大鼠骨質(zhì)疏松骨折局部注射辛伐他汀對愈合的影響

冀瑞鋒 韓樹峰

大鼠骨質(zhì)疏松骨折局部注射辛伐他汀對愈合的影響

冀瑞鋒 韓樹峰

目的 觀察不同劑量辛伐他汀溶液對于骨質(zhì)疏松大鼠股骨骨折愈合的影響。方法 3月齡健康雌性大鼠45只分為5組（n=9），手術(shù)組（A）；卵巢切除組（B）；骨質(zhì)疏松骨折組（C）；骨質(zhì)疏松性骨折+辛伐他汀1組（D）;骨質(zhì)疏松性骨折+辛伐他汀2組（E），A組大鼠僅實施假手術(shù)不切除雙側(cè)卵巢，其余B～D組均要求切除雙側(cè)卵巢。C、D、E組在切除雙側(cè)卵巢8周后，制左側(cè)股骨中段橫行骨折模型，D組在骨折局部注射5mg/(kg·d)辛伐他汀溶液，E組注射10mg/(kg·d)辛伐他汀溶液，C組注射不含辛伐他汀的空載體，A、B組在術(shù)后8周處死，取出完整左側(cè)股骨，其余3組在骨折造模后4周處死，并取出全部左側(cè)股骨，測定左側(cè)股骨的骨密度、HE染色并光鏡下觀察。結(jié)果 （1）切除卵巢8周后，測定B組骨密度顯著低于A組（P＜0.05）。（2）骨質(zhì)疏松骨折3組，C、D、E組的pBMD、mBMD、dBMD、tBMD均顯著高于C組（pBMD：F=16.94，P=0.001；mBMD：F=15.57，P=0.001；dBMD：F=24.77，P=0.001；tBMD：F=23.46，P=0.001），D、E 2組中E組各部分骨密度值均高于D組，且有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（3）形態(tài)學(xué)觀察：HE染色后觀察，D、E組較C組而言有較多的板層骨形成，并且D、E組中有較多量的軟骨細(xì)胞存在，C組中幾乎不可見板層骨存在，軟骨細(xì)胞數(shù)量較少，提示D、E組較C組愈合快。結(jié)論辛伐他汀溶液皮下注射可以明顯加速骨質(zhì)疏松骨折愈合的進(jìn)程，而且不同濃度的辛伐他汀溶液對骨質(zhì)疏松骨折愈合的影響不同。高劑量明顯比低劑量效果更為顯著。

骨質(zhì)疏松；骨折；骨折愈合；辛伐他汀

隨著全球人口結(jié)構(gòu)老齡化的矛盾的突顯,一系列老年疾病成為困擾老年人健康的主要問題。骨質(zhì)疏松作為一種老年性全身性疾病,以骨量減少,骨微結(jié)構(gòu)破壞,骨韌性降低脆性增加為主要特征。骨質(zhì)疏松后骨折成為最常見的并發(fā)癥。骨質(zhì)疏松后骨折在臨床上有治療困難,愈合較慢等一系列問題,嚴(yán)重影響骨折的預(yù)后及患者生活質(zhì)量。有研究表明老年患者髖部骨折后第1年死亡率高于43%,5年死亡率超過75%[1]。骨質(zhì)疏松骨折后內(nèi)固定困難,容易出現(xiàn)內(nèi)固定失敗[2]。骨質(zhì)疏松治療中多為口服抑制骨質(zhì)吸收類藥物,如二磷酸鹽等防治骨量進(jìn)一步丟失,但骨質(zhì)疏松治療過程中服藥周期長,不良反應(yīng)大,患者長期服藥的依從性較低[3]。目前骨質(zhì)疏松治療中主要是補(bǔ)充鈣及維生素D連用、二磷酸鹽、雌激素替代、降鈣素等治療,但并發(fā)骨折后這些藥物往往不能及時快速起效促進(jìn)骨折愈合。尋找有效古今骨折愈合藥物是治療骨質(zhì)疏松骨折的當(dāng)務(wù)之急。

近年來研究發(fā)現(xiàn)的常用降脂藥辛伐他汀有促進(jìn)成骨的作用,可以有效促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2的表達(dá)增強(qiáng),從而有效增加骨量,減少骨量丟失[4]。本次試驗嘗試在骨質(zhì)疏松大鼠左側(cè)股骨骨折局部皮下注射不同濃度辛伐他汀溶液來觀察其對骨質(zhì)疏松骨折愈合情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和設(shè)備

1.1.1 試劑 辛伐他汀分散片（批號：3137185,廣州市南新制藥有限公司,中國）；二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide, DMSO,sigma公司,美國）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA,Roche公司,瑞士）；青霉素（批號：s1209409,華北制藥,中國）。

1.1.2 設(shè)備 雙能X線骨密度儀（DEXA,型號：Disco very-Wi,Hologic公司,美國）。

1.1.3 實驗動物 3月齡的健康雌性Wistar大鼠45只（山西醫(yī)科大學(xué)生理實驗室提供）,體質(zhì)量250～300g。

1.2 實驗方法

1.2.1 辛伐他汀注射液配置 將辛伐他汀粉碎后溶解于含有2%的DMSO與0.1%的BSA的PBS混合液中[4]。濃度為

5mg/mL與10mg/mL。同時配置不含辛伐他汀的空載體,并用60Co輻照滅菌。

1.2.2 大鼠處理及分組 45只大鼠隨機(jī)分為5組,每組

9只,假手術(shù)組（A）；卵巢切除組（B）；骨質(zhì)疏松骨折組（C）；骨質(zhì)疏松性骨折+辛伐他汀1組（D）；骨質(zhì)疏松性骨折+辛伐他汀2（E）組。A組大鼠僅實施假手術(shù)不切除雙側(cè)卵巢,其余各組B～D組均要求切除雙側(cè)卵巢,術(shù)后給予大鼠肌注80萬單位青霉素

BID。C、D、E組在切除雙側(cè)卵巢8周后,制股骨中段橫行骨折模型。術(shù)后給予大鼠肌注80萬單位青霉素BID。骨折術(shù)后當(dāng)天即開始骨折局部皮下注射辛伐他汀溶液,連續(xù)皮下注射7d。D組在骨折局部注射5mg/(kg·d)辛伐他汀溶液,E組注射10mg/ (kg·d)辛伐他汀溶液,C組注射不含辛伐他汀的空載體。

A、B2組大鼠在術(shù)后飼養(yǎng)8周后處死,取出左側(cè)完整股骨行DEXA檢測測量左側(cè)股骨的骨密度；其余各組于骨折模型后4周處死,取出完整左側(cè)股骨,并對其經(jīng)行DEXA檢測,脫鈣后石蠟包埋并HE染色做組織切片觀察形態(tài)。

各組大鼠在相同環(huán)境下飼養(yǎng),空氣濕度為30%～40%,溫度為21℃～23℃,12h.12h明暗交替環(huán)境下飼養(yǎng)。給予標(biāo)準(zhǔn)自由飲食,飲水為去離子水,飲食為標(biāo)準(zhǔn)固體飼料（由山西醫(yī)科大學(xué)動物中心提供）。

1.3 DEXA測量 應(yīng)用DEXA機(jī)器,在高分辨率模式下對各組大鼠左側(cè)股骨經(jīng)行骨密度測量,測量時取出固定用克氏針,將測量指標(biāo)分為4項分別為整體骨密度值（tBMD）,股骨近端（上1/3）骨密度值（pBMD）,中段（中1/3）骨密度值（mBMD）,遠(yuǎn)端（下1/3）骨密度值（dBMD）。

1.4 骨痂組織HE染色 將左側(cè)股骨骨折模型取出,10%多聚甲醛中固定48h,再將其取出,放入10% EDTA-2Na 緩沖液(pH7.4,4℃)脫鈣,隔天更換一次緩沖液,連續(xù)脫鈣2個月,待脫鈣完全以后,用梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋后以

5μm為寬度經(jīng)行連續(xù)切片,行HE然后后封片,并于顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 將實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。正態(tài)計量資料采用“x±s”表示；2組正態(tài)計量數(shù)據(jù)的組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料用例數(shù)（n）表示,計數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗；利用單因素方差分析(ANOVA)及LSD檢驗比較各組之間的差異,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠死亡 B～E組切除雙側(cè)卵巢后由于術(shù)后感染,腹脹,其他不明原因造成的大鼠死亡分別為B組死亡2只,C組死亡1只,D組死亡2只,E組死亡2只。C,D,E組內(nèi)固定后由于固定失敗或感染等因素造成死亡分別為C組2只,D組1只, E組1只。合計A組假手術(shù)組死亡1只,B組死亡2只,C組死亡3只,D組死亡3只,E組死亡3只。

2.2 骨質(zhì)疏松造模檢測

2.2.1 A、B2組大鼠體質(zhì)量 A組僅實施假手術(shù)手術(shù)部位及方式與B組相同,但不切除雙側(cè)卵巢,術(shù)后大鼠飲食飲水狀態(tài)較差,術(shù)后2d飲食恢復(fù)正常。2組大鼠在相同環(huán)境下飼養(yǎng),飼養(yǎng)8周后,B組切除雙側(cè)卵巢的大鼠個頭明顯較A組大,B組體質(zhì)量也較A組有明顯差異。

2.2.2 A、B2組骨密度測定 測定A/B 2組左腿的整體骨密度值,A組（0.2383±0.01000）g/cm2；B組（0.2062± 0.0158）g/cm2,B組較A組骨密度值顯著降低（P＜0.05）。

2.3 骨折組骨密度及組織切片

2.3.1 骨密度值測定 C、D、E組大鼠造左側(cè)股骨中段骨折的模型,并在骨折斷端進(jìn)行局部皮下給與不同濃度的辛伐他汀溶液,左股骨骨密度值：D、E組均顯著高于C組（P＜0.05）；E組高于D組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05,見表1）。

2.3.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 在HE染色后觀察,D、E組較C組而言有較多的板層骨形成,并且D、E組中有較多量的軟骨細(xì)胞存在,C組中幾乎不可見板層骨存在,軟骨細(xì)胞數(shù)量較少,提示D、E組較C組愈合快。

表1 各骨折組骨密度（g/cm2,n=6）

3 討論

3.1 骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松后骨折 世界衛(wèi)生組織(WHO)關(guān)于骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)的定義是：以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加和易于骨折為特征的代謝性骨病,其組織病理學(xué)特點是單位體積內(nèi)的骨量(bone mass)降低而骨礦物質(zhì)與骨基質(zhì)的比例仍正?；蚧菊！Ｈ蚍秶鷣碚f大約有超過7000萬人口的骨質(zhì)疏松癥患者伴發(fā)有骨折的風(fēng)險[4]。骨質(zhì)疏松后骨質(zhì)脆性增加,內(nèi)固定穩(wěn)定性差,臨床治療難度高。隨著近年來人口老齡化程度加重,骨質(zhì)疏松癥及其并發(fā)骨折等一系列問題日益凸顯,成為威脅老年人健康的重要因素,骨質(zhì)疏松后骨折造成的致死致殘率高,患者帶來身體創(chuàng)傷和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)加重。

3.2 他汀類藥物對骨質(zhì)的作用 他汀類作為臨床上廣泛用于心血管疾病的預(yù)防用藥。Mundy G等研究發(fā)現(xiàn)他汀類有促進(jìn)骨質(zhì)生成的新藥理作用[5]。為其應(yīng)用于骨質(zhì)疏松治療提供了新的途徑。近年來他汀類應(yīng)用于骨質(zhì)疏松治療經(jīng)行了研究,并提供大量證據(jù)。Song等研究辛伐他汀可以增加雌激素受體α的數(shù)量,并可以促進(jìn)BMP-2的生成[6]。宋純理等研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞使用辛伐他汀可以有效組織BMC成脂分化[7]。他汀類口服藥物需要經(jīng)過肝臟代謝,而此類藥物肝臟的首過效應(yīng)明顯,進(jìn)入血液循環(huán)的藥物僅不足5%,到達(dá)骨折局部區(qū)域作用的血藥濃度更低[8],通過嘗試新的途徑給藥以尋求更有效的提高藥物利用的方法。Yin H等研究表明辛伐他汀可以減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)并增加NO的生成,可以減輕H2O2對于細(xì)胞的損傷并增加ALP在成骨細(xì)胞的表達(dá)[9]。近年來有多種嘗試全新給藥方式的研究,王晶瑩等研究嘗試填充物混合辛伐他汀修復(fù)骨缺損[10]。楊寧等研究表明骨質(zhì)疏松大鼠股骨內(nèi)單次注射辛伐他汀可以強(qiáng)化骨骼[11]。這些都說明辛伐他汀對于骨質(zhì)形成有明顯效果,本次實驗采用骨折斷端局部皮下注射辛伐他汀溶液,盡可能避免肝臟代謝引起的首過消除效應(yīng),加強(qiáng)局部斷端血藥濃度,從而進(jìn)一步觀察不同局部藥物濃度對骨折愈合情況。為探索新的給藥方式提供一種可能。

研究結(jié)果顯示,對骨折各組間骨密度值進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn),局部注射辛伐他汀可以明顯增加局部骨密度值,組織切片也顯示出注射辛伐他汀有促進(jìn)骨質(zhì)愈合的作用。本實驗條件下對于不同濃度的辛伐他汀皮下注射有較顯著地促進(jìn)骨質(zhì)疏松骨折愈合的效果,不同劑量之間骨質(zhì)疏松骨折愈合情況差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.3 不足與展望 本實驗僅就不同濃度辛伐他汀溶液局部注射對骨折愈合影響做了研究,結(jié)果提示,辛伐他汀可以有效促進(jìn)骨質(zhì)疏松骨折愈合,為治療骨質(zhì)疏松骨折提供可能的給藥途徑和劑量參考。但對于骨折局部注射在不同時間的作用效果未作進(jìn)一步研究,無法明確更合理的用藥周期。隨著辛伐他汀后續(xù)研究進(jìn)一步深入,相信在不久將來骨質(zhì)疏松骨折的辛伐他汀治療將有更廣闊的應(yīng)用前景。

[1] Stewart NA,Chantrey J,Blankley SJ,et al.Predictors of 5 year survival following hip fracture Injury[J].Injury,2011，42(11):1253-1256.

[2] 吳子祥，雷偉，胡蘊玉,等.局部注射緩釋型bBMP對去勢綿羊椎體骨骼影響的研究.中華骨科雜志，2008,28(1):51-55.

[3] Cramer JA,Gold DT,Silverman SL.et al.A systematic review of persistence and compliance with bisphosphonates for osteoporosis[J]. Osteoporos Int，2007，18(8):1023-1031.

[4] Mundy G,Garrett R,Harris S,et al.Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins[J].Science，1999，286(5446):1946-1949.

[5] Boyle WJ,Simonet WS,Lacey DL.Osteoclast differentiation and activation[J].Nature，2003，423(6937):337-342.

[6] Li X,Song QS,Wang JY,et al.Simvastatin induces estrogen receptoralpha expression in bone,restores bone loss,and decreases ERa expression and uterine weight in ovariectomized rats[J].J Bone Miner Metab,2011,29(4):396-403.

[7] 宋純理，賈弘禔，馬慶軍,等.骨髓基質(zhì)細(xì)胞成脂分化及辛伐他汀對其影響的實驗研究[J].中華老年醫(yī)學(xué)，2004,23(4):263-266.

[8] Wang JW,Xu SW,Yang DS,et al.Locally applied simvastatin promotes fracture healing in ovariectomized rat[J].Osteoporos_lnt,2007,18（12）:1641-1650.

[9] Yin H,Shi ZG,Yu YS,et al.Protection against osteoporosis by statins is linked to a reduction of oxidative stress and restoration of nitric oxide formation in aged and ovariectomized rats[J].Eur J Pharmacol，2012，674(2-3):200-206.

[10] 王晶瑩,宋泉生,朱靜琳,等.辛伐他汀復(fù)合聚乳酸修復(fù)顱骨極限缺損的實驗研究[J].中國微創(chuàng)外科雜志,2009,9(12):1148-1151.

[11] 楊寧,崔岳毅,韓曉光,等.骨質(zhì)疏松大鼠股骨內(nèi)單次注射辛伐他汀強(qiáng)化骨骼的實驗研究[J].中華骨科雜志,2012,5(32):500-506.

Objective To explore the effect of different dose simvastatin solution injected subcutaneously for femur fracture healing of osteoporotic rats. Methods Forty-five 3-mouths old female Wistar rats were randomly divided into 5 groups (n=9). Group A is the sham operation. B-E are the groups with rats which

ovariectomy. The rats in group A、B were sacrificed after 8 weeks under operation. The rats in group C, D and E were further used to establish open fracture models of femur and fixed with intramedullary nails 8 weeks after ovariectomy. C, D and E injected subcutaneously of Simvastatin solutions or vehicle (C with vehicle, D with 5 mg/(kg·d),E with 10mg/(kg·d)). The fractured rats were sacrificed 4 weeks after fracture. Bone mineral density were used to evaluate fracture healing quantitatively,and the femurs were then decalcified for HE staining and subsequent histological observation. Results The BMD of group B is significantly lower than group A after 8 weeks under ovariectomy （P＜0.05）. BMD of group D and group E are significantly increased than group C. The BMD of group E is significantly higher than group C. The rats in group D and E showed more mature callus with partially lamellar bone. The observation of histological showed the process of fracture healing of group C with vehicle was delayed. Conclusion The injection of simvastatin solutions can accelerate the process of fracture healing of osteoporotic rats. The highe dose of simvastatin solution can be more efficient than low.

Osteoporosis; Fracture; Fracture healing; Simvastatin

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.25.001

山西 030001 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院骨科（冀瑞鋒 韓樹峰）

韓樹峰 E-mail：drhanshufeng@sohu.com