兩種芽孢桿菌降解大豆油特性研究和比較

梁筱露+黃朝斌+白海濤

摘 要 本研究采用實驗室分離篩選出的兩株降油菌株地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿，通過含油廢水的生物除油條件實驗表明，地衣芽孢桿菌降解大豆油的最佳條件為：菌體接種量為10%，2 ml/L的油濃度，pH值為9.2，37℃250rpm。在此條件下，大豆油的平均降解率可達(dá)96.09%。而枯草芽孢桿菌降解大豆油的最佳條件為：菌株的接種量為8%，2ml/L的油濃度，pH值為7.2，30℃ 200rpm。在此條件下，大豆油的平均降解率可達(dá)80.1%。經(jīng)過實驗證明地衣芽孢桿菌在最佳除油條件下，對大豆油的降解率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于枯草芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞 大豆油；降解率；地衣芽孢桿菌；枯草芽孢桿菌

中圖分類號：S182 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-7597（2014）13-0047-03

隨著人民生活水平的提高以及工業(yè)餐飲業(yè)的發(fā)展，排放在水體中的油脂含量日益增高。含油廢水污染范圍廣，對人類和生態(tài)環(huán)境危害性大，油污染嚴(yán)重時還會直接導(dǎo)致水生動物的窒息死亡[1]。油的漂移和擴(kuò)散，也會荒廢海灘和海濱旅游區(qū)，造成極大的環(huán)境危害和社會危害，更重要的是廢水中石油含有致癌烴，被魚、貝富集并通過食物鏈危害人體健康。隨著人民對環(huán)保的日趨重視，對含油廢水的處理顯得越來越重要[2]。對于含油廢水的處理，人們采用了不同方法，如物理法有篩濾、沉淀、隔油等，化學(xué)法有絮凝、吸附、電解等，這些方法一般投資大、流程復(fù)雜、且化學(xué)方法會產(chǎn)生二次污染。相比之下，微生物能利用油脂作為生長的碳源和能源，使之水解成甘油和脂肪酸，最終降解為水和CO2等代謝產(chǎn)物，此法成本低、無二次污染，同時微生物降解油脂還具有來源廣泛、選用便利、操作簡單等優(yōu)點[3]。據(jù)文獻(xiàn)[4]報道，從油田集油站污染土壤中分離出的枯草芽孢桿菌能夠降解原油，而且降解率達(dá)到34.3%。同時也有研究[5]表明從餐廳隔油池廢水分離得到的芽孢桿菌經(jīng)鑒定可以降解油脂，降解率達(dá)到97.3%。因此，本實驗為了探討兩種芽孢桿菌的除油條件和降解特性，進(jìn)行了以下研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1）菌種。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）由實驗室分離篩選，編號為AM-1。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由實驗室分離篩選，編號為AM-2。

AM-1和AM-2種子培養(yǎng)基用液體LB進(jìn)行培養(yǎng)，取單菌落中一定量菌種在LB斜面培養(yǎng)基上劃線，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)12h，然后置于4℃的冰箱內(nèi)保存。

2）實驗用大豆油。本實驗采用市售的金龍魚精煉一級大豆油。原料產(chǎn)國阿根廷，出廠日期2012-3-9，制造商益海（廣州）糧油有限公司，121℃，滅菌20 min待用。

3）培養(yǎng)基。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母膏 5 g/L、NaCl 10 g/L、初始pH值為7.2，121℃，滅菌20min。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：（NH4）2SO4 0.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.05 g/L、K2HPO4 0.3 g/L、初始pH 7.2，121℃，滅菌20 min。

待測培養(yǎng)基：為了考察所篩選菌株除油效果，故需模擬實際廢水的狀況，以自來水中加入少量的無機(jī)鹽即可較準(zhǔn)確的滿足實際廢水狀況的要求。待測培養(yǎng)基即為無機(jī)培養(yǎng)基加入大

豆油：

（NH4）2SO4 0.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.05 g/L、K2HPO4 0.3 g/L、大豆油 2 ml/L、初始pH 7.2。

1.2 實驗測試方法

1）種子培養(yǎng)液的制備。將菌株AM-1和AM-2從斜面菌種中用接種環(huán)挑取一定量菌種分別接入兩個裝有50 ml LB液體培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，置于37℃ 200rpm的搖床中培養(yǎng)10-12 h。

2）菌種濃度測定。菌體濃度的測定采用分光光度法，取1 ml菌液稀釋到10 ml，在600 nm的波長下以對照的無機(jī)培養(yǎng)基為空白測出吸光值。

3）大豆油降解率的測定。樣品為加入菌液的待測培養(yǎng)基，空白為未加入菌液的待測培養(yǎng)基，分別用25 ml石油醚萃取，用分液漏斗分液，取上層于50 ml的大比色管中，再分別取400 μL于25 ml小比色管中石油醚定溶到10 ml，采用紫外分光光度計在215 nm波長下測量大豆油石油醚萃取液的OD值，計算大豆油降解率（除油率用百分比來表示）。

大豆油的降解率：

1.3 降解大豆油條件優(yōu)化實驗研究

1.3.1 不同接種量對大豆油降解率的影響

6個250 ml的三角瓶分別加入50 ml、49 ml、48 ml、

47 ml、46 ml和45 ml的無機(jī)培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為7.2，加入

0.5 ml 5g/L CaCl2儲備液，100 μL的大豆油，分別加入

0 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml和5 ml的種子培養(yǎng)液。將培養(yǎng)瓶放入37℃ 200rpm的搖床中培養(yǎng)120 h（即5天）。

1.3.2 不同油濃度對除油率的影響

取10個250 ml的三角瓶，5個空白加入50 ml的待測培養(yǎng)基，其他5個樣品均加入等量的無機(jī)培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為7.2，加入0.5 ml 5g/L CaCl2儲備液，分別加入油量為25 μL、

50 μL、75 μL、100 μL和125 μL，每個油濃度均對應(yīng)一個空白和一個樣品，其中空白不加種子培養(yǎng)液，樣品加入1.3.1的最佳除油效果接種量的種子培養(yǎng)液量。將培養(yǎng)瓶放入37℃ 200rpm的搖床中培養(yǎng)120 h（即5天）。endprint

1.3.3 不同pH值對大豆油降解率的影響

取6個250 ml的三角瓶，其中一個為空白加入50 ml的待測培養(yǎng)基，pH值調(diào)至7.2，其他5個為樣品均加入46 ml的待測培養(yǎng)基，pH值分別為5.2、6.2、7.2、8.2和9.2，加入0.5 ml 5g/L CaCl2儲備液，加入1.3.2中最佳除油效果的油濃度，其中空白不加種子培養(yǎng)液，樣品加入1.3.1的最佳除油效果接種量的種子培養(yǎng)液量。將培養(yǎng)瓶放入37℃ 200rpm的搖床中培養(yǎng)120 h（即5天）。

1.3.4 不同溫度對大豆油降解率的影響

取10個250 ml的三角瓶，其中5個空白加入50 ml的待測培養(yǎng)基，其他5個為樣品均加入46 ml的待測培養(yǎng)基，pH值調(diào)至1.3.3最佳除油效果的pH，加入0.5 ml 5g/L CaCl2儲備液，加入1.3.2最佳除油效果的油濃度，其中空白不加種子培養(yǎng)液，樣品加入1.3.1的最佳除油效果的接種量的種子培養(yǎng)液量。將培養(yǎng)瓶放入轉(zhuǎn)速為200rpm溫度分別為25℃、30℃、35℃、37℃和45℃的搖床中培養(yǎng)120 h（即5天），每一個溫度設(shè)一個樣品和空白。

1.3.5 不同搖床轉(zhuǎn)速（溶氧）對大豆油降解率的影響

取10個250 ml的三角瓶，其中5個空白加入50 ml的待測培養(yǎng)基，其他5個為樣品均加入46 ml的待測培養(yǎng)基，pH值調(diào)至1.3.3最佳除油效果的pH，加入0.5 ml 5 g/L CaCl2儲備液，加入1.3.2最佳除油效果的油濃度，其中空白不加種子培養(yǎng)液，樣品加入1.3.1最佳除油效果的接種量的種子培養(yǎng)液量。將培養(yǎng)瓶放入溫度為1.3.4除油效果最佳的溫度，轉(zhuǎn)速分別設(shè)為100rpm、150rpm、200rpm、250rpm和280rpm的搖床中培養(yǎng)120 h（即5天），每一個轉(zhuǎn)速設(shè)一個樣品和空白。

1.4 最優(yōu)條件下的除油效果驗證

在上述實驗得出的最優(yōu)條件下進(jìn)行平行實驗，設(shè)置20個培養(yǎng)瓶進(jìn)行平行實驗，培養(yǎng)120h（即5天），計算大豆油的降解率，求出平均降解率。

2 結(jié)果與討論

1）不同接種量對大豆油降解率的影響。菌株AM-1當(dāng)接種量在2%到10%之間時，除油率隨接種量的增加而升高，當(dāng)接種量在10%以上時，降解率反而呈現(xiàn)下降趨勢（圖1），菌株AM-1接種量為10%時除油效果最佳；而菌株AM-2當(dāng)接種量在2%到8%之間時，除油率隨接種量的增加而升高，當(dāng)接種量在10%以上時，降解率反而呈現(xiàn)下降趨勢（圖2），菌株AM-2接種量為8%時除油效果最佳?？梢姡瑑蓚€菌株都不是菌體數(shù)目越多對降解越有利。雖然菌體的密度增加，但是在無機(jī)培養(yǎng)基中接入的有機(jī)質(zhì)也越大，能抑制菌體的除油酶的生成，因此除油率也有所下降。

圖1 菌株AM-1不同接種量對菌體生長和大豆油降解的影響

圖2 菌株AM-2不同接種量對菌體生長和大豆油降解的影響

2）不同油濃度對大豆油降解率的影響。大豆油在該實驗中作為碳源，油濃度不同即C：N比不同。菌株AM-1隨著含油量的增加，降解率呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，當(dāng)大豆油濃度在2 ml/L以下時菌液OD600隨著大豆油濃度的增加而增加，濃度超過2 ml/L時，OD600開始降低（圖3）；而菌株AM-2在0.5 ml/L、1.0 ml/L、1.5 ml/L、2.0 ml/L的油濃度的范圍內(nèi)，菌種濃度OD600值和除油率隨著油濃度的增加而增加，油濃度超過之后便呈下降的趨勢（圖4）。也就是兩種細(xì)菌在油濃度大于2.0 ml/L時生長都受到了抑制，說明高的油濃度對細(xì)菌的生長有毒害作用。

圖3 菌株AM-1不同投油量對菌體生長和大豆油降解率的影響

圖4 菌株AM-2不同投油量對菌體生長和大豆油降解率的影響

3）不同pH值對大豆油降解率的影響。如圖5，菌株AM-1對pH適應(yīng)性比較強(qiáng)，在初始pH值5.2-9.2范圍內(nèi)均能正常生長和降解大豆油，降解率都在80%以上，但初始pH值為9.2時對大豆油的降解率最高；菌株AM-2在pH值=5.2-7.2之間的除油率和菌體濃度隨著pH值的增加而增加，當(dāng)pH值高于7.2時，AM-2的除油率和菌體生長情況隨著pH值的增加而下降，因此pH=7.2為菌體生長的最佳pH值（圖6）。

圖5 菌株AM-1不同PH值對菌體生長和大豆油降解率的影響

圖6 菌株AM-2不同PH值對菌體生長和大豆油降解率的影響

4）不同溫度對大豆油降解率的影響。培養(yǎng)溫度不同，同一菌株對油的降解率明顯不同。如圖7，菌株AM-1在25℃時菌液的OD值和對大豆油的降解率都比較低，降解率僅為41.94%，隨著溫度的升高，細(xì)菌代謝旺盛，在37℃時除油率達(dá)到90.50%的最高值；如圖8，菌株AM-2在30℃時對大豆油的代謝作用最強(qiáng)，除油率達(dá)到80.1%的最高值。

圖7 菌株AM-1不同溫度對菌體生長和大豆油降解率的影響

圖8 菌株AM-2不同溫度對菌體生長和大豆油降解率的影響

5）不同搖床轉(zhuǎn)速（溶氧）對大豆油降解率的影響。對于菌株AM-1，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速n≤250rpm時，大豆油的降解率隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加而迅速增加，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm時的降解率最大，達(dá)到97.78%，而當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速增大到300rpm時，降解率反而降低（圖9）；當(dāng)轉(zhuǎn)速為200rpm時，菌株AM-2的除油率為最大值，菌體生長最旺盛，因為轉(zhuǎn)速越大溶解氧就越大，但是在250rpm和280rpm這兩個較高轉(zhuǎn)速的條件下，菌體受到的剪切力也很大，所以菌體的除油率和菌體濃度沒有隨著轉(zhuǎn)速的增加而增大，反而減?。▓D10）。

圖9 菌株AM-1不同搖床轉(zhuǎn)速對菌體生長和大豆油降解率的影響

圖10 菌株AM-2不同搖床轉(zhuǎn)速對菌體生長和大豆油降解率的影響

3 結(jié)論

通過優(yōu)化影響菌株降解大豆油的各種外界因素，分別得到菌株AM-1和AM-2最佳降解大豆油的條件和大豆油的平均降解率。地衣芽孢桿菌AM-1降解大豆油的最優(yōu)條件為：接種濃度為10%，2 ml/L的油濃度，初始pH值為9.2，溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm。在該條件下，大豆油的平均降解率可達(dá)96.09%；枯草芽孢桿菌AM-2的降解大豆油的最優(yōu)條件為：接種濃度為8%，2 ml/L的油濃度，初始pH值為7.2，溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。在該條件下，大豆油的平均降解率可達(dá)80.1%。微生物用來降解大豆油，治理環(huán)境污染有著美好的應(yīng)用前景。

同時實驗證明，在芽孢桿菌降解大豆油時，地衣芽孢桿菌的平均降解率明顯大于枯草芽孢桿菌的降解率，但是地衣芽孢桿菌的接種濃度，初始pH值，培養(yǎng)溫度和搖床轉(zhuǎn)速要求都比枯草芽孢桿菌的要求要高。這為以后進(jìn)行更深一層的實驗和往更佳的條件研究提供了數(shù)據(jù)支持。

參考文獻(xiàn)

[1]任玉森.含油廢水處理技術(shù)綜述[J].節(jié)能環(huán)保技術(shù)，2003（07）：22-27

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[4]王海峰，包木太，韓紅，等.一株枯草芽孢桿菌分離鑒定及其降解稠油特性[J].深圳大學(xué)學(xué)報理工版，2009，26（3）：221-226.

[5]劉婕，楊博.一株高效油脂降解菌的分離鑒定及其性能研究[J].中國油脂，2010，35（1）：41-44.endprint

1.3.3 不同pH值對大豆油降解率的影響

取6個250 ml的三角瓶，其中一個為空白加入50 ml的待測培養(yǎng)基，pH值調(diào)至7.2，其他5個為樣品均加入46 ml的待測培養(yǎng)基，pH值分別為5.2、6.2、7.2、8.2和9.2，加入0.5 ml 5g/L CaCl2儲備液，加入1.3.2中最佳除油效果的油濃度，其中空白不加種子培養(yǎng)液，樣品加入1.3.1的最佳除油效果接種量的種子培養(yǎng)液量。將培養(yǎng)瓶放入37℃ 200rpm的搖床中培養(yǎng)120 h（即5天）。

1.3.4 不同溫度對大豆油降解率的影響

取10個250 ml的三角瓶，其中5個空白加入50 ml的待測培養(yǎng)基，其他5個為樣品均加入46 ml的待測培養(yǎng)基，pH值調(diào)至1.3.3最佳除油效果的pH，加入0.5 ml 5g/L CaCl2儲備液，加入1.3.2最佳除油效果的油濃度，其中空白不加種子培養(yǎng)液，樣品加入1.3.1的最佳除油效果的接種量的種子培養(yǎng)液量。將培養(yǎng)瓶放入轉(zhuǎn)速為200rpm溫度分別為25℃、30℃、35℃、37℃和45℃的搖床中培養(yǎng)120 h（即5天），每一個溫度設(shè)一個樣品和空白。

1.3.5 不同搖床轉(zhuǎn)速（溶氧）對大豆油降解率的影響

取10個250 ml的三角瓶，其中5個空白加入50 ml的待測培養(yǎng)基，其他5個為樣品均加入46 ml的待測培養(yǎng)基，pH值調(diào)至1.3.3最佳除油效果的pH，加入0.5 ml 5 g/L CaCl2儲備液，加入1.3.2最佳除油效果的油濃度，其中空白不加種子培養(yǎng)液，樣品加入1.3.1最佳除油效果的接種量的種子培養(yǎng)液量。將培養(yǎng)瓶放入溫度為1.3.4除油效果最佳的溫度，轉(zhuǎn)速分別設(shè)為100rpm、150rpm、200rpm、250rpm和280rpm的搖床中培養(yǎng)120 h（即5天），每一個轉(zhuǎn)速設(shè)一個樣品和空白。

1.4 最優(yōu)條件下的除油效果驗證

在上述實驗得出的最優(yōu)條件下進(jìn)行平行實驗，設(shè)置20個培養(yǎng)瓶進(jìn)行平行實驗，培養(yǎng)120h（即5天），計算大豆油的降解率，求出平均降解率。

2 結(jié)果與討論

1）不同接種量對大豆油降解率的影響。菌株AM-1當(dāng)接種量在2%到10%之間時，除油率隨接種量的增加而升高，當(dāng)接種量在10%以上時，降解率反而呈現(xiàn)下降趨勢（圖1），菌株AM-1接種量為10%時除油效果最佳；而菌株AM-2當(dāng)接種量在2%到8%之間時，除油率隨接種量的增加而升高，當(dāng)接種量在10%以上時，降解率反而呈現(xiàn)下降趨勢（圖2），菌株AM-2接種量為8%時除油效果最佳。可見，兩個菌株都不是菌體數(shù)目越多對降解越有利。雖然菌體的密度增加，但是在無機(jī)培養(yǎng)基中接入的有機(jī)質(zhì)也越大，能抑制菌體的除油酶的生成，因此除油率也有所下降。

圖1 菌株AM-1不同接種量對菌體生長和大豆油降解的影響

圖2 菌株AM-2不同接種量對菌體生長和大豆油降解的影響

2）不同油濃度對大豆油降解率的影響。大豆油在該實驗中作為碳源，油濃度不同即C：N比不同。菌株AM-1隨著含油量的增加，降解率呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，當(dāng)大豆油濃度在2 ml/L以下時菌液OD600隨著大豆油濃度的增加而增加，濃度超過2 ml/L時，OD600開始降低（圖3）；而菌株AM-2在0.5 ml/L、1.0 ml/L、1.5 ml/L、2.0 ml/L的油濃度的范圍內(nèi)，菌種濃度OD600值和除油率隨著油濃度的增加而增加，油濃度超過之后便呈下降的趨勢（圖4）。也就是兩種細(xì)菌在油濃度大于2.0 ml/L時生長都受到了抑制，說明高的油濃度對細(xì)菌的生長有毒害作用。

圖3 菌株AM-1不同投油量對菌體生長和大豆油降解率的影響

圖4 菌株AM-2不同投油量對菌體生長和大豆油降解率的影響

3）不同pH值對大豆油降解率的影響。如圖5，菌株AM-1對pH適應(yīng)性比較強(qiáng)，在初始pH值5.2-9.2范圍內(nèi)均能正常生長和降解大豆油，降解率都在80%以上，但初始pH值為9.2時對大豆油的降解率最高；菌株AM-2在pH值=5.2-7.2之間的除油率和菌體濃度隨著pH值的增加而增加，當(dāng)pH值高于7.2時，AM-2的除油率和菌體生長情況隨著pH值的增加而下降，因此pH=7.2為菌體生長的最佳pH值（圖6）。

圖5 菌株AM-1不同PH值對菌體生長和大豆油降解率的影響

圖6 菌株AM-2不同PH值對菌體生長和大豆油降解率的影響

4）不同溫度對大豆油降解率的影響。培養(yǎng)溫度不同，同一菌株對油的降解率明顯不同。如圖7，菌株AM-1在25℃時菌液的OD值和對大豆油的降解率都比較低，降解率僅為41.94%，隨著溫度的升高，細(xì)菌代謝旺盛，在37℃時除油率達(dá)到90.50%的最高值；如圖8，菌株AM-2在30℃時對大豆油的代謝作用最強(qiáng)，除油率達(dá)到80.1%的最高值。

圖7 菌株AM-1不同溫度對菌體生長和大豆油降解率的影響

圖8 菌株AM-2不同溫度對菌體生長和大豆油降解率的影響

5）不同搖床轉(zhuǎn)速（溶氧）對大豆油降解率的影響。對于菌株AM-1，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速n≤250rpm時，大豆油的降解率隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加而迅速增加，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm時的降解率最大，達(dá)到97.78%，而當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速增大到300rpm時，降解率反而降低（圖9）；當(dāng)轉(zhuǎn)速為200rpm時，菌株AM-2的除油率為最大值，菌體生長最旺盛，因為轉(zhuǎn)速越大溶解氧就越大，但是在250rpm和280rpm這兩個較高轉(zhuǎn)速的條件下，菌體受到的剪切力也很大，所以菌體的除油率和菌體濃度沒有隨著轉(zhuǎn)速的增加而增大，反而減?。▓D10）。

圖9 菌株AM-1不同搖床轉(zhuǎn)速對菌體生長和大豆油降解率的影響

圖10 菌株AM-2不同搖床轉(zhuǎn)速對菌體生長和大豆油降解率的影響

3 結(jié)論

通過優(yōu)化影響菌株降解大豆油的各種外界因素，分別得到菌株AM-1和AM-2最佳降解大豆油的條件和大豆油的平均降解率。地衣芽孢桿菌AM-1降解大豆油的最優(yōu)條件為：接種濃度為10%，2 ml/L的油濃度，初始pH值為9.2，溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm。在該條件下，大豆油的平均降解率可達(dá)96.09%；枯草芽孢桿菌AM-2的降解大豆油的最優(yōu)條件為：接種濃度為8%，2 ml/L的油濃度，初始pH值為7.2，溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。在該條件下，大豆油的平均降解率可達(dá)80.1%。微生物用來降解大豆油，治理環(huán)境污染有著美好的應(yīng)用前景。

同時實驗證明，在芽孢桿菌降解大豆油時，地衣芽孢桿菌的平均降解率明顯大于枯草芽孢桿菌的降解率，但是地衣芽孢桿菌的接種濃度，初始pH值，培養(yǎng)溫度和搖床轉(zhuǎn)速要求都比枯草芽孢桿菌的要求要高。這為以后進(jìn)行更深一層的實驗和往更佳的條件研究提供了數(shù)據(jù)支持。

參考文獻(xiàn)

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[4]王海峰，包木太，韓紅，等.一株枯草芽孢桿菌分離鑒定及其降解稠油特性[J].深圳大學(xué)學(xué)報理工版，2009，26（3）：221-226.

[5]劉婕，楊博.一株高效油脂降解菌的分離鑒定及其性能研究[J].中國油脂，2010，35（1）：41-44.endprint

1.3.3 不同pH值對大豆油降解率的影響

取6個250 ml的三角瓶，其中一個為空白加入50 ml的待測培養(yǎng)基，pH值調(diào)至7.2，其他5個為樣品均加入46 ml的待測培養(yǎng)基，pH值分別為5.2、6.2、7.2、8.2和9.2，加入0.5 ml 5g/L CaCl2儲備液，加入1.3.2中最佳除油效果的油濃度，其中空白不加種子培養(yǎng)液，樣品加入1.3.1的最佳除油效果接種量的種子培養(yǎng)液量。將培養(yǎng)瓶放入37℃ 200rpm的搖床中培養(yǎng)120 h（即5天）。

1.3.4 不同溫度對大豆油降解率的影響

取10個250 ml的三角瓶，其中5個空白加入50 ml的待測培養(yǎng)基，其他5個為樣品均加入46 ml的待測培養(yǎng)基，pH值調(diào)至1.3.3最佳除油效果的pH，加入0.5 ml 5g/L CaCl2儲備液，加入1.3.2最佳除油效果的油濃度，其中空白不加種子培養(yǎng)液，樣品加入1.3.1的最佳除油效果的接種量的種子培養(yǎng)液量。將培養(yǎng)瓶放入轉(zhuǎn)速為200rpm溫度分別為25℃、30℃、35℃、37℃和45℃的搖床中培養(yǎng)120 h（即5天），每一個溫度設(shè)一個樣品和空白。

1.3.5 不同搖床轉(zhuǎn)速（溶氧）對大豆油降解率的影響

取10個250 ml的三角瓶，其中5個空白加入50 ml的待測培養(yǎng)基，其他5個為樣品均加入46 ml的待測培養(yǎng)基，pH值調(diào)至1.3.3最佳除油效果的pH，加入0.5 ml 5 g/L CaCl2儲備液，加入1.3.2最佳除油效果的油濃度，其中空白不加種子培養(yǎng)液，樣品加入1.3.1最佳除油效果的接種量的種子培養(yǎng)液量。將培養(yǎng)瓶放入溫度為1.3.4除油效果最佳的溫度，轉(zhuǎn)速分別設(shè)為100rpm、150rpm、200rpm、250rpm和280rpm的搖床中培養(yǎng)120 h（即5天），每一個轉(zhuǎn)速設(shè)一個樣品和空白。

1.4 最優(yōu)條件下的除油效果驗證

在上述實驗得出的最優(yōu)條件下進(jìn)行平行實驗，設(shè)置20個培養(yǎng)瓶進(jìn)行平行實驗，培養(yǎng)120h（即5天），計算大豆油的降解率，求出平均降解率。

2 結(jié)果與討論

1）不同接種量對大豆油降解率的影響。菌株AM-1當(dāng)接種量在2%到10%之間時，除油率隨接種量的增加而升高，當(dāng)接種量在10%以上時，降解率反而呈現(xiàn)下降趨勢（圖1），菌株AM-1接種量為10%時除油效果最佳；而菌株AM-2當(dāng)接種量在2%到8%之間時，除油率隨接種量的增加而升高，當(dāng)接種量在10%以上時，降解率反而呈現(xiàn)下降趨勢（圖2），菌株AM-2接種量為8%時除油效果最佳?？梢姡瑑蓚€菌株都不是菌體數(shù)目越多對降解越有利。雖然菌體的密度增加，但是在無機(jī)培養(yǎng)基中接入的有機(jī)質(zhì)也越大，能抑制菌體的除油酶的生成，因此除油率也有所下降。

圖1 菌株AM-1不同接種量對菌體生長和大豆油降解的影響

圖2 菌株AM-2不同接種量對菌體生長和大豆油降解的影響

2）不同油濃度對大豆油降解率的影響。大豆油在該實驗中作為碳源，油濃度不同即C：N比不同。菌株AM-1隨著含油量的增加，降解率呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，當(dāng)大豆油濃度在2 ml/L以下時菌液OD600隨著大豆油濃度的增加而增加，濃度超過2 ml/L時，OD600開始降低（圖3）；而菌株AM-2在0.5 ml/L、1.0 ml/L、1.5 ml/L、2.0 ml/L的油濃度的范圍內(nèi)，菌種濃度OD600值和除油率隨著油濃度的增加而增加，油濃度超過之后便呈下降的趨勢（圖4）。也就是兩種細(xì)菌在油濃度大于2.0 ml/L時生長都受到了抑制，說明高的油濃度對細(xì)菌的生長有毒害作用。

圖3 菌株AM-1不同投油量對菌體生長和大豆油降解率的影響

圖4 菌株AM-2不同投油量對菌體生長和大豆油降解率的影響

3）不同pH值對大豆油降解率的影響。如圖5，菌株AM-1對pH適應(yīng)性比較強(qiáng)，在初始pH值5.2-9.2范圍內(nèi)均能正常生長和降解大豆油，降解率都在80%以上，但初始pH值為9.2時對大豆油的降解率最高；菌株AM-2在pH值=5.2-7.2之間的除油率和菌體濃度隨著pH值的增加而增加，當(dāng)pH值高于7.2時，AM-2的除油率和菌體生長情況隨著pH值的增加而下降，因此pH=7.2為菌體生長的最佳pH值（圖6）。

圖5 菌株AM-1不同PH值對菌體生長和大豆油降解率的影響

圖6 菌株AM-2不同PH值對菌體生長和大豆油降解率的影響

4）不同溫度對大豆油降解率的影響。培養(yǎng)溫度不同，同一菌株對油的降解率明顯不同。如圖7，菌株AM-1在25℃時菌液的OD值和對大豆油的降解率都比較低，降解率僅為41.94%，隨著溫度的升高，細(xì)菌代謝旺盛，在37℃時除油率達(dá)到90.50%的最高值；如圖8，菌株AM-2在30℃時對大豆油的代謝作用最強(qiáng)，除油率達(dá)到80.1%的最高值。

圖7 菌株AM-1不同溫度對菌體生長和大豆油降解率的影響

圖8 菌株AM-2不同溫度對菌體生長和大豆油降解率的影響

5）不同搖床轉(zhuǎn)速（溶氧）對大豆油降解率的影響。對于菌株AM-1，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速n≤250rpm時，大豆油的降解率隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加而迅速增加，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm時的降解率最大，達(dá)到97.78%，而當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速增大到300rpm時，降解率反而降低（圖9）；當(dāng)轉(zhuǎn)速為200rpm時，菌株AM-2的除油率為最大值，菌體生長最旺盛，因為轉(zhuǎn)速越大溶解氧就越大，但是在250rpm和280rpm這兩個較高轉(zhuǎn)速的條件下，菌體受到的剪切力也很大，所以菌體的除油率和菌體濃度沒有隨著轉(zhuǎn)速的增加而增大，反而減小（圖10）。

圖9 菌株AM-1不同搖床轉(zhuǎn)速對菌體生長和大豆油降解率的影響

圖10 菌株AM-2不同搖床轉(zhuǎn)速對菌體生長和大豆油降解率的影響

3 結(jié)論

通過優(yōu)化影響菌株降解大豆油的各種外界因素，分別得到菌株AM-1和AM-2最佳降解大豆油的條件和大豆油的平均降解率。地衣芽孢桿菌AM-1降解大豆油的最優(yōu)條件為：接種濃度為10%，2 ml/L的油濃度，初始pH值為9.2，溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm。在該條件下，大豆油的平均降解率可達(dá)96.09%；枯草芽孢桿菌AM-2的降解大豆油的最優(yōu)條件為：接種濃度為8%，2 ml/L的油濃度，初始pH值為7.2，溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。在該條件下，大豆油的平均降解率可達(dá)80.1%。微生物用來降解大豆油，治理環(huán)境污染有著美好的應(yīng)用前景。

同時實驗證明，在芽孢桿菌降解大豆油時，地衣芽孢桿菌的平均降解率明顯大于枯草芽孢桿菌的降解率，但是地衣芽孢桿菌的接種濃度，初始pH值，培養(yǎng)溫度和搖床轉(zhuǎn)速要求都比枯草芽孢桿菌的要求要高。這為以后進(jìn)行更深一層的實驗和往更佳的條件研究提供了數(shù)據(jù)支持。

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