漿及其漂白硫酸鹽漿的協(xié)同效應［J］．國際造紙，2006，25（6）：16-19．

［3］唐啟義，馮明光．實用統(tǒng)計分析及其DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)［M］．北京：科學出版社，2002：49-265．

［4］劉希華，曾淑蘭，丁昌俊，等．雷公藤以芽繁芽組織培養(yǎng)研究［J］．西南林學院學報，2009，29（1）：35-38．

［5］劉希華，毛玲榕，邢建宏．雷公藤愈傷組織誘導與懸浮培養(yǎng)不定芽誘導［J］．三明學院學報，2010，27（6）：577-580．

［6］王關林，方宏筠．高活性細胞激動素TDZ在植物組織培養(yǎng)中的應用［J］．植物學通報，1997，16（1）：77-80．

［7］賈小明，樊軍鋒，王娟娟．河北楊和新疆楊離體葉片誘導不定芽研究［J］．西北農林科技大學學報：自然科學版，2006，34（12）：109-115．

（責任編輯：朱聯(lián)九）

Callus Induction and Adventitious Bud Regeneration from the Stem of Populus Canadensis

HUA Yang-jing,LIN Bi-yu,ZHAN Zhi-yong,YOU Jia-ji,LIU Xi-hua
(College of Resources and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China)

Taking the stem of Populus canadensis as amaterial,the effect for callus induction and bud differentiation w ith different phytohormone was studied.The result showed that the time effect for the explants dealing w ith 0.1%Hgcl2 about 4.5 m in was the best.Themost suitable formula for induction of callus was MS+0.15mg·L-1TDZ+0.1mg·L-1NAA+1.0mg·L-16-BA,callus induction rate was 60%.Themost suitable formula for shoot-inducing medium was MS+0.15mg·L-1TDZ+0.125mg·L-1NAA+1.25mg·L-16-BA,Multiple shoot clumps induction ratewas86.7%.

Populus canadensis；callus；adventitiousbud；tissue culture

S792．112

A

1673-4343（2014）02-0079-05

2014-01-20

福建省大學生創(chuàng)新項目（201311311024）；福建省科技廳重點項目（2011N 0030）；福建省教育廳科技項目（JA11249）。

花景陽，男，福建安溪人，大學生。通訊作者：劉希華，男，福建閩清人，博士，副教授。研究方向：生物技術。