組培川貝母質量標準研究

江明殊，王躍華，劉 濤，劉 婷，孫 娜，王曉霞

(1.成都大學 生物產(chǎn)業(yè)學院，四川 成都 610106;2.四川師范大學 生命科學學院，四川 成都 610101)

0 引 言

川貝母為百合科貝母屬多種植物的干燥鱗莖，其包括川貝母、暗紫貝母、梭砂貝母和甘肅貝母等［1－2］.川貝母中含有多種類型化學成分，現(xiàn)代研究表明，總生物堿是其主要有效成分，其藥理活性廣泛，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等功效［3－5］.近年來，野生川貝母藥材資源日益匱乏，藥材質量不斷下降，采用組培技術對川貝母進行培育已成為行業(yè)的熱點.本課題組前期利用組培技術成功培育出了大量產(chǎn)質較優(yōu)的川貝母，為了更好地控制組培川貝母的質量，本研究按照《中國藥典》2010 版一部川貝母項下標準，對組培川貝母質量進行了研究，以期為其質量評價和控制提供相關依據(jù).

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

實驗所用儀器包括:FA－2004 型分析天平(上海良平儀器儀表有限公司)，BS－6KH 型電子天平(上海友聲衡器有限公司)，KQ－100 型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)，SX－2.5－10 型馬弗爐(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，坩堝(常規(guī))、干燥器(常規(guī))、無灰濾紙、薄層板、毛細管.

1.2 藥品及試劑

實驗所用藥品包括:組培川貝母由本課題組自主 培 育(批 號，20130528、20130412、20130326、20130619、 20130618、 20130405、 20130723、20130909、20130830、20131025);貝母素甲(批號，20110825)、貝母素乙(批號，20110416)由中國食品藥品檢定研究所提供.

實驗所用試劑包括:乙醇(95%)(分析純AR)(批號，20110823)、甲醇(分析純AR)(批號，20100213)、三氯甲烷(分析純 AR)(批號，20110524)、濃氨水(分析純AR)(批號，20120220)、氫氧化鈉(分析純AR)(批號，20090228)、硅膠G 粉(分析純AR)(批號，20120508)、羧甲基纖維素鈉(分析純AR)(批號，20110425)，均由成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn);實驗用水為超純水.

2 方法與結果

2.1 檢 查

2.1.1 總灰分測定.

組培川貝母總灰分按照《中國藥典》2010 版附錄IXK 項下方法進行測定，結果見表1.

表1 總灰分測定

根據(jù)測定結果，規(guī)定本品灰分不得超過2%.

2.1.2 酸不溶性灰分測定.

組培川貝母酸不溶性灰分按照《中國藥典》2010 版附錄IXK 項下方法進行測定，結果見表2.

表2 酸不溶性灰分測定

根據(jù)測定結果，規(guī)定本品酸不溶性灰分不得超過1%.

2.2 浸出物測定

組培川貝母浸出物按照《中國藥典》2010 版附錄XA 項下方法測定，用稀乙醇作溶劑:稱取組培川貝母粉末2 g，精密稱定，置150 mL 錐形瓶中，精密加53%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h 后連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h，放冷后取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用53%乙醇補足減失重量，搖勻，用干燥器濾過，精密量取濾液25 mL置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計算浸出物含量，結果見表3.

表3 浸出物測定

根據(jù)測定結果，確定本品浸出物不得少于20%.

2.3 薄層色譜鑒別

2.3.1 對照品溶液制備.

取貝母素甲、貝母素乙對照品適量，分別加甲醇制成每1 mL 各含1 mg 的溶液，制得對照品溶液.

2.3.2 供試品溶液制備.

取組培川貝母細粉末(批號，20130528、20130619、20130723、20130830)10 g，加濃氨試液10 mL，密塞，浸泡1 h，加二氯甲烷40 mL，超聲1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL 溶解，制得供試品液.

2.3.3 點樣、展開、顯色.

吸取上述對照品溶液各2 μL、供試品溶液1 ～6 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯—甲醇—濃氨水試液—水(18∶ 2∶ 1∶ 0.1)為展開劑展開，依次噴以稀碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉乙醇試液對組培川貝母進行顯色鑒別.結果表明，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，呈現(xiàn)相同顏色的斑點.

2.4 生物堿含量測定

2.4.1 對照品溶液制備.

對照品溶液按照《中國藥典》2010 版一部中川貝母項下方法制備:取西貝母堿5 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加入三氯甲烷至刻度，搖勻，制得對照品溶液.

2.4.2 供試品制備條件選擇.

在確定供試品的制備方法時，本實驗分別采用了超聲和回流2 種方法，發(fā)現(xiàn)回流方法效果較好.同時，還考察了以1∶ 1、2∶ 1、3∶ 1、4∶ 1 為三氯甲烷—甲醇混合比以及當回流溫度為60 ℃、70 ℃、80 ℃和回流時間為1 h、2 h、3 h 時，對川貝母總生物堿含量的影響.最終確定:當三氯甲烷—甲醇混合比為4∶ 1，溫度為80 ℃，回流2 h 時，制備出的川貝母供試品總生物堿含量最高，此與《中國藥典》2010 版的結果一致.

2.4.3 供試品制備.

實驗中，采用紫外分光光度法測定供試品的總生物堿含量:精密稱取組培川貝母2 g 置具塞錐形瓶中，加濃氨液3 mL，浸潤1 h，加三氯甲烷—甲醇(4∶ 1)混合液40 mL，置80 ℃水浴加熱回流2 h，放冷濾過，濾液置50 mL 量瓶中，用適量三氯甲烷—甲醇(4∶ 1)混合液洗滌藥渣2 ～3 次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷—甲醇(4∶ 1)混合液至刻度，搖勻;精密量取2 ～5 mL，置25 mL 具塞試管中，水浴蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL 使其溶解，精密加水5 mL，再精密加0.05%溴甲酚綠緩沖液2 mL，密塞，劇烈振搖，轉移到分液漏斗中，放置30 min，取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，待用.以相應的試劑為空白，采用紫外分光光度法，在波長415 nm 處測定吸光度，用回歸方程［7］計算其總生物堿的含量.

式中，A 為吸光度;n;稀釋倍數(shù);W 為試樣質量g.

2.4.4 標準曲線的繪制.

精密量取“2.4.1”項下制備的對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，1.0 mL 置25 mL 具塞試管中，分別補加三氯甲烷至10 mL，精密加水5 mL，再精密加0.05%溴甲酚綠緩沖液2 mL，密塞，劇烈振搖，轉移到分液漏斗中，放置30 min，取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，以相應的試劑為空白，采用紫外分光光度法，在波長415 nm 處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結果如圖1 所示.

圖1 標準曲線

回歸方程為，

Y=7.8171X－0.001，r=0.9999，

結果顯示，取樣量在0.004 99 ～0.035 07 mg 范圍具有良好的線性關系.

2.4.5 精密度.

取“2.4.1”項下制備的對照品液6 份各0.4 mL置25 mL 具塞試管中，分別補加三氯甲烷至10 mL，精密加水5 mL，再精密加溴甲酚綠2 mL，振蕩后放置30 min，用分液漏斗分液并取續(xù)濾液，以相應的試劑為空白，采用紫外分光光度法，在波長415 nm 處測定吸光度，其RSD 為1.69%.實驗結果表明，本方法精密度較好.

2.4.6 重復性.

取組培川貝母(批號:20130830)6 份，按“2.4.3”項下方法測定，其RSD 為0.675%.實驗結果表明，本方法重復性較好.

2.4.7 穩(wěn)定性.

取按“2.4.3”方法下制備的供試品液0.4 mL置25 mL 具塞試管中，補加三氯甲烷至10 mL，精密加水5 mL，再加溴甲酚綠2 mL，閉塞，振蕩后放30 min 后取續(xù)濾液，以相應的試劑為空白，采用紫外分光光度法，在波長415 nm 處，時間間隔為，0、30、60、90、120、180、240 min 時，測定吸光度，其RSD 為1.35%.結果表明，在所測時間內基本穩(wěn)定.

2.4.8 加樣回收率.

取已知含量的組培川貝母(批號:20130830)6份各2 g，再加入與所加樣品等量的總生物堿對照品溶液，按“2.4.3”項下方法測定，計算加樣回收率，結果如表4 所示.

表4 加樣回收率實驗結果(n=6)

表4 數(shù)據(jù)表明，本方法加樣回收率符合規(guī)定.

2.4.9 組培川貝母生物堿含量測定.

取各批號組培川貝母，按照“2.4.3”項下方法進行測定，結果如表5 所示.

表5 組培川貝母生物堿含量測定結果

根據(jù)表5 測定結果，取其平均值的±20%為上下限，規(guī)定組培川貝母中總生物堿含量范圍為0.20% ～0.30%.

3 討 論

生物堿是川貝母主要的有效成分［8］，本研究在實驗中也曾使用蒸發(fā)光散射法測定組培川貝母中的生物堿，但其色譜條件重復性較差，不符合相關技術要求，其液相測定方法有待進一步研究.最終還是參照《中國藥典》2010 版一部中川貝母項下的紫外分光光度法對其生物堿進行含量測定.

通常，一種藥材質量標準的建立還應該對其進行重金屬、砷鹽的檢測，而本實驗中所用到的實驗材料屬于組培物，通過人為控制其生長環(huán)境，使其在生長的過程中未受到來自重金屬以及砷鹽的污染，故不對其做相應的檢測.

目前，關于川貝母的灰分測定中只包括總灰分，本實驗在此基礎上還增加了酸不溶性灰分檢測.實驗結果表明，組培川貝母的酸不溶性灰分不得超過1%，此為更好地控制川貝母的質量標準提供了依據(jù).

川貝母為名貴的川產(chǎn)道地藥材，常生長在海拔3 500 ～4 500 m 區(qū)域［9］，生長周期長，加之近幾年過度采挖，導致野生川貝母資源日漸匱乏.有報道稱，組培川貝母總生物堿含量幾乎都高于野生川貝母鱗莖［10］，因此，利用組培技術能夠在人為控制條件下快速獲得大量品質優(yōu)良的川貝母，此也是將藥用植物從傳統(tǒng)種植走向產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的重要手段之一.但目前還未有報道給出組培川貝母的質量標準，因此，本實驗在完成川貝母組培的基礎上，建立了組培川貝母的質量標準，這有利于人們在今后的研究中對其進行質量控制.

［1］謝志民，王敏春，呂潤霞.貝母類中藥品種的本草考證［J］.中藥材，2000，23(7):423－427.

［2］閻博華，豐芬，邵明義，等.川貝母基源本草考證［J］.中醫(yī)研究，2010，23(3):69－71.

［3］YEUM H S，EE YC，KIM S H，et al.Fritillaria cirrhosa，Anemarrhena asphodeloides，Lee-Mo-Tang and cyclosporine a inhibitoval bumin-induced eosinophil accumulation and Th2-mediated bronchial hyperresponsiveness in a murine model of asthma［J］.Basic Clinical Pharmacology ＆ Toxicology，2007，100(3):205－213.

［4］Li H J，Jiang Y，Li P.Characterizing distribution of steroidal lkaloids in Fritillaria spp.and related compound formulas by lliquid chromatography-mass spectrometry combined with hierarchial cluster analysis［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216(11):2142－2149.

［5］Zhou J L，Xin G Z，Shi Z Q，et al.Characterization and dentification of steroidal alkaloids in Fritillaria species using liquid chromatography coupled with electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2010，1217(45):7109－7122.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2010.

［7］匡菊香，劉龍忠，葉鳳.半邊蓮總生物堿正交試驗提取工藝［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2009，20(6):43－44.

［8］王躍華，代勇，閆勝杰，等.卷葉貝母愈傷組織快速增殖條件的研究［J］.西南農業(yè)學報，2010，23(2):528－531.

［9］楊楊，姜虹，傅華龍，等.野生和組培川貝母總生物堿含量的測定和定位研究［J］.四川大學學報(自然科學版)，2008，45(1):209－213.

［10］吳玉良.川貝母流浸膏質量標準的研究［D］.成都:成都中醫(yī)藥大學，2012.