艾灸對大鼠皮膚創(chuàng)傷成纖維細胞和KGF表達的影響*

孫忠人，王 迪，尹洪娜，張秦宏，孫 琦，岳金換

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001)

艾灸是祖國醫(yī)學的傳統(tǒng)治療方法，具有溫經(jīng)通絡、消瘀散結、拔毒泄熱的作用［1］。現(xiàn)代研究證明，艾灸燃燒時釋放的紅外輻射可以為機體細胞的代謝活動、免疫功能提供所必需的能量，也能給缺乏能量的病態(tài)細胞提供活化能。還可促進炎癥、浮腫、滲出物、血腫等病理產(chǎn)物消散吸收［2］。因此艾灸可作為治療皮膚創(chuàng)傷的方法進行研究。本研究采用免疫組化法和HE染色法檢測皮膚創(chuàng)傷修復過程中角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor，KGF)表達及成纖維細胞數(shù)量變化，探究艾灸對皮膚創(chuàng)傷修復的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

無特定病原體(SPF級)SD大鼠24只，雌雄各半，體重250～300 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。蘇木素染色液、伊紅染色液(上海博谷生物科技有限公司);免疫組化試劑Rabbit Anti－KGF、即用型試劑盒SV0002、DAB顯色劑(武漢博士德生物工程有限公司);戊巴比妥麻醉劑(德國Merck公司);艾灸條(中國南陽醫(yī)樂嘉艾草生物制品有限公司);薇婷脫毛膏(中國利潔時家化有限公司);CX41奧林巴斯顯微鏡(日本奧林巴斯公司);TK－C9201EC型JVC攝像頭(日本JVC公司);RM2235型LEICA切片機(德國LEICA公司);KP－21C型PLACOM求積儀(日本PLACOM公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 將實驗動物隨機分為治療組和模型組。治療組又按治療時間分為3個時間點，分別為1天、3天、7天。每個時間點設置一個模型組。每組4只大鼠。

1.2.2 動物模型的建立 大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后，于造模前12 h禁食水。實驗動物以1%戊巴比妥作腹腔注射麻醉(0.35 ml/kg)，將其脊柱左側旁開1 cm，脊柱右側旁開3 cm，上至肩胛下緣，下達髂骨上緣的背部毛發(fā)剔除。用脫毛膏進行脫毛處理，生理鹽水清洗拭干，使其背部皮膚顯露。在脊柱右側1 cm處行一與脊柱平行的縱行切口，長1 cm，深達皮膚全層，制造皮膚創(chuàng)傷模型［3］。術后碘伏消毒，皮膚創(chuàng)面自然止血，不給予包扎。

1.2.3 治療方法 治療組大鼠給予艾灸治療。將點燃的艾條置于艾灸盒中，架于大鼠皮膚創(chuàng)面上方進行治療。其間應適當調整艾條高度，使艾條與創(chuàng)面的距離始終保持3～4 cm，每次治療30 min，按照分組給予不同天數(shù)治療。模型組除不點燃艾條，其余與治療組相同。

1.3 測定指標

1.3.1 創(chuàng)面面積測定 7天組在治療第2、4、8天時用醋酸紙覆蓋于創(chuàng)面，并沿創(chuàng)面邊緣劃線。采用求積儀測繪創(chuàng)面面積。愈合指數(shù)=(1－現(xiàn)切口面積/原切口面積)×100%［4］。

1.3.2 組織形態(tài)學觀察 治療完成后，各組分別將大鼠以1%戊巴比妥作腹腔注射麻醉取創(chuàng)面皮膚組織，組織標號后浸入10%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋切片進行HE染色。在40×10倍光鏡下，每張切片采集10個視野的圖像，計算單位面積內(nèi)所含成纖維細胞數(shù)。

1.3.3 觀察角質細胞生長因子(KGF)將包埋后的石切片，然后進行脫水、過氧化氫阻斷處理、BSA封閉、Rabbit Anti－KGF處理、抗體孵育、聚合HRP標記抗兔IgG結合、DAB顯色等免疫組化過程。在40×10倍光鏡下，觀察1天、3天、7天組創(chuàng)面修復組織中KGF的表達。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 創(chuàng)面愈合的基本病理變化

實驗第2天，大部分皮膚創(chuàng)面干燥結痂，無滲出物，模型組中有少部分創(chuàng)面濕潤，有少許滲出物。創(chuàng)面邊緣出現(xiàn)紅暈及皺褶。1天皮膚創(chuàng)面組織鏡下可以見:創(chuàng)面邊緣肉芽向傷口長入。肉芽組織成分以炎性細胞為主。第4天所有創(chuàng)面均干燥，可見肉芽組織明顯增生。3天模型組肉芽組織顏色為深紅色，創(chuàng)面邊緣皺褶增多、變硬;治療組肉芽組織顏色為暗紅色，局部長出薄皮，創(chuàng)面邊緣皮膚皺褶增多、收縮明顯。3天皮膚創(chuàng)面組織鏡下可見:模型組肉芽組織中仍以炎性細胞為主，創(chuàng)面底部可見成纖維細胞增生;治療組創(chuàng)面切口兩側距離減小，成纖維細胞排列緊密。第8天7天模型組創(chuàng)面明顯縮小，基本為肉芽組織所填充，但未見完全愈合;治療組創(chuàng)面已基本愈合，僅剩不明顯線性痕跡。7天皮膚創(chuàng)面組織鏡下可見:模型組肉芽組織生長旺盛，成纖維細胞增多，炎性細胞減少;治療組肉芽組織可見大量成纖維細胞以及纖維細胞。

2.2 皮膚創(chuàng)面愈合指數(shù)

圖1 皮膚創(chuàng)面愈合指數(shù)

由圖1可見，造模后第4天創(chuàng)面愈合指數(shù)統(tǒng)計結果顯示:大鼠皮膚創(chuàng)面愈合指數(shù)(%)治療組(39.6±4.80)與模型組(30.5 ±5.41)相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。造模后第8天創(chuàng)面愈合指數(shù)統(tǒng)計結果顯示:大鼠皮膚創(chuàng)面愈合指數(shù)(%)治療組(100.0±0.00)與模型組(63.5±5.21)相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。說明艾灸治療組創(chuàng)面愈合程度優(yōu)于模型組。

2.3 皮膚創(chuàng)面中成纖維細胞數(shù)量

見表1、圖2。光鏡下觀察，3天治療組成纖維細胞數(shù)量與模型組相比無顯著差異(P＞0.05)。7天治療組成纖維細胞數(shù)量較模型組明顯增多，差異顯著(P ＜0.05)。

表1 皮膚創(chuàng)面中成纖維細胞數(shù)量的比較(±s，單位:個/mm2)

表1 皮膚創(chuàng)面中成纖維細胞數(shù)量的比較(±s，單位:個/mm2)

注:與治療組相比，aP ＞0.05，bP ＜0.05。

組別 n 3天 7天4 15.5 ±2.08 26.5 ±1.29模型組 4 12.5 ±1.91a 23.8 ±1.70治療組b

圖2 7天大鼠皮膚創(chuàng)面組織成纖維細胞HE染色，40×10

2.4 角質細胞生長因子KGF表達

由圖3可見，光鏡下觀察:模型組:1天未見KGF表達;3天皮膚創(chuàng)面KGF表達呈弱陽性;7天皮膚創(chuàng)面KGF表達呈陽性。治療組:1天未見KGF表達;3天皮膚創(chuàng)面KGF表達呈陽性;7天皮膚創(chuàng)面KGF表達呈強陽性。

3 討論

圖3 7天大鼠皮膚創(chuàng)面組織KGF陽性表達免疫組化，40×10

近年來，伴隨細胞和分子生物學的發(fā)展，對于創(chuàng)傷修復的研究已經(jīng)由傷后形態(tài)學向分子機制方向發(fā)展。許多研究者開展了各種細胞及生長因子對創(chuàng)傷修復影響的研究。研究指出，在創(chuàng)傷發(fā)生的最初兩天，最先進入創(chuàng)面的是中性粒細胞，創(chuàng)傷發(fā)生2～3天后，成纖維細胞順著濃度梯度從周圍組織中遷移到創(chuàng)傷部位，影響著創(chuàng)傷愈合過程［5］。KGF在真皮細胞中，具有強烈的致分裂原活性，在全層皮膚的損傷中，激發(fā)肉芽組織的形成，激發(fā)表皮生長［6］。外源性KGF能促進皮膚創(chuàng)面上皮細胞增殖，加速創(chuàng)面的愈合，明顯縮短創(chuàng)傷修復時間［7］。因此，成纖維細胞和角質細胞生長因子(KGF)均參與并影響創(chuàng)傷修復的過程。本研究中HE染色顯示7天治療組皮膚創(chuàng)面中成纖維細胞數(shù)量較模型組明顯增多，與模型組相較差異有顯著意義(P＜0.05)，說明艾灸加速了成纖維細胞的增值，從而促進皮膚創(chuàng)面的愈合。通過觀察KGF表達發(fā)現(xiàn)，治療組KGF表達相比模型組較為明顯，說明艾灸可以使KGF的表達增強，從而影響表皮細胞的增值，促進創(chuàng)面的愈合。從皮膚創(chuàng)面愈合指數(shù)方面比較，治療組創(chuàng)面愈合程度也優(yōu)于模型組。說明艾灸可以促進皮膚創(chuàng)面的愈合。

4 結論

艾灸作為祖國醫(yī)學傳統(tǒng)的治療方法，具有安全、簡便、無副作用的特點，所以艾灸可能會成為將來治療皮膚創(chuàng)傷的有效手段。雖然本研究作為動物實驗，未能證實艾灸治療人類皮膚創(chuàng)傷仍具有一定療效，但卻為將來將艾灸治療皮膚創(chuàng)傷修復應用于臨床提供了動物實驗基礎和依據(jù)，為治療皮膚創(chuàng)傷修復提供了一個新的思路。

［1］石學敏.針灸學［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2007:152－153

［2］梁玉磊.溫和灸對大鼠難愈行創(chuàng)面組織修復干預作用的研究［D］.石家莊:河北醫(yī)科大學，2012:17－18

［3］付小兵，孫同柱，盛志勇.幾種用于創(chuàng)傷修復研究的動物模型［J］.中華實驗外科雜志，1999，16(5):479

［4］阿布力孜·吾斯曼，蘭國成，于元松，等.成纖維細胞生長因子(FGFs)對小鼠實驗性創(chuàng)傷愈合的作用［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，1998(12):1

［5］劉曉，王建，盧光琇.細胞生長因子與創(chuàng)傷愈合［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2008，8(9):1753

［6］袁瑞紅，汪淼.瘢痕形成中細胞因子的研究進展［J］.昆明醫(yī)學院學報，2003，24(4):32

［7］邢爽，黃海瀟，羅慶良.角質細胞生長因子對上皮細胞損傷的防護作用［J］.國外醫(yī)學·藥學分冊，2006，33(2):97